低頻超聲場促進細麗毛殼菌發(fā)酵生產(chǎn)α-葡聚糖酶的研究

張澤棟，劉繼棟，陸海勤，杭方學，2，李 紅，史昌蓉，李 凱，2，3，*

(1.廣西大學輕工與食品工程學院，廣西南寧530004; 2.糖業(yè)及綜合利用教育部工程研究中心，廣西南寧530004; 3.廣西大學糖業(yè)工程技術(shù)研究中心，廣西南寧530004)

α-葡聚糖酶又稱右旋糖酐酶，是一種專一性裂解葡萄糖分子中α-1，6糖苷鍵的水解酶，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)學、化工等領(lǐng)域［1-2］。自然界中能生產(chǎn)α-葡聚糖酶的微生物為細菌及真菌，如NovoNordisk從青霉屬等微生物中分離得到α-葡聚糖酶［3］。然而，野生菌或野生植物來源的α-葡聚糖酶產(chǎn)量普遍較低，僅有約31.0U/m L［4］。盡管有研究人員采用物理或化學誘變方式來獲取高產(chǎn)α-葡聚糖酶生產(chǎn)菌［5］，但并未見到較為成功的報道。隨著合成生物學的發(fā)展，α-葡聚糖酶已經(jīng)實現(xiàn)了在工程菌如畢赤酵母(Pichia pastoris)高效表達［6］。然而，由于工程菌來源的α-葡聚糖酶的安全性存在較大爭議，使得其在食品領(lǐng)域的應(yīng)用受到限制［6］。因此，開發(fā)一種高效、安全、廉價的葡聚糖酶成為食品、藥品工業(yè)面臨的關(guān)鍵問題之一。

細麗毛殼菌為一種絲狀真菌，是美國及歐盟認可的一種食品安全性菌株［7］。在發(fā)酵過程中，細麗毛殼菌向發(fā)酵液中分泌葡聚糖酶［8］。然而，由于細麗毛殼菌有較強的自絮凝性，會使得菌體以絮凝團形態(tài)懸浮于發(fā)酵液中，限制了菌體與培養(yǎng)基、空氣的接觸比表面積，導致葡聚糖酶酶活性較低，較難達到工業(yè)化應(yīng)用水平［9］。研究人員嘗試了添加玻璃珠或機械攪拌等方法以降低菌體絮凝現(xiàn)象，然而這些方法都未能較好的解決菌體絮凝問題［10］。

以往的研究發(fā)現(xiàn)低頻超聲場誘發(fā)的超聲空化作用［11］對部分微生物的菌體生長或發(fā)酵產(chǎn)率具有促進作用［12］，促進了聲學技術(shù)在發(fā)酵工程領(lǐng)域的應(yīng)用。Matsuura等用43kHz的低頻超聲場處理釀酒酵母發(fā)酵液后證實，低頻超聲場能促進酵母繁殖，縮短發(fā)酵時間50%～60%［13］。Avhad DN等發(fā)現(xiàn)低頻超聲場可使得以球形芽孢桿菌為來源的纖維蛋白溶解酶活性提升1倍［14］。Toba將超聲波用于乳制品發(fā)酵過程，發(fā)現(xiàn)超聲處理可以將乳酸桿菌的活力提高50%［15］。本研究考察了低頻超聲場對細麗毛殼菌發(fā)酵生產(chǎn)α-葡聚糖酶的影響。研究證實，在細麗毛殼菌發(fā)酵生產(chǎn)葡聚糖酶過程中使用低頻超聲場，酶活提高87.9%，菌體生物量提高25.0%。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

細麗 毛 殼 菌 (Chaetomium Gracile，菌 號CGMCC3.3783) 購自中國微生物菌種資源庫(CGMCC);葡聚糖T2000、右旋糖酐粗酐、葡萄糖、酵母浸膏 均為山東金洋藥業(yè)生物有限公司提供;丙三醇、3，5-二硝基水楊酸 天津化學試劑有限公司;磷酸氫二鉀、檸檬酸、氫氧化鈉、磷酸氫二鈉、硫酸鎂 均為南寧藍天實驗設(shè)備有限公司提供;所有試劑均為分析純。

ZHJH1115型超凈工作臺 上海智城分析儀器制造有限公司;DELTA-320型pH計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;UV-2501PC紫外分光光度計日本島津公司;JM-B2003電子天平 南京東邁科技儀器有限公司;LSQ-LS-100A立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博迅實業(yè)有限公司;HHS型恒溫水浴鍋 上海雷韻實驗儀器有限公司;ZHWY-211C型恒溫培養(yǎng)搖床器 上海智城分析儀器制造有限公司; SB-400DTY型超聲波掃頻清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基的制備、發(fā)酵條件以及酶活的測定 取馬鈴薯浸取液1.0L、葡萄糖20.0g制成種子液體培養(yǎng)基，用接種環(huán)在無菌條件下至少挑取2環(huán)細麗毛殼菌并接種到種子液體培養(yǎng)基中，用250m L的三角瓶裝液，裝液量為25m L，在轉(zhuǎn)速為200 r/min的28℃恒溫培養(yǎng)搖床器中培養(yǎng)32h［8］。

將1.0%葡聚糖，0.5%酵母浸膏，0.1%磷酸氫二鉀，0.02%硫酸鎂制成發(fā)酵培養(yǎng)基并用0.1mol/L的檸檬酸-0.2mol/L的磷酸氫二鈉緩沖液調(diào)節(jié)pH至6.0。用250m L的三角瓶裝液，裝液量為25m L，在無菌條件下用移液槍從種子液體培養(yǎng)基中吸取0.5m L即2%的培養(yǎng)液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在200r/min轉(zhuǎn)速條件下的28℃恒溫培養(yǎng)搖床器中培養(yǎng)72h［8］。

細麗毛殼菌發(fā)酵液在4700 r/m in、4℃條件下離心15min，得到的上清液即為α-葡聚糖酶粗酶液［8］。取900μL質(zhì)量分數(shù)為2.0%的葡聚糖溶液，置于50℃恒溫水浴中保溫5m in，隨即加入100μL酶液，準確反應(yīng)10min，立即加入2m L的DNS以終止反應(yīng)，于沸水浴5min，迅速將其冷卻，用蒸餾水定容至25m L，于波長540nm處測定吸光值。從葡萄糖標準曲線的回歸方程求得相對應(yīng)的葡萄糖的量，并折算出酶活。酶活定義為:在上述條件下，每分鐘從葡聚糖底物中釋放出1μmoL還原糖所需的酶量為1個酶活單位，以U/m L表示［16］。

1.2.2 超聲處理搖床組與普通搖床組培養(yǎng)條件 最初超聲處理條件為超聲頻率24kHz、超聲時間1min/ 20m in、超聲功率50W，每次超聲處理后將三角瓶放入搖床中繼續(xù)培養(yǎng)，發(fā)酵周期72h，溫度28℃。普通搖床培養(yǎng)組在溫度28℃，轉(zhuǎn)速200 r/m in條件下恒溫培養(yǎng)72h，與超聲處理組形成對照。

1.2.3 最適超聲條件的確定 采用單因素實驗方法，在超聲時間1m in/20m in，超聲頻率24kHz的條件下，分別選擇超聲功率為0、50、300和500W進行培養(yǎng)，發(fā)酵72h后測發(fā)酵液酶活，確定最適超聲功率。

在已確定的超聲功率以及超聲頻率24kHz的條件下，分別選擇0、10s/20min、20s/20min、30s/20min、40s/20min、50s/20m in以及1m in/20m in為超聲作用時間，發(fā)酵72h后測發(fā)酵液酶活，確定最適超聲時間。

在已確定的超聲功率、時間的條件下分別選擇0、20、25、33、53及80kHz為超聲頻率，發(fā)酵72h后測發(fā)酵液酶活，從而確定最適超聲條件。

1.2.4 恒重法測量菌體干重以及菌體曲線的繪制

從發(fā)酵開始每隔8h在無菌操作臺將發(fā)酵液完全倒入50m L離心管中，在4700 r/m in條件下離心15m in，將菌體分離出來，然后將菌體移入已稱量過重量的坩堝中，置于100～105℃的鼓風干燥箱干燥6～8h，烘干至恒重［17］。將干燥的樣品用分析天平進行稱重，記錄菌體的干重。然后以發(fā)酵時間為橫坐標，測得的菌體干重為縱坐標，繪制菌體曲線。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)以均數(shù)表示，用Origin8.0進行數(shù)據(jù)處理并作圖，對部分數(shù)據(jù)用SPSS統(tǒng)計軟件進行t檢驗，p＜0.05表示差異有顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲場對α-葡聚糖酶活性的影響的初步探索

以往的研究證實，增加機械攪拌強度并未能有效提高自絮凝絲狀菌的發(fā)酵產(chǎn)酶效率［18］，這可能與機械攪拌形成的剪切力對菌體造成損傷有關(guān)。因此，傳統(tǒng)的機械攪拌促進傳質(zhì)方式并不適合于自絮凝性較強的絲狀真菌的發(fā)酵過程。

在現(xiàn)代發(fā)酵過程中引入聲學技術(shù)正逐步得到學者的認可［18］，研究表明適宜的低頻超聲場不僅能夠起到促進菌體分散，而且能夠產(chǎn)生胞內(nèi)微流，改變菌體細胞膜的滲透性，加強物質(zhì)的運輸，進而增強微生物菌體的代謝活性［19］。

為研究超聲場對α-葡聚糖酶活性的影響，以超聲技術(shù)處理后的搖床培養(yǎng)和普通搖床培養(yǎng)進行對照。研究表明，在初始超聲條件下，超聲處理后發(fā)酵液酶活為116.9U/m L，比普通的搖床培養(yǎng)提高了14.8%，可有效地促進細麗毛殼菌發(fā)酵生產(chǎn)α-葡聚糖酶，提高菌體分泌酶量(圖1A)。用恒重法對2種不同處理條件下的發(fā)酵液菌體量進行測定。結(jié)果表明，當發(fā)酵48h時兩種發(fā)酵液菌體干重均達到最大值，超聲處理后的發(fā)酵液菌體干重為6.405g而空白組僅為6.008g，利用超聲技術(shù)處理發(fā)酵液比起搖床組可以將菌體量提高9.4%(圖1B)。說明超聲技術(shù)可顯著提高細麗毛殼菌發(fā)酵液酶活以及菌體生物量。

圖1 超聲處理與搖床培養(yǎng)對發(fā)酵液酶活(A)及菌體量(B)的影響Fig.1 Influence of ultrasonic treatment and shaking table on fermentation liquid enzyme activity(A) and cell dry weight(B)

2.2 最適超聲功率的確定

本研究通過設(shè)置不同的功率參數(shù)來考察超聲功率對細麗毛殼菌發(fā)酵過程的影響。研究發(fā)現(xiàn)，當超聲功率為50W與300W時發(fā)酵液酶活均高于空白組，酶活與超聲功率呈正相關(guān)關(guān)系，尤其當超聲功率為300W時酶活為127.4U/m L比空白組酶活提高15.6%。而當超聲功率為 500W 時，酶活僅為91.0U/m L，反而對酶產(chǎn)量起抑制作用(圖2A)。同時用300W超聲功率與空白組進行對照，用恒重法對2種不同功率條件下的發(fā)酵液菌體量進行測定。研究表明，當超聲功率為300W時可以有效地提高菌體生物量，在48h時菌體干重達到最大值7.050g，在40h時菌體干重為6.910g比起空白組提高了17.0%(圖2B)。由于微生物種類不同，其最適超聲強度的需求也不盡相同［20］。在前期的實驗過程中，我們證實了低頻超聲對細麗毛殼菌發(fā)酵生產(chǎn)α-葡聚糖酶具有促進作用，而較高頻率下的超聲場的空化作用容易抑制細麗毛殼菌的發(fā)酵進程［20］。在后續(xù)的實驗中，選擇超聲功率為300W。

圖2 超聲功率對酶活(A)以及菌體量(B)的影響Fig.2 Influence of ultrasonic power on enzyme activity(A)and cell dry weight(B)

2.3 最適超聲場作用時間的確定

通過設(shè)置不同的時間參數(shù)來考察了超聲作用時間對細麗毛殼菌發(fā)酵過程的影響。研究表明，隨著超聲作用時間的增加，發(fā)酵液酶活呈現(xiàn)出先增長后下降的趨勢。空白組酶活為 100.9U/m L，在 20s/ 20m in時酶活最高達到175.8U/m L，提高了74.2%，隨后酶活逐漸下降，而當超聲時間為1m in/20m in時酶活僅為127.8U/m L(圖3A)。同時用20s/20m in的超聲時間與空白組進行對照，用恒重法在不同時間段內(nèi)對2種不同超聲時間條件下的菌體量進行測定，研究表明，當超聲時間為20s/20min時菌體干重在56h時為6.800g比起空白組可顯著提高菌體量，提高了19.3%(圖3B)，而過長的超聲作用時間容易對菌體造成較大的傷害。故選擇20s/20m in為最適超聲場作用時間。

2.4 最適超聲頻率的確定

雖然上述結(jié)果證實超聲場有利于發(fā)酵生產(chǎn)，然而并非所有頻率的超聲對菌體生長都起著促進作用，其促進效果也不盡相同。比如，高頻超聲場的穩(wěn)態(tài)空化作用較強，空化作用產(chǎn)生的微射流都能造成細胞的損傷甚至死亡，對菌體細胞造成的損傷較大［19］。因此，學者在一般選擇使用較低頻率的超聲場，如Schl?fer等發(fā)現(xiàn)低頻超聲場可以明顯改善生物活性，提高生物量2.3倍［21］。

圖3 超聲時間對酶活(A)以及菌體量(B)的影響Fig.3 Influence of ultrasonic time on enzyme activity(A)and cell dry weight(B)

本研究通過設(shè)置不同的頻率參數(shù)來考察超聲頻率對細麗毛殼菌發(fā)酵過程的影響，并考察最適超聲處理條件。數(shù)據(jù)表明，空白組酶活為102.9U/m L，當超聲頻率為 20kHz時發(fā)酵液酶活最高達到193.4U/m L，提高了87.9%，提升效果較為明顯。之后發(fā)酵液酶活與超聲頻率呈反比例關(guān)系，在80kHz時酶活僅為93.5U/m L。由此可見，20kHz為最適超聲頻率，隨著頻率的繼續(xù)增強，超聲對細麗毛殼菌發(fā)酵過程并未起到更大的促進作用，而過高的超聲頻率對細麗毛殼菌分泌α-葡聚糖酶起到抑制的作用(圖4)。

通過單因素實驗，確定超聲功率300W，超聲時間20s/20m in，超聲頻率 20kHz為最適超聲處理條件。

2.5 最適低頻超聲場對菌體自絮凝現(xiàn)象以及菌體生物量的影響

菌體形態(tài)是影響絲狀真菌生長代謝的重要因素，發(fā)酵液中較好的菌絲體形態(tài)可以為菌體生長、繁殖及代謝提供良好的基礎(chǔ)［22］。在自絮凝菌株內(nèi)，由于菌體在發(fā)酵過程中聚集成球團導致菌體不能呈現(xiàn)最適菌體形態(tài)，從而影響了其與培養(yǎng)基的傳質(zhì)過程，造成菌體生長代謝緩慢［23］。因此，對于存在自絮凝性狀的菌株的發(fā)酵培養(yǎng)過程，應(yīng)該考慮的關(guān)鍵問題之一就是在不損傷菌體的情況下提高菌體的分散性，從而使菌體在發(fā)酵液中呈現(xiàn)較好的菌體形態(tài)，增加與培養(yǎng)基接觸的比表面積，從而提高菌體酶的分泌量與菌體生物量［24］。

圖4 超聲頻率對酶活的影響Fig.4 Influence of ultrasonic frequency on enzyme activity

為考察最適超聲處理條件對菌體自絮凝現(xiàn)象的影響，本研究利用最適超聲處理條件超聲技術(shù)處理發(fā)酵液，與搖床培養(yǎng)條件下的發(fā)酵液進行對比。相比與單純搖床培養(yǎng)，低頻超聲輔助搖床培養(yǎng)呈現(xiàn)出更好的菌體分散性(圖5)。

圖5 搖床處理(A)與超聲處理(B)對菌體自絮凝現(xiàn)象的影響Fig.5 Influence of shaking table(A)and ultrasonic treatment(B)on phenomenon of cell flocculation

按照恒重法測量菌體干重并繪制菌體生長曲線，在發(fā)酵0～16h內(nèi)，菌體較少，超聲處理后發(fā)酵液菌體與搖床培養(yǎng)菌體干重無明顯區(qū)別，在發(fā)酵32h后，超聲處理后的細麗毛殼菌菌體干重明顯大于超聲培養(yǎng)條件下的菌體干重，在40h時超聲處理后發(fā)酵液干重為7.622g，而空白組為6.370g在發(fā)酵48h時菌體干重達到最大值7.871g，比起空白組6.299g提高了25%。之后菌體的生長情況逐漸減緩，但在發(fā)酵后期超聲處理后菌體量的減少的速度小于搖床培養(yǎng)。事實證明，低頻超聲處理可以有效提高發(fā)酵液的酶活，這是由于低頻超聲場可以有效地解決菌體絮凝問題，使得菌體從球團狀分散開來，增加菌體酶的分泌量，提高細麗毛殼菌生物量(圖6)以及產(chǎn)酶效率(圖4)。其中，在發(fā)酵前期，菌體數(shù)量較少，并未出現(xiàn)絮凝現(xiàn)象，超聲處理組與搖床組菌體量無顯著差異。隨著菌體的增多，菌體絮凝現(xiàn)象的加劇，低頻超聲處理的發(fā)酵液中呈現(xiàn)了較高的菌體分散性、生物量及酶活性，恰好也證明了低頻超聲場對降低細麗毛殼菌絮凝現(xiàn)象及提高酶產(chǎn)量所起的促進作用。

通過菌體生長曲線可以看出當菌體干重達最大值7.871g時，超聲處理組比起搖床組干重增加25.0%，證明低頻超聲場有利于提高菌體生物量(圖6)。

圖6 最適超聲條件對菌體量的影響Fig.6 Influence of optimum ultrasonic treatment on cell dry weight

3 結(jié)論

本研究通過超聲時間、超聲頻率、超聲功率這些因素考察了超聲場對細麗毛殼菌發(fā)酵過程的影響。研究發(fā)現(xiàn)，利用低頻超聲技術(shù)處理細麗毛殼菌發(fā)酵液可以提高發(fā)酵液中α-葡聚糖酶產(chǎn)量以及酶活。最佳超聲場條件為超聲時間20s/20min，超聲頻率20kHz，超聲功率300W，此時酶活最高為193.4U/m L，同比空白對照組提高87.9%。實驗結(jié)果對于超聲技術(shù)應(yīng)用于毛殼菌發(fā)酵過程有一定的意義，同時可為類似的絮凝性真菌的發(fā)酵過程提供借鑒。

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