自噬與慢性肝炎病毒感染

劉 青綜述，傅 念審校

（南華大學附屬南華醫(yī)院消化內(nèi)科，湖南衡陽421002）

自噬與慢性肝炎病毒感染

劉 青綜述，傅 念審校

（南華大學附屬南華醫(yī)院消化內(nèi)科，湖南衡陽421002）

自噬； 肝炎，乙型，慢性； 肝炎病毒； 感染； 綜述

自噬即“自我消化”，是將細胞內(nèi)大分子物質(zhì)及亞細胞器通過溶酶體途徑進行降解以便循環(huán)利用，實現(xiàn)物質(zhì)及細胞器更新的分解代謝過程。慢性肝炎病毒感染是導致肝硬化及肝癌最主要的病因，且目前暫無有效藥物能完全清除病毒。近年研究表明，自噬在慢性肝炎病毒感染中扮演著重要角色，本文就自噬與乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）、丙型肝炎病毒感染的發(fā)生機制進行綜述，以期為抗病毒治療提供新途徑。

1 細胞自噬

1.1 自噬的概述及分類 自噬是指在細胞受外界環(huán)境干擾等情況下利用溶酶體途徑，對胞漿內(nèi)無功能大分子物質(zhì)和受損的細胞器進行降解、回收、利用，來維持細胞器的更新及細胞本身的代謝需要的生物學過程。在營養(yǎng)充足、外界環(huán)境良好等狀態(tài)下，細胞自噬處于較低水平，然而在氧化應(yīng)激、饑餓、生長因子缺乏、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、病毒感染等條件下可短時間內(nèi)誘導自噬發(fā)生，通過清除毒物為細胞提供營養(yǎng)物質(zhì)及能量[1-2]。

根據(jù)生理功能及降解物進入溶酶體方式的不同，一般可將自噬大致分為以下3類：分子伴侶介導的自噬（chaperone-mediatedautophagy）、微自噬（microautophagy）、大自噬（macroautophagy），其中，大自噬主要分為6個步驟完成：啟動、成核、伸長、關(guān)閉、成熟、降解或釋放。此外，還有非典型性自噬和最新報道的RNA自噬[3]。目前研究最深入的為大自噬。本綜述主要論述的是大自噬。

1.2 細胞自噬的分子生物學機制 自噬發(fā)生的各個階段受多種基因的調(diào)控，參與自噬編碼的基因稱自噬相關(guān)基因（autophagy-related genes，ATG）。ATG基因編碼的蛋白如第三類磷脂酰肌醇3激酶（PI3KC3）以協(xié)同的方式參與自噬體形成的各個階段。PI3KC3是啟動自噬的關(guān)鍵酶，其能催化3-磷酸磷脂酰肌醇（PI3P）的形成，對誘導自噬的發(fā)生起著重要作用[4]。PI3KC3由3個核心部分組成：hVPS34、p150和Beclin-1[4-5]；Beclin-1可與磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）形成復(fù)合體（VPS34），參與初級自噬囊泡的形成[6]。自噬的伸展是由Atg12和Atg8/微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（micro tubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）2個泛素蛋白共軛系統(tǒng)共同調(diào)節(jié)，Atg12與靶蛋白Atg5、Atg6共價結(jié)合形成Atg12-Atg5-Atg16復(fù)合物，募集LC3-Ⅱ結(jié)合到隔離膜，并定位到自噬泡中，從而促進自噬泡膜的延長。當自噬體雙膜結(jié)構(gòu)形成后，Atg12-Atg5-Atg16復(fù)合物脫落，自噬體發(fā)育成熟[7]。LC3是酵母菌Atg8在哺乳動物中的同源蛋白，分為Ⅰ型和Ⅱ型，當自噬發(fā)生時LC3-Ⅰ轉(zhuǎn)化為定位于前自噬體及自噬體的LC3-Ⅱ型，常用于自噬分子的檢測指標。目前已證實，能調(diào)節(jié)自噬的信號通路主要包括mTOR，Akt/PKB，ERK/MAPK，Ⅰ型和Ⅲ型PI3K等途徑。mTOR是目前研究最多的信號通路，其mTORC1（由mTOR，PRAS40，MLST8，Raptor和DEP-TOR組成的復(fù)合蛋白體）是其表達形式之一，在營養(yǎng)充足時mTORC1使Atg1人的同源蛋白ULK1和ULK2磷酸化，從而抑制自噬，在營養(yǎng)缺乏時mTOR失活，ULK1和ULK2蛋白解離，去磷酸化被激活，啟動自噬發(fā)生。

2 慢性肝炎病毒

2.1 乙型肝炎病毒 HBV感染呈全球盛行，目前有近30%的人群通過血清學證據(jù)發(fā)現(xiàn)感染HBV，慢性乙型肝炎病毒感染患者達3.5億[8]，其有一部分死于病毒感染所致的肝硬化及肝細胞癌。HBV是一種有包膜的雙鏈DNA病毒，屬嗜肝DNA病毒科（Hepadnaviridae），HBV的基因組是部分雙鏈環(huán)狀DNA分子，基因組大小為3.2 kb。其長鏈有4個開放閱讀框（open readingframe，ORF），即Pre-S/S、Pre-C/C、Pol和X，乙型肝炎表面抗原、包膜蛋白（HBsAg）、乙型肝炎e抗原（HBeAg）及乙型肝炎核心抗原（HBcAg）、HBV多聚酶（Pol）和X多肽（HBx）[9]。其中HBx可在低營養(yǎng)狀態(tài)下激活細胞自噬水平來提高細胞的存活率[10]。

2.2 丙型肝炎病毒 根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）的估計，全世界大概有1.7億人通過血清學檢測發(fā)現(xiàn)有丙肝病毒感染，約占總?cè)巳旱?%，且每年新發(fā)丙型肝炎病例達3.5萬例[11]。HCV持續(xù)感染若未有效控制可進展為肝硬化和肝細胞癌[12]。HCV歸類于黃病毒科（Flaviviridae），是黃病毒科的唯一嗜肝病毒，其基因組為9.6 kb長的單股正鏈RNA分子，基因組兩側(cè)由5′末端和3′末端的非編碼區(qū)（untranslated region，UTR）構(gòu)成，兩UTR之間則是ORF，能編碼結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白（NS2，NS3，NS4，NS5）；其中結(jié)構(gòu)蛋白包括核心蛋白（C）和包膜蛋白（E1，E2/NS1）。研究表明，在病毒RNA復(fù)制中非結(jié)構(gòu)蛋白NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B充當重要角色，此外，HCV的非結(jié)構(gòu)蛋白可以誘導自噬并作為自身抗損傷的保護性機制[13]。

目前，核苷（酸）類藥物或干擾素已成為慢性乙型肝炎的標準化治療方案，但上述抗病毒藥物存在療程長，不良反應(yīng)多，完全應(yīng)答率不高甚至無應(yīng)答等不足。臨床上慢性HCV感染一般采用干擾素和利巴韋林聯(lián)合治療，但一旦發(fā)展至肝硬化，干擾素和利巴韋林的療效則明顯下降，或不能耐受。目前急需研發(fā)新的抗病毒藥物，隨著對自噬與肝炎病毒感染的研究，發(fā)現(xiàn)抑制自噬可減少病毒復(fù)制，這意味著自噬將有可能為抗病毒治療開辟新路徑。

3 細胞自噬與慢性肝炎病毒感染

3.1 細胞自噬與HBV

3.1.1 HBV誘導自噬發(fā)生 體內(nèi)、體外實驗均發(fā)現(xiàn)，HBV感染肝細胞后會增高細胞自噬水平，而自噬水平的增高又反過來促進了HBV的復(fù)制[14-15]。使用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA），或者以Atg5和Beclin-1為靶點的shRNA則能抑制自噬體的形成，并抑制HBV的復(fù)制，而饑餓誘導或雷帕霉素（西羅莫司）則促進細胞自噬，同時增加HBV的復(fù)制[16]。以上研究均表明HBV與自噬相輔相成，相互促進；雖然HBV誘導細胞自噬的具體機制尚不清楚，但近年的研究提示，X多肽（HBx）、HBeAg、HBsAg可能參與了HBV誘導自噬機制的發(fā)生。

3.1.2 HBx與自噬 HBx可能通過多種機制參與了細胞自噬的發(fā)生：（1）HBx促進自噬體的形成。Liu等[17]發(fā)現(xiàn)，Huh7細胞外源表達HBV全基因組蛋白（HBV-DNA）后能顯著增加細胞內(nèi)的自噬體數(shù)量，而Huh7細胞外源表達無HBx的HBV基因組蛋白后自噬體數(shù)量并沒有相應(yīng)增加，提示HBV依賴于HBx促進肝細胞中自噬體的形成。王娟等[18]也證實，HBV通過HBx增加細胞內(nèi)基本自噬水平，而且還發(fā)現(xiàn)C型HBx比B型HBx更能增加細胞內(nèi)的自噬水平，提示C型HBx能誘發(fā)更強的細胞自噬。（2）HBx通過上調(diào)Beclin-1的表達促進細胞自噬。HBx蛋白可通過激活死亡相關(guān)蛋白激酶（death-associated protein kinase，DAPK），上調(diào)Beclin-1的表達來增強自噬，并且Beclin-1的表達水平與自噬體數(shù)目呈正相關(guān)[16，19]；（3）HBx抑制自噬體的降解。HBx除可以提高自噬的表達外，還可以通過抑制溶酶體的成熟及正常酸化從而阻止自噬體的降解[17]。

3.1.3 HBeAg與自噬 研究發(fā)現(xiàn)HBV前C區(qū)和C區(qū)的啟動子G1613A、A1762T/G1764A、G1896A突變能夠降低HBV感染肝細胞的自噬水平，同時G1613A、A1762T/ G1764A突變可使HBeAg水平降低[20-21]，提示HBeAg可能與自噬有相關(guān)性，但仍需進一步研究。然而，前C區(qū)與X區(qū)存在大部分重疊，細胞自噬水平的降低是因為HBeAg水平的變化還是HBx水平的變化所致還有待進一步研究。

3.1.4 HBs與自噬 由于自噬主要作用于HBV病毒包裝，因此有人認為，HBs基因才是引起自噬的主導因素，通過突變分析研究，HBV小表面蛋白（HBV small surface protein，SHBs）可引發(fā)自噬，并且可以激活未折疊蛋白應(yīng)答（unfolded protein responses，UPR），而阻斷UPR信號通路則可消除SHBs所誘導的LC3-Ⅰ的脂化，使細胞自噬水平下降[16]。

3.2 細胞自噬與HCV的關(guān)系

3.2.1 HCV誘導自噬發(fā)生 HCV感染肝細胞后也能誘導細胞自噬的發(fā)生。Ati Goughoulte等[22]用1a基因型HCV感染正常肝細胞后電鏡下可觀察到自噬體積聚，而且熒光顯微鏡下觀察到自噬相關(guān)基因Atg5和自噬標記物LC3的水平較對照組明顯增加。Sir等[23]也發(fā)現(xiàn)，HCV感染后自噬相關(guān)基因如Beclin-1、Atg5、Atg7和Atg12的表達會上調(diào)，但聚泛素結(jié)合蛋白（p62）及長壽蛋白等的降解未發(fā)生明顯的改變。因此，作者猜測HCV誘導的自噬為不完全自噬。另外，HCV可利用自噬增加HCV在細胞內(nèi)的復(fù)制[24]。如果通過抑制Beclin-1、ATG12、ATG4B的表達抑制自噬體的形成，HCV的復(fù)制水平則有可能會降低，從而有利于提高抗病毒療效。有趣的是，HCV誘導細胞自噬的發(fā)生與HCV病毒基因分型和外周血HCV RNA水平無相關(guān)性[25]，作者發(fā)現(xiàn)，不同基因型和HCV RNA水平的HCV感染使用干擾素和利巴韋林治療的療程和療效是不一樣的，降低HCV感染細胞的自噬水平則有可能對不同基因型和HCV RNA水平的HCV感染均能發(fā)揮抗病毒作用。HCV誘導細胞自噬的機制還不是很清楚，可能與UPR和非結(jié)構(gòu)蛋白的作用有關(guān)。

3.2.2 HCV通過激活UPR誘導自噬 Huang等[26]發(fā)現(xiàn)，HCV通過激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)誘導細胞自噬的發(fā)生，以抑制PKB-TSC-Mtorc1信號通路。在細胞中轉(zhuǎn)染HCV JFH1 RNA可以誘導UPR和不完全自噬，沉默3個UPR信號分子中的任何一個，可使LC3-Ⅱ的生成減少和HCV復(fù)制水平下降。HCV感染時，c/EBP同源蛋白（c/EBP homologousprotein，CHOP）在UPR自噬信號中起關(guān)鍵作用[27]。但也有人認為HCV誘導細胞自噬與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激無關(guān)[28]，Mohl等[29]研究發(fā)現(xiàn)，HCV感染誘導的自噬，伴隨著LC3-Ⅱ的聚集，這種變化發(fā)生在病毒感染前期，而UPR的刺激只發(fā)生在病毒感染的后期，這是否意味著HCV可不通過UPR誘導自噬或是HCV不依賴于UPR誘導自噬，因此還有待進一步研究。

3.2.3 HCV通過非結(jié)構(gòu)蛋白激活自噬 除了病毒觸發(fā)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和UPR，非結(jié)構(gòu)蛋白可能是HCV激活自噬的另一信號。Su等[13]發(fā)現(xiàn)，HCV的非結(jié)構(gòu)蛋白NS4B可以通過Rab5和Vps34的相互作用觸發(fā)不完全細胞自噬。此外，HCV非結(jié)構(gòu)蛋白NS5A也能激活細胞自噬反應(yīng)[30]，NS5A可能通過激活NS5ATP9上調(diào)Beclin-1的表達，從而誘導細胞自噬的發(fā)生[31]。Gregoire等[32]發(fā)現(xiàn)，HCV NS3通過IRGM與Atg5和LC3的相互作用來調(diào)節(jié)細胞自噬。

3.3 兩種慢性肝炎病毒誘導自噬的相同點與不同點

對比自噬在HBV和HCV中作用的異同可以發(fā)現(xiàn)，2種病毒感染不僅可以增強細胞自噬，還可以利用自噬來促進自身在宿主體內(nèi)復(fù)制。然而，HBV誘導的自噬是完整的，而HCV誘導不完整的細胞自噬，HBV可通過HBx、HbeAg、HBs等誘導自噬，而HCV通過UPR、非結(jié)構(gòu)蛋白等誘導自噬，HBV誘導的自噬與基因型有關(guān)，而HCV誘導的自噬不依賴HCV的基因型。

4 小結(jié)與展望

肝炎病毒感染-病毒攜帶狀態(tài)-慢性肝炎-肝硬化-肝癌這一發(fā)展路徑已被公認，其關(guān)鍵是抗病毒治療。目前HBV感染仍用IFN-α或核苷（酸）類似物治療，HCV感染已有HCV NS3蛋白酶抑制劑（PD）、NS5A與NS5B多聚酶抑制劑等新型藥物，但仍存在耐藥性及不良反應(yīng)，且病毒完全應(yīng)答率不高等缺點，因此抗病毒藥物仍有待進一步研究。自噬作為細胞代謝的重要途徑，對細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定及物質(zhì)的更新至關(guān)重要，當自噬受抑制時，大量異常的蛋白質(zhì)及受損的細胞器在細胞內(nèi)聚集，從而干擾細胞代謝及物質(zhì)更新，誘導疾病的發(fā)生。近年來大量的研究表明，HBV和HCV均能誘導細胞自噬，并且利用自噬可增強自身的復(fù)制，而相反，抑制細胞自噬則會使HBV及HCV的復(fù)制減少，這使細胞自噬作為抗病毒治療成為可能，然而現(xiàn)在對自噬在病毒感染所發(fā)揮作用的認識尚淺，病毒感染如何調(diào)節(jié)自噬通路，如何利用自噬控制復(fù)制，需要更深入的研究才能更好地為病毒感染的治療提供幫助。

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A

1009-5519（2015）20-3085-04

2015-05-11）

劉青（1987-），女，湖南長沙人，碩士研究生，主要從事肝硬化防治研究；E-mail：598053742@qq.com。

傅念（E-mail：15874787447@163.com）。