馬鈴薯病毒種類及主要病毒檢測方法

羅燕娜，劉江娜，王 航

（兵團(tuán)第六師農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，新疆 五家渠 831300）

馬鈴薯病毒種類及主要病毒檢測方法

羅燕娜，劉江娜，王 航

（兵團(tuán)第六師農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，新疆 五家渠 831300）

本文對(duì)北疆地區(qū)馬鈴薯主要病毒的特性和致病癥狀進(jìn)行了描述，并簡要介紹了馬鈴薯主要病毒的檢測技術(shù)。

馬鈴薯；病毒；檢測方法

馬鈴薯在我國廣泛種植，已成為僅次于水稻、小麥、玉米的第四大糧食作物。由于光照強(qiáng)、晝夜溫差大、氣候冷涼等優(yōu)勢，新疆北疆沿天山一帶的昌吉州、烏魯木齊、昭蘇、新源等地都非常適宜種植馬鈴薯，現(xiàn)種植面積已達(dá)2 310 hm2[1]。然而在當(dāng)前的馬鈴薯生產(chǎn)中，病毒病發(fā)生普遍而嚴(yán)重，成為制約馬鈴薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要障礙，是生產(chǎn)上亟待解決的突出問題[2]。目前，已報(bào)道的馬鈴薯病毒種類超過25種、類病毒1種，其中，侵染烏魯木齊地區(qū)馬鈴薯的主要病原病毒有PVX、PVY、PVA、PLRV,類病毒為PSTVd。主要檢測的馬鈴薯病毒有馬鈴薯X病毒（PVX）、馬鈴薯 Y病毒 （PVY）、馬鈴薯 S病毒（PVS）、馬鈴薯M病毒 （PVM）、馬鈴薯卷葉病毒（PLRV）及馬鈴薯紡錘塊莖類病毒（PSTVd）[1]。

1 馬鈴薯主要病毒種類及致病癥狀

1.1 馬鈴薯X病毒（PVX）

X病毒又稱普通花葉病毒，病毒粒子為長桿狀，大小為515 nm×13 nm，基因組全長6.4 kb[3]。該病毒可通過葉片汁液摩擦傳播，也可通過蚜蟲以非持久性方式傳播，還可通過種薯傳播[1]。感病植株癥狀多種多樣，因栽培品種的敏感性不同和病毒株系的不同而存在差異，多數(shù)表現(xiàn)為輕花葉或潛隱癥狀，癥狀嚴(yán)重的則表現(xiàn)為嚴(yán)重的花葉或皺縮，產(chǎn)量損失可達(dá)50%。

1.2 馬鈴薯Y病毒（PVY）

Y病毒又稱為重花葉病毒，病毒粒子形狀為彎曲的線形，大小為750 nm×11 nm，多數(shù)通過桃蚜和大戟長管蚜傳播。PVY包括3個(gè)株系組：馬鈴薯Y病毒普通株系組 （PVYO）、馬鈴薯點(diǎn)條斑株系（PVYC）和馬鈴薯Y病毒褐脈株系（PVYN）。前2個(gè)株系組引起的主要初期癥狀是葉片壞死、斑駁，后期則表現(xiàn)為矮化、皺縮、斑駁和卷曲；第3個(gè)株系組初期表現(xiàn)為不同程度的花葉，后期為花葉和斑駁，當(dāng)溫度低于10℃或高于25℃時(shí)，花葉癥狀消失。產(chǎn)量損失最高可達(dá)80%。通常該病毒不會(huì)引起塊莖發(fā)病，但近年來歐洲出現(xiàn)的一個(gè)新株系PVYNTN，則可在塊莖上導(dǎo)致壞死環(huán)斑[4]。

1.3 馬鈴薯A病毒（PVA）

A病毒又稱為輕花葉病毒，病毒粒體為彎曲的線形，大小為730 nm×15 nm，基因組全長9.7 kb。該病毒可通過汁液摩擦傳播或由蚜蟲以非持久性方式傳播，也可通過種薯傳播。感病植株的癥狀表現(xiàn)為脈間花葉、葉片有光澤、葉脈深陷和葉邊緣粗縮，產(chǎn)量損失可達(dá)40%。

1.4 馬鈴薯S病毒（PVS）

S病毒又稱為潛隱性花葉病毒，病毒粒子形狀為線形，大小為650 nm×12 nm，病毒基因組全長7.4 kb?？赏ㄟ^汁液摩擦傳播，也可通過蚜蟲傳播。感病植株初期癥狀不明顯，嚴(yán)重危害時(shí)，葉片呈青銅色，葉脈輕微下陷，植株的開張度較大。一些品種上會(huì)出現(xiàn)壞死斑和條紋。在田間常與其他病毒混合侵染，當(dāng)與PVX或PVM病毒混合侵染時(shí)，可減產(chǎn)20%～30%[5]。

1.5 馬鈴薯M病毒（PVM）

M病毒也屬于香石竹潛隱病毒屬（Carlavirus）。病毒粒子為線形，大小為650 nm×12 nm，該屬病毒基因組全長8.5 kb?？赏ㄟ^機(jī)械傳播，或者通過蚜蟲以非持久性方式傳播，也可通過種薯的調(diào)運(yùn)遠(yuǎn)距離傳播。感病植株葉上表面的葉脈深陷，有的出現(xiàn)粗縮，葉片輕微下垂，頂部葉片呈開散狀。

1.6 馬鈴薯卷葉病毒（PLRV）

PLRV屬于馬鈴薯卷葉病毒屬（Polerovirus），病毒粒子為六邊形等軸對(duì)稱，直徑24 nm～26 nm，基因組全長5.9 kb。主要由蚜蟲傳播，也可通過種薯傳播。感病植株發(fā)病較輕時(shí)表現(xiàn)為幼葉褪綠、卷曲，葉基常有紫紅色邊緣。發(fā)病較重時(shí)，植株矮化，葉片上卷并革質(zhì)化，產(chǎn)量損失可達(dá)70%[1]。

2 馬鈴薯病毒檢測方法

因馬鈴薯莖尖脫毒培養(yǎng)過程中各環(huán)節(jié)都會(huì)有誤差，所以在莖尖苗擴(kuò)繁之前必須對(duì)馬鈴薯苗進(jìn)行嚴(yán)格的病毒學(xué)檢測，確定不帶病毒后才能進(jìn)一步擴(kuò)繁。除此之外，還必須抽樣檢查以下幾種情況：瓶苗下地之前、組培苗扦插結(jié)束、試管薯出苗后30～40 d、現(xiàn)蕾期至盛花期、收獲前30 d左右、收獲后和種薯出庫前。因此，在馬鈴薯脫毒種薯培育過程中，準(zhǔn)確可靠的病毒檢測方法與高效的脫毒方法同等重要[6]。

目前，北疆地區(qū)常用的馬鈴薯病毒檢測方法是酶聯(lián)免疫吸附法（雙抗體夾心法（DAS-ELISA））。該檢測方法的主要操作過程有以下幾步。

2.1 準(zhǔn)備工作

實(shí)驗(yàn)前，在設(shè)計(jì)圖表上注明各反應(yīng)孔的位置，以避免出錯(cuò)。在密封塑料盒底部鋪1張吸水紙，倒入適量蒸餾水使之剛好潤濕，即為恒濕箱，孵育用。微孔板為可拆卸，根據(jù)用量取出所需數(shù)量的微孔，未使用完的微孔密封好，4℃下保存。

2.2 樣品的提取及稀釋

盡可能選擇出現(xiàn)癥狀的植物組織作為樣品，通常將葉片作為ELISA實(shí)驗(yàn)的檢測樣品，其它植物組織也可用于ELISA實(shí)驗(yàn)。使用通用樣品提取緩沖液來碾磨稀釋樣品。若用研缽提取樣品，在每份樣品提取后徹底清洗研缽，以免造成樣品間的相互污染。

將樣品與通用樣品提取緩沖液以1∶10（樣品重量（g）∶提取緩沖液體積（mL）的比例研磨樣品。

每個(gè)反應(yīng)孔需要100 μL的樣品提取稀釋液。多制備一些樣品提取稀釋液以利于吸取。

2.3 點(diǎn)樣

根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，取100 μL樣品提取稀釋液到各樣品孔中，取100 μL陰性質(zhì)控物溶液到陰性對(duì)照孔中，取100 μL陽性質(zhì)控物溶液到陽性對(duì)照孔中。

2.4 準(zhǔn)備酶標(biāo)結(jié)合物

檢測抗體和酶標(biāo)抗體均為濃縮液體，應(yīng)根據(jù)標(biāo)簽上的稀釋倍數(shù)用ECM緩沖液稀釋。根據(jù)酶標(biāo)記物標(biāo)簽上的稀釋倍數(shù)將酶標(biāo)記物和檢測抗體（瓶A和瓶B）加到1倍的ECM緩沖液中，混合均勻。1 μL的檢測抗體稀釋液可供8個(gè)反應(yīng)孔使用，10 μL的酶標(biāo)記物稀釋液可供96個(gè)反應(yīng)孔使用。

2.5 洗板

孵育結(jié)束后，將反應(yīng)孔中的試劑倒出，加入250 μL的1倍PBST緩沖液，之后快速倒出，重復(fù)7次，將微孔板倒扣在吸水紙上以控干孔中殘留液體。

2.6 加酶標(biāo)結(jié)合物

在各反應(yīng)孔中加入100 μL配置好的酶標(biāo)結(jié)合物溶液。

2.7 孵育

室溫下（25℃）在恒濕箱中孵育2 h。

2.8 PNP底物的制備

孵育結(jié)束前15 min制備PNP底物溶液。在室溫下用5 mL PNP緩沖液溶解1片PNP底物片。每片PNP底物片可溶解成5 mL的底物溶液，溶解比例為1 mg/mL，可供40個(gè)反應(yīng)孔使用。在室溫下用5 mL PNP緩沖液（1倍濃度）溶解1片PNP底物片。

2.9 洗板、加PNP底物溶液

洗板步驟同2.5，重復(fù)8次。在各反應(yīng)孔中加入100 μL PNP底物溶液。

2.10 孵育

在恒濕箱中孵育60 min，避免陽光直射或強(qiáng)光照射。

2.11 結(jié)果分析

直接用肉眼觀察或用酶標(biāo)儀在405 nm波長下測量結(jié)果。

陽性結(jié)果：微孔中有明顯顏色變化；陰性結(jié)果：微孔中沒有明顯顏色變化。只有在陽性質(zhì)控孔得到陽性結(jié)果的時(shí)候，實(shí)驗(yàn)結(jié)果才是可靠的。結(jié)果可保持1 h左右（只要陰性質(zhì)控孔不發(fā)生顏色變化）。

3 結(jié)語

建議種薯加工企業(yè)在3個(gè)環(huán)節(jié)上進(jìn)行質(zhì)量檢驗(yàn)：（1）核心種苗必須進(jìn)行病毒檢測，檢測方法可采用DAS-ELlSA。（2）田間檢驗(yàn)。全部植株目測檢查3次，目測不能確診的非正常植株采集樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)，種薯每批次至少隨機(jī)抽檢5～10點(diǎn)，每點(diǎn)100株，各指標(biāo)可參照GB18133-2012標(biāo)準(zhǔn)[7]。（3）塊莖檢驗(yàn)包括收獲后檢測和庫房檢驗(yàn)，原原種每個(gè)品種每100萬粒檢測200粒，大田每批種薯根據(jù)生產(chǎn)面積確定檢測樣品數(shù)量，種薯出庫前應(yīng)進(jìn)行庫房檢查，抽樣及檢驗(yàn)樣品數(shù)量參照GB18133-2012標(biāo)準(zhǔn)，并采用目測法檢測窖藏病害及混雜等情況。

目前，應(yīng)用于馬鈴薯病毒的免疫學(xué)檢測技術(shù)以ELISA技術(shù)最成熟，應(yīng)用最廣泛。多年來，這項(xiàng)技術(shù)被不斷改進(jìn)和創(chuàng)新，現(xiàn)已形成直接酶聯(lián)檢測法、間接酶聯(lián)檢測法 （I-ELISA）、雙抗體夾心法 （DASELISA）、三抗體夾心法（TAS-ELISA）等多種檢測方法[8]。雙抗體夾心法（DAS-ELISA）與其他檢測方法相比較，有突出的優(yōu)點(diǎn)：一是靈敏度高，檢測濃度可達(dá)l～10 ng/mL；二是快速，幾個(gè)小時(shí)內(nèi)即可出結(jié)果；三是?；詮?qiáng)，重復(fù)性好；四是檢測對(duì)象廣，粗汁液或提純液都可檢測，一般不受抗原形態(tài)的影響，無論是完整的還是降解的病毒粒體都可檢測；五是可處理大批樣品，適合種薯生產(chǎn)中大量樣品的多種馬鈴薯病毒的快速檢測。但也存在一些缺點(diǎn)：檢測病毒時(shí)會(huì)出現(xiàn)假陽性反應(yīng)，準(zhǔn)確性降低；病毒濃度低，當(dāng)年不顯癥時(shí)無法檢測；無法檢測類病毒。

[1]董代幸.烏魯木齊地區(qū)馬鈴薯病毒和類病毒的分子鑒定及檢測技術(shù)研究[D].新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

[2]李濟(jì)宸，唐玉華，譚宗九，等.馬鈴薯病害及其防治[M].石家莊：河北科學(xué)技術(shù)出版社，1992.

[3]王春香，高謙，潘乃穟，等.馬鈴薯X病毒外殼蛋白基因的cDNA克隆和全序列測定[J].植物學(xué)報(bào)，l991，33（5）：363-369.

[4]李入賢，張文龍，施文娟.馬鈴薯脫毒種薯（苗）病毒檢測技術(shù)研究進(jìn)展[J].種子，2009，28（4）：60-62.

[5]吳興泉，吳祖建，謝聯(lián)輝，等.馬鈴薯S病毒外殼蛋白基因的克隆與原核表達(dá)[J].中國病毒學(xué)，2002，17（3）：248-251.

[6]聶峰杰，張麗，宋玉霞，等.寧夏馬鈴薯脫毒種薯生產(chǎn)及病毒檢測技術(shù)的現(xiàn)狀和發(fā)展途徑[J].中國種業(yè)，2014（7）：17-21.

[7]王懷棟，黃修梅，李明.淺談馬鈴薯脫毒種薯質(zhì)量控制[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012（3）：116-119.

[8]毛彥芝.馬鈴薯病毒檢測技術(shù)的研究概況 [J].中國蔬菜，2009（12）：1-6.

兵團(tuán)重點(diǎn)水利工程獲中央投資逾13億元

2015年，國家加大對(duì)兵團(tuán)重點(diǎn)水利工程中央投資力度，擬安排兵團(tuán)大型灌區(qū)節(jié)水改造中央投資11.6億元，較2014年增長132%；節(jié)水增效示范工程擬安排中央投資1.5億元，較2014年增長130%。中央投資達(dá)到13.1億元，增速再創(chuàng)歷史新高。

兵團(tuán)14個(gè)師的170多個(gè)農(nóng)牧團(tuán)場主要分布在塔克拉瑪干和古爾班通古特兩大沙漠邊緣以及2 000多公里的邊境線上，所處區(qū)域自然稟賦差，水資源總體比較缺乏，進(jìn)行各類水利工程建設(shè)是團(tuán)場發(fā)展的重要保障。

近年，兵團(tuán)已實(shí)施肯斯瓦特水利樞紐工程、葉爾羌河流域灌區(qū)水資源開發(fā)等一大批水利建設(shè)項(xiàng)目。2015年，兵團(tuán)將重點(diǎn)實(shí)施二師三十八團(tuán)水源工程、葉爾羌河中游渠首三師前?？偢汕涮坠こ痰冉ㄔO(shè)項(xiàng)目，并繼續(xù)支持中小河流治理、引額灌區(qū)工程、奎屯河引水改擴(kuò)建、節(jié)水增效示范等重點(diǎn)水利工程建設(shè)。目前，葉爾羌河中游渠首三師前?？偢汕涮坠こ桃讶鎲?dòng)實(shí)施，工程完成后，將惠及圖木舒克市、巴楚縣三鄉(xiāng)二鎮(zhèn)等近40萬人，滿足灌區(qū)9.5萬公頃耕地、林地用水需求，增強(qiáng)灌區(qū)抵御旱災(zāi)、保持穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)的能力。

（《兵團(tuán)日?qǐng)?bào)》）

2015—01—20