微波輔助提取冠突散囊菌黃色素工藝研究

呂嘉櫪， 李文娟

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院, 陜西 西安　710021)

?

微波輔助提取冠突散囊菌黃色素工藝研究

呂嘉櫪， 李文娟

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院, 陜西 西安710021)

摘要：基于Box-Behnken響應(yīng)面試驗設(shè)計確定了冠突散囊菌液體發(fā)酵菌絲體黃色素的最佳提取條件.采用單因素法確定影響冠突散囊菌黃色素得率的主要因素，即料液比、提取溫度和微波功率，進(jìn)一步利用Box-Behnken模型對其進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化.結(jié)果表明：影響黃色素提取效果的最主要因素是料液比和提取溫度，其次是微波功率.確定最佳提取工藝為料液比1∶38(w/v)，提取溫度56 ℃，微波功率457 W.該條件下黃色素得率10.08%.實測結(jié)果與響應(yīng)面擬合所得方程的預(yù)測值符合良好，采用響應(yīng)面法對微波輔助提取冠突散囊菌黃色素的提取條件優(yōu)化合理.

關(guān)鍵詞：冠突散囊菌； 液體發(fā)酵； 黃色素； 微波輔助提取

0引言

天然色素對人體無毒無害、安全性高，同時兼具一定的營養(yǎng)價值或藥理作用，食品、化妝品和醫(yī)藥行業(yè)對天然色素的需求量在逐年增加，因此研究和開發(fā)無毒無害的天然色素是現(xiàn)在和未來食品色素發(fā)展的主要方向[1].

冠突散囊菌(Eurotiumcristatum)[2-6]是茯磚茶經(jīng)“發(fā)花”工序自然形成的一種益生菌，也是“發(fā)花”過程中的優(yōu)勢菌群.在特定的條件下，冠突散囊菌可以在茯磚茶中形成黃色閉囊殼并均勻的附著在茯磚茶中，俗稱“金花”，因此又被稱為“金花菌”.邊疆少數(shù)民族一般以冠突散囊菌的數(shù)量來評價茯磚茶品質(zhì)的優(yōu)劣.冠突散囊菌賦予了茯磚茶特有的色、香、味，并且具有促消化、降脂減肥、調(diào)節(jié)糖代謝和抑制腫瘤細(xì)胞、治療心血管疾病[7-9]等保健功效，其作用機(jī)理還沒有被深入的研究.

金黃色的閉囊殼中含有大量黃色物質(zhì)，宋魯彬[9]發(fā)現(xiàn)茯磚茶石油醚洗脫組分中含有大量的色素物質(zhì)；李玉婷[10]對金花菌黃色素的理化性質(zhì)進(jìn)行了研究；韓蓉、呂嘉櫪等[11]利用超聲波對茯磚茶冠突散囊菌色素進(jìn)行了提取，得到了色素精制品,并對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了初步分析.

冠突散囊菌黃色素作為一種微生物天然色素，不僅是單純的著色劑，而且可能還是食品的營養(yǎng)強(qiáng)化劑，是提高食品營養(yǎng)與保健作用的理想添加劑，如果能夠大量生產(chǎn)和開發(fā)，將會產(chǎn)生巨大的社會效益和經(jīng)濟(jì)效益.

微波輔助提取法是利用微波能提高得率的一種新技術(shù)，具有微波功率小、輻射時間短，萃取效率高、能耗低、節(jié)省試劑等特點[12]，已應(yīng)用于多種色素的提取[13-16].目前冠突散囊菌黃色素多采用超聲波輔助提取法，本試驗借助微波輔助對冠突散囊菌黃色素進(jìn)行提取，并利用響應(yīng)面法對提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，這為冠突散囊菌黃色素的進(jìn)一步開發(fā)利用提供技術(shù)支持，具有廣闊的市場前景.

1材料與方法

1.1　菌種

冠突散囊菌由陜西科技大學(xué)微生物研究室從蒼山茶葉有限責(zé)任公司所產(chǎn)茯磚茶中分離純化得到.

1.2　培養(yǎng)基

液體PDA(20%土豆浸汁、2%蔗糖、0.3% NH4NO3、KH2PO40.1%),121 ℃滅菌20 min.

1.3　主要儀器設(shè)備

HZQ-F160振蕩培養(yǎng)箱(哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司)，HC-3018R高速冷凍離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)，水浴鍋(北京科偉永興儀器有限公司)，UV2600紫外-可見分光光度計(尤尼柯上海儀器有限公司),101-1型電熱鼓風(fēng)干燥箱(北京科偉永興儀器有限公司)，WD900(MG-5562S)型LG微波爐(北京科偉永興儀器有限公司).

1.4　實驗方法

1.4.1冠突散囊菌菌絲體的制備

將斜面保存的菌種進(jìn)行活化，接入500 mL的三角錐形瓶中(25%裝液量)，放置于28 ℃、120 r/min的恒溫?fù)u床上培養(yǎng)至發(fā)酵液顏色從澄清透明變?yōu)榱咙S色為止，用定量濾紙過濾得到菌絲體，用蒸餾水洗滌3次，吸干其表面的水分.置于30 ℃干燥箱中烘干，研缽研磨后得到菌絲體粉末備用.

1.4.2工藝流程

菌絲體→ 粉粹→ 過篩→ 菌絲體粉末→ 水浴浸提→ 微波輻射→ 過濾分離濃縮→ 自然揮發(fā)干燥→ 色素產(chǎn)品.

1.5　黃色素得率的測定

以黃色素得率為試驗指標(biāo)，計算公式如下：

式中，m1表示菌絲體粉末干重，m2表示提取黃色素的重量.

1.6　試驗設(shè)計

選擇不同種類的有機(jī)溶劑、料液比、提取時間、提取溫度、提取次數(shù)、微波功率、微波作用時間進(jìn)行單因素試驗，并分析各個因素對冠突散囊菌黃色素得率的影響.在此基礎(chǔ)上，選擇其中對黃色素得率影響顯著的因素，進(jìn)行響應(yīng)曲面優(yōu)化，確定最佳的提取工藝條件.

1.6.1提取溶劑對黃色素得率的影響

準(zhǔn)確稱取適量冠突散囊菌菌絲體粉末，控制體系料液比1∶20(g/mL)、提取時間30 min、微波功率360 W、微波作用時間2 min，利用石油醚、甲醇、乙醇、環(huán)己烷、乙酸乙酯、丙酮對黃色素進(jìn)行提取.觀察不同色素提取液顏色并計算色素得率，分析不同有機(jī)溶劑對色素得率的影響.

1.6.2提取溫度對黃色素得率的影響

準(zhǔn)確稱取適量冠突散囊菌菌絲體粉末，以石油醚為提取劑，控制體系料液比1∶20(g/mL)、提取時間30 min、微波功率360 W、微波作用時間2 min，設(shè)置不同提取溫度30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃.計算黃色素得率，分析不同提取溫度對黃色素得率的影響.

1.6.3料液比對黃色素得率的影響

準(zhǔn)確稱取適量冠突散囊菌菌絲體粉末，以石油醚為提取劑，控制體系提取溫度50 ℃、提取時間30 min、微波功率360 W、微波作用時間2 min，設(shè)置不同料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50(g/mL).計算黃色素得率，分析不同料液比對黃色素得率的影響.

1.6.4提取時間對黃色素得率的影響

準(zhǔn)確稱取適量冠突散囊菌菌絲體粉末，以石油醚為提取劑，控制體系提取溫度50 ℃、料液比1∶30(g/mL)、微波功率360 W、微波作用時間2 min，設(shè)置不同提取時間20 min、30 min、40 min、50 min、60 min.計算黃色素得率，分析不同提取時間對黃色素得率的影響.

準(zhǔn)確稱取適量冠突散囊菌菌絲體粉末，以石油醚為提取劑，控制體系提取溫度50 ℃、料液比1∶30(g/mL)、提取時間40 min、微波作用時間2 min，設(shè)置不同微波功率180 W、360 W、540 W、720 W、900 W.計算黃色素得率，分析不同微波功率對黃色素得率的影響.

1.6.6微波作用時間對黃色素得率的影響

準(zhǔn)確稱取適量冠突散囊菌菌絲體粉末，以石油醚為提取劑，控制體系提取溫度50 ℃、料液比1∶30(g/mL)、提取時間40 min、微波功率360 W，設(shè)置不同微波作用時間1 min、2 min、3 min、4 min、5 min.計算黃色素得率，分析不同微波作用時間對黃色素得率的影響.

1.6.7提取次數(shù)對黃色素得率的影響

準(zhǔn)確稱取適量冠突散囊菌菌絲體粉末，以石油醚為提取劑，控制體系提取溫度50 ℃、料液比1∶30(g/mL)、提取時間40 min、微波功率360 W、微波作用時間2 min，設(shè)置不同提取次數(shù)1次、2次、3次、4次、5次.計算黃色素得率，分析不同提取次數(shù)對黃色素得率的影響.

1.6.8響應(yīng)面法對黃色素提取試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗，選擇對黃色素得率影響最為顯著的3個因素，進(jìn)行響應(yīng)曲面優(yōu)化，以確定最佳的黃色素提取工藝條件.

表1　Box-benhnken試驗設(shè)計因素與水平

2結(jié)果與討論

2.1　微波輔助提取單因素試驗結(jié)果與分析

2.1.1提取溶劑對黃色素得率的影響

本研究主要采用隨機(jī)抽樣的方法，選取寧夏回族自治區(qū)N縣鄉(xiāng)村初中作為研究場域，共抽取210位教師作為研究對象。調(diào)查共發(fā)放210份問卷，最后統(tǒng)計回收問卷180份，回收率為85.7%，其中有效問卷155份，有效率為86.1%，符合統(tǒng)計處理的有效性原則。

由圖1可知,采用6種不同有機(jī)溶劑對等量冠突散囊菌菌絲體粉末中黃色素進(jìn)行提取，甲醇得率最高，達(dá)到26.02%，乙醇14.24%，乙酸乙酯10.56%，石油醚、環(huán)己烷和丙酮得率相差不大，分別為7.06%、7.20%和8.35%.通過觀察各種有機(jī)溶劑黃色素提取液的顏色可以看出，甲醇和乙醇提取液為深紅色，丙酮和乙酸乙酯提取液為淺紅色，石油醚和環(huán)己烷提取液為亮黃色.根據(jù)冠突散囊菌特性，甲醇、乙醇、丙酮和乙酸乙酯不適宜作為黃色素的提取溶劑；石油醚和環(huán)己烷提取液雖均為黃色，但是環(huán)己烷提取液偏紅，黃色素得率也差別不明顯，故石油醚為冠突散囊菌黃色素較佳提取溶劑.

圖1　不同有機(jī)溶劑對黃色素得率的影響

2.1.2提取溫度對黃色素得率的影響

由圖2可知,不同的提取溫度對冠突散囊菌黃色素得率有不同的影響.隨著溫度的增加.黃色素得率也在依次增加.提取溫度為30 ℃時，黃色素得率為6.97%；提取溫度為40 ℃時，黃色素得率為7.34%；提取溫度為50 ℃時，黃色素得率為7.98%；超過50 ℃后，黃色素得率增長幅度不大，而且提取溫度過高，不僅會增加能量消耗并造成部分溶劑蒸發(fā)損失，同時黃色素的穩(wěn)定性會下降，甚至引起色素的降解.故50℃為較佳提取溫度.

圖2　提取溫度對黃色素得率的影響

2.1.3料液比對黃色素得率的影響

由圖3可知,隨著料液比的增加，得率逐漸增大，料液比為1∶10時，黃色素得率為7.03%；料液比為1∶20時，黃色素得率為7.53%；料液比為1∶30時，黃色素得率為8.12%；當(dāng)料液比繼續(xù)增加直至1∶50時，黃色素得率為8.5%，增加不顯著.而高料液比會造成溶劑和能量的浪費，故1∶30為較佳料液比.

圖3　料液比對黃色素得率的影響

2.1.4提取時間對黃色素得率的影響

由圖4可知，隨著提取時間的增加，黃色素得率先增大后保持恒定，提取時間為20 min時，黃色素得率為7.69%；提取時間為40 min時，黃色素得率達(dá)到8.30%.延長提取時間，冠突散囊菌可以與溶劑充分作用，故黃色素的提取量增加，繼續(xù)延長時間，黃色素得率增加不顯著.而過長的提取時間不僅會導(dǎo)致黃色素分解，同時考慮到經(jīng)濟(jì)因素和不影響整個工藝流程的效率，提取時間為40 min.

2.1.5微波功率對黃色素得率的影響

由圖5可知，采用微波輔助提取的效果明顯比對照組(功率為0 W)好，0 W時黃色素得率為7.78%，180 W時黃色素得率為7.78%，360 W時黃色素得率為7.94%，540 W時黃色素得率為8.56%.微波輻射功率對提取黃色素效果顯著：在0～540 W之間增加微波功率，黃色素得率也隨之增大；超過540 W后，增加功率，黃色素得率變化不顯著；當(dāng)功率為900 W時黃色素得率增加，分析可能是因輻射功率越高，物系吸收微波能越多，有利于有效成分溶出，但是火力過大，其強(qiáng)熱效應(yīng)可能對有效成分產(chǎn)生破壞作用，故選擇360 W為較佳提取功率.

2.1.6微波作用時間對黃色素得率的影響

由圖6可知，隨著微波時間的延長，黃色素的得率先增大后減小，最后趨于平緩.微波作用1 min時，黃色素得率為8.12%；微波作用時間為3 min時，黃色素得率為8.40%；超過3 min后得率不再增長.延長微波時間有利于冠突散囊菌黃色素的浸出，黃色素基本溶解完全，繼續(xù)延長微波時間提取液顏色會出現(xiàn)淺紅色，說明微波作用時間過長，會對黃色素的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生不良的影響，故選擇微波作用時間為2 min.

圖4　提取時間對黃色素得率的影響

圖5　微波功率對黃色素得率的影響

圖6　微波作用時間對黃色素得率的影響

2.1.7提取次數(shù)對黃色素得率的影響

由圖7可知，提取次數(shù)對黃色素的得率有一定的影響.提取1次，黃色素得率為7.86%；提取第2次，黃色素得率達(dá)到8.43%；提取次數(shù)超過2次后，黃色素提取液顏色變淺，黃色素得率變化幅度減小.故提取2次后，黃色素基本上提取完全，繼續(xù)提取，會造成溶劑的大量浪費，而且對黃色素得率貢獻(xiàn)不大，選擇提取2次比較經(jīng)濟(jì)環(huán)保，同時也最大化的利用了冠突散囊菌菌絲體.

圖7　提取次數(shù)對黃色素得率的影響

2.2　響應(yīng)面法優(yōu)化冠突散囊菌黃色素提取工藝

2.2.1響應(yīng)面優(yōu)化

采用Design-Expert 8.05中的Box-Benhnken試驗設(shè)計原理，以黃色素得率為響應(yīng)值.響應(yīng)面分析方案與結(jié)果如表2所示.

表2　微波輔助提取黃色素實驗方案與結(jié)果

2.2.2模型的建立及顯著性檢驗

響應(yīng)面二次回歸方程方差分析見表3.由表3可以看出在所選的各因素水平范圍內(nèi)，對黃色素得率影響較大的為料液比、提取溫度，其次為微波功率.其中，料液比、提取溫度的一次項，料液比、提取溫度、微波功率的二次項對響應(yīng)值的影響極顯著；微波功率的一次項對響應(yīng)值的影響顯著；料液比和提取溫度的交互項，提取溫度和微波功率的交互項對響應(yīng)值的影響極顯著；料液比和微波功率的交互項對響應(yīng)值的影響顯著.利用Design-Expert 8.05軟件對表中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到黃色素的得率(Y)對料液比(A)、提取溫度(B)、微波功率(C)的二次多項回歸模型：Y=9.79+0.47A+0.30B+0.12C+0.39AB+0.16AC+0.33BC―0.33A2―0.55B2―0.74C2，該方程的相關(guān)系數(shù)R2=0.992 5.由表3可知，整體模型達(dá)極顯著水平(P<0.01)表明該二次方程模型比較顯著，失擬項不顯著(P=0.965 4).該方程對試驗擬合較好，可以對試驗范圍內(nèi)不同條件下的得率進(jìn)行預(yù)測.另外，該模型的變異系數(shù)(c.v.)為1.05%.變異系數(shù)是衡量每個平均值偏離情況的參數(shù)，其值越小，重復(fù)性越好.分析得到的微波輔助提取冠突散囊菌黃色素工藝條件的最佳值為：料液比(g/mL)為1∶38，提取溫度為56 ℃,微波功率為457 W，模型預(yù)測結(jié)果為10.12%.

表3　響應(yīng)面二次回歸方程方差分析

注：P值在5%水平以下表示顯著，1%水平以下表示極顯著.

2.2.3提取工藝的響應(yīng)面分析與優(yōu)化

用Design-Expert 8.05軟件，根據(jù)回歸方程分析作響應(yīng)面圖，如圖8~圖10所示.

依據(jù)各因素A、B和C對響應(yīng)值Y所構(gòu)成的三維空間的曲面圖，可反映各因素對其響應(yīng)值的影響.響應(yīng)面可較為直觀的看出各因素對黃色素得率的影響，曲面越陡峭，表明該因素對黃色素得率的影響越大，響應(yīng)值的變化越大.

由圖8、9和圖10可知，料液比和提取溫度的曲面陡峭，對響應(yīng)值(黃色素得率)的交互作用明顯；料液比和微波功率的響應(yīng)曲面的坡度較陡峭，表明響應(yīng)值(黃色素得率)對料液比和微波功率的交互作用也明顯；提取溫度和微波功率的響應(yīng)面的坡度同樣陡峭，說明響應(yīng)值(黃色素得率)對提取溫度和微波功率的變化敏感.這些結(jié)果都與回歸方程的方差分析相吻合，表明響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計能夠較好的反映出試驗所設(shè)定的三個因素對黃色素得率的影響，對各因素的考察較為全面、系統(tǒng)，試驗結(jié)果具有一定的應(yīng)用價值.

圖8　料液比和提取溫度對黃色素得率的影響

圖9　料液比和微波功率對黃色素得率的影響

圖10　提取溫度和微波功率對黃色素得率的影響

2.2.4最佳工藝條件的確定及驗證試驗

結(jié)合二次回歸的數(shù)學(xué)模型分析結(jié)果，最優(yōu)條件為料液比(g/mL)為1∶37.6，提取溫度為55.9 ℃，微波功率為457.2 W .將單因素試驗所得最佳條件和響應(yīng)面二次回歸所得最佳條件進(jìn)行試驗，每個進(jìn)行三次平行試驗，結(jié)果如表4所示.

表4　驗證試驗結(jié)果

根據(jù)實驗具體情況，結(jié)合實際操作的可行性，將最佳工藝確定為料液比(g/mL)1∶38，提取溫度56 ℃，微波功率457 W，說明此模型可靠，結(jié)果具有一定的應(yīng)用價值.

3結(jié)論

通過單因素實驗并結(jié)合Box-Behnken設(shè)計響應(yīng)曲面分析研究了冠突散囊菌菌絲體黃色素的工藝條件.利用Design-Expert 8.05軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到了得率的回歸方程Y=9.79+0.47A+0.30B+0.12C+0.39AB+0.16AC+0.33BC―0.33A2―0.55B2―0.74C2，優(yōu)化得到的提取方案為：料液比(g/mL)為1∶38，提取溫度為56 ℃,微波功率為457 W，模型預(yù)測結(jié)果為10.12%.在該工藝條件下進(jìn)行驗證試驗，得率達(dá)到10.08%.

微波輔助提取冠突散囊菌黃色素縮短了提取時間，得率較高，試驗結(jié)果有應(yīng)用價值；響應(yīng)面優(yōu)化微波輔助提取工藝，對各因素的考察較為全面、系統(tǒng)，試驗結(jié)果具有一定的應(yīng)用價值；后期應(yīng)對冠突散囊菌黃色素的純化工藝進(jìn)行深入研究，使試驗結(jié)果更具有實際應(yīng)用價值.

參考文獻(xiàn)

[1] 云智勉，杜友珍，佘瓊紅,等．天然多功能食用色素的研究進(jìn)展[J]．廣東微量元素科學(xué)，2006，13(2)：12-16．

[2] 齊祖同，孫曾美．茯磚茶中優(yōu)勢菌種的鑒定[J]．真菌學(xué)報，1990,9(3):176-179．

[3] Xu A Q，Wang Y L，Wen J Y，et al．Fungal community associated with fermentation and storage of Fuzhuan brick-tea[J].International Journal of Food Microbiology，2011，146(1):14-22.

[4] 溫瓊英.茯磚茶中主要微生物的研究[J].茶葉通訊，1986,51(4)：19-21.

[5] 丁婷，呂嘉櫪.陜西茯磚茶中“金花”菌的生物學(xué)特性分析[J].食品工業(yè)，2012,34(1):104-106.

[6] 王志剛，童哲，程蘇云.茯磚茶中霉菌含量和散囊菌鑒定及利弊分析[J].食品科學(xué)，1992,57(5)：6-8.

[7] 余志勇.茯磚茶抗腹瀉作用研究[D].長沙:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

[8] 熊昌云,屠幼英,歐陽梅,等.人工接種發(fā)酵茯磚茶降脂減肥作用研究[J].菌物學(xué)報，2011,30(2)：349-354.

[9] 宋魯彬.中國黑茶藥理功能評價及活性物質(zhì)研究[D].長沙:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

[10] 李玉婷，呂嘉櫪.金花菌黃色素的穩(wěn)定性及其抗氧化活性研究[J].微生物學(xué)通報,2013,40(11):2 030-2 036.

[11] 韓蓉，呂嘉櫪.超聲波作用對茯磚茶金花菌色素得率的影響[J].食品科學(xué)，2014,39(1)：240-243.

[12] 張成，賈紹義.微波萃取技術(shù)及應(yīng)用[J].化學(xué)工業(yè)與工程，2004,21(6)：57-60．

[13] 溫志英，張朝．響應(yīng)面優(yōu)化柑橘皮黃色素微波輔助提取工藝[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2011,27(4)：350-355．

[14] 陳偉娜，吉東，王強(qiáng),等．響應(yīng)面優(yōu)化微波輔助提取仙人掌果色素[J].食品工業(yè)，2014,35(3)：63-66．

[15] 梁新麗，王春柳,王光發(fā)，等.響應(yīng)曲面法優(yōu)化微波輔助提取淫羊藿中淫羊藿苷工藝[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2012,18(1)：11-15．

[16] 鄧斌，王存娥，徐安武．微波輔助提取花生殼黃酮類化合物及其抗氧化性研究[J].中國油脂，2009,34(3)：54-57．

Study on microwave-assisted extraction technology

of pigments fromEurotiumcristatum

LV Jia-li， LI Wen-juan

(School of Food and Biological Engineering, Shaanxi University of Science & Technology, Xi′an 710021, China)

Abstract:The conditions for the aqueous extraction of pigments fromEurotiumcristatumwere optimized with Box-Behnken design under response surface methodology.The major extraction factors of pigments fromEurotiumcristatumwere obtained by single factor experiments.And they were solvent-solid ratio,extraction temperature,microwave power on yield of extracted for pigments from by Box-Behnken design.The optimal conditions of microwave-assisted extraction for pigments were:solvent-solid ratio 1∶38(w/v),extraction temperature 56 ℃,microwave power 457 W.Under these conditions,average yield of pigments was 10.08%.And the measured value was consistent with the predicated value, which indicated the applicability of RSM to the optimization of extraction of pigments fromEurotiumcristatum.

Key words:Eurotiumcristatum; liquid fermentation; pigments; microwave-assisted extraction

作者簡介:呂嘉櫪(1964-)，女，陜西三原人，教授，研究方向：應(yīng)用微生物學(xué)

基金項目：陜西省教育廳專項科研計劃項目(2010JK446)； 咸陽市科技計劃項目 (2013K06-09)

*收稿日期:2015-09-13

中圖分類號：TS201.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

*文章編號：1000-5811(2015)06-0121-06