藍(lán)舌病病毒蛋白結(jié)構(gòu)與疫苗研究進展

藍(lán)舌病病毒蛋白結(jié)構(gòu)與疫苗研究進展

張 玲1,2，王 玉1.2，谷文喜1，石保新1，易新萍1，姚 剛2，葉 鋒1，馬小菁1，鐘 旗1*
（1.新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所，新疆 烏魯木齊 830000；
2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052）

藍(lán)舌病（Bluetongue, BT）是世界動物衛(wèi)生組織（0IE）規(guī)為的多種動物共患疫病，嚴(yán)重危害著全球畜牧業(yè)的經(jīng)濟發(fā)展，接種疫苗能有效的預(yù)防該病。藍(lán)舌病病毒（Bluetonguevirus，BTV）屬于呼腸孤病毒科環(huán)狀病毒屬，該病毒通過媒介昆蟲(庫蠓)叮咬牛、羊、鹿等易感反芻動物進行傳播，可引起易感動物的出血性傳染性疾病。BTV的10個雙股RNA基因片段編碼7種結(jié)構(gòu)蛋白（VP1~VP7）和5種非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1、NS2、NS3、NS3α和NS4）。其中BTV雙層蛋白衣殼中，外殼蛋白VP2和VP5是BTV型特異性抗原，內(nèi)殼蛋白VP3和VP7含有BTV群特異性抗原決定簇。本文概述與總結(jié)了上述蛋白的結(jié)構(gòu)、功能與研究情況和對目前國內(nèi)外BT弱毒疫苗、滅活疫苗、病毒樣顆粒及重組疫苗的研究進展。

藍(lán)舌病病毒；病毒蛋白；疫苗

修回日期：2015-02-15

藍(lán)舌?。˙luetongue, BT）是由呼腸孤病毒科環(huán)狀病毒屬的藍(lán)舌病病毒(Bluetongue virus, BTV)引起的經(jīng)媒介昆蟲如庫蠓、伊蚊等傳播的非接觸性病毒性傳染病。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將BT規(guī)為多種動物共患疾病，為上報疾病[1]。該病主要侵害綿羊，并可感染牛和其他多種反芻動物且呈現(xiàn)隱性感染。該病的臨床表現(xiàn)以面部充血和出血、發(fā)炎和水腫為主要特征的發(fā)熱反應(yīng)，同時伴有粘膜潰瘍。妊娠動物感染后可經(jīng)胎盤垂直傳染胎兒，引起流產(chǎn)、死胎等。BT通過庫蠓等吸血昆蟲叮咬帶病毒血癥的動物血液感染病毒并在易感動物之間傳播BTV，感染病毒的庫蠓終身帶毒。庫蠓作為該病的傳播媒介影響B(tài)T的流行，因此BT在許多地區(qū)呈季節(jié)性流行。隨著全球氣候變暖的加快，BT分布范圍也在逐漸擴大。

1 藍(lán)舌病概述

第一次發(fā)現(xiàn)BT病毒是19世紀(jì)南非[2]。在20世紀(jì)初，伴隨著進出口貿(mào)易的發(fā)展，藍(lán)舌病在非洲廣泛傳播。隨后在美國，非洲，亞洲等世界范圍內(nèi)傳播，1996年造成了三十億美元的損失[3]。在1998年以前，藍(lán)舌病只是短暫的發(fā)生在歐洲南部（西班牙、葡萄牙、希臘和塞浦路斯）。然而在1998年以后，至少有八個不同的藍(lán)舌病毒株來自六個不同的血清型（1,2,4,8,9,16）在歐洲爆發(fā)，其中包括很多北歐的國家[4,5]。在2006 年8月，BTV8最初發(fā)生在荷蘭，隨后在德國、比利時和法國東北部蔓延，總共引起了2 297例藍(lán)舌病病例。冬季過后，病毒感染有較強的復(fù)發(fā)趨勢，在2007年歐洲爆發(fā)面積繼續(xù)擴張。2008年3月-4月，法、意等國爆發(fā)藍(lán)舌病。2011年12月-2012年1月摩洛哥（11次）發(fā)生藍(lán)舌病疫情，之后的10月-11月，希臘（22次）發(fā)生藍(lán)舌病疫情，綿羊發(fā)病639只死亡626只。雖然BTV主要感染綿羊，其他的反芻動物也會感染但不呈現(xiàn)明顯的臨床癥狀，但是2011年爆發(fā)的BTV8使感染的牛產(chǎn)生了一些明顯的臨床癥狀和較低的死亡率，造成了一定的經(jīng)濟損失，引起了廣泛關(guān)注[6]。

我國自1979年在云南省首次檢測出綿羊藍(lán)舌病后，隨后相繼在湖北、安徽、四川、山西等29個省均檢出BTV血清陽性畜。到目前為止，已經(jīng)有7個血清型（BTV1、BTV2、BTV3、BTV4、BTV12、BTV15、BTV16）在我國被發(fā)現(xiàn)[7,8,9]。其中BTV1和BTV16在中國流行最廣。目前我國正在對BTV8進行監(jiān)測，其在我國的流行情況尚不清楚。

藍(lán)舌病的分布與中間宿主的活動情況有很大關(guān)系。大致的分布區(qū)域在北緯40度和南緯45度之間，在某些地區(qū)如北美和中國，在北緯50度內(nèi)也檢測到BTV[10]。并且BTV有持續(xù)向北擴張的趨勢，這種分布情況的改變可能是因為全球氣候變暖的原因[11]。

2 病毒的結(jié)構(gòu)

BTV是呼腸孤病毒科(Reoviridae)環(huán)狀病毒屬(Orbivirus)藍(lán)舌病病毒亞群(Bluetongue virus sub-group)的成員，現(xiàn)共有26個血清型，其中BTV25(2008年，瑞士)和BTV26（2011年，科威特）是分別從山羊和綿羊體內(nèi)檢測到的新的血清型[12]。BTV可在4℃和-70℃長期保存[42]。BTV與鹿流行性出血熱病毒(EHDV)有明顯的免疫交叉反應(yīng)。

完整的BT病毒粒子呈二十面體對稱，由雙鏈RNA組成，其分段基因組RNA 3’和5’端各含有特異的重復(fù)保守序列，為5’-GUUAAA和3’-ACUUAC。BTV基因組分10個片段，可編碼7種結(jié)構(gòu)蛋白（VP1-7）和5種非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1-3、NS3A和NS4）。BTV是雙層衣殼，最外層由兩個結(jié)構(gòu)蛋白構(gòu)成，分別是VP2 （111 kDa）和VP5（59kDa）。核心衣殼由VP3（100 kDa）、VP7（38 kDa）兩種主要結(jié)構(gòu)蛋白和VP1（149 kDa）、VP4（76 kDa)、VP6（36 kDa)三種次要結(jié)構(gòu)蛋白構(gòu)成。5種非結(jié)構(gòu)蛋白可能參與了BTV的復(fù)制、“裁剪”和運輸,是在被BTV感染的細(xì)胞中合成的[13]。

2.1 病毒蛋白

2.1.1外衣殼蛋白VP2、VP5

VP2是由L2基因編碼，是BTV型特異性抗原，是BTV血清型的主要決定因素，能引起血凝，誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體，與病毒的毒力和細(xì)胞吸附作用有關(guān)。VP2蛋白與紅細(xì)胞表面的血型糖蛋白A具有很強烈的親和力，使BTV與血細(xì)胞相結(jié)合[14]。此外，缺失VP2的BTV不具有感染細(xì)胞的能力，說明BTV的致病力與VP2與紅細(xì)胞表面糖蛋白的結(jié)合能力有關(guān)。

比較來自24個血清型的BTV毒株，發(fā)現(xiàn)編碼VP2蛋白的Seg-2存在序列變異的現(xiàn)象。不同血清型的Seg-2的核苷酸序列變化從29%（BTV8和BTV18)~59%（BTV16和BTV22）[14]。通過比較來自不同地域的相同血清型的不同毒株的VP2蛋白的核苷酸序列，可以發(fā)現(xiàn)其中最大的差異可以達(dá)到30%[15]。說明相同血清型的BTV具有一定的地域性。目前可以利用RT-PCR技術(shù)擴增Seg-2，比較基因序列來確定血清型和地域相關(guān)性[16]。

VP5是除VP2外的另一個BTV型特異性抗原,由M5基因編碼，是BT病毒唯一的糖基化蛋白。與VP2比較，VP5更加的保守，存在BTV顆粒表面，在一定程度上可以反映病毒的地域來源[17]。有實驗表明，VP5是一種鑲嵌式蛋白，可以介導(dǎo)病毒顆粒核心部分進入受體細(xì)胞質(zhì)中[18]。

VP5在VP2免疫中和反應(yīng)中起到了重要的增強作用[19]。因此，在研制以及檢測BT疫苗時，VP2和VP5蛋白的表達(dá)水平都需要檢測，這對于BTV疫苗的效力具有重要意義。2.1.2內(nèi)衣殼蛋白VP3和VP7

VP3與VP7分別由L3和S7基因編碼，均含有BTV的群特異性抗原決定簇。兩者均是保守性蛋白，并且具有疏水性。重要的是核心蛋白對哺乳動物細(xì)胞感染率幾乎為零，但是對庫蠓的細(xì)胞來說卻擁有比在哺乳動物細(xì)胞至少高100倍的感染率[20,21]。

VP3與內(nèi)部的VP1、VP4、VP6及dsRNA緊密相連，在維持病毒內(nèi)層結(jié)構(gòu)的完整性起到重要作用。BTV毒力與VP3無關(guān)[22]。

在缺少VP2或者是VP5蛋白的情況下，VP7蛋白可以介導(dǎo)病毒顆粒與昆蟲細(xì)胞結(jié)合和滲透[20]。BTV 的26種不同血清型中VP7氨基酸殘基的同源性達(dá)到98%，因此目前所用的許多商品化的BTV血清學(xué)檢測方法均以VP7蛋白或是其單克隆抗體（MAb）為基礎(chǔ)進行檢測，故VP7也成了研究的熱點[23-24]。

2.1.3核芯蛋白VP1、VP4、VP6

在病毒顆粒內(nèi)部VP1蛋白的摩爾濃度較低。VP1由L1基因編碼，具有RNA依賴的RNA聚合酶活性，并對Mg2+具有依賴性。其主要作用是以oligo(A)為引物擴增RNA鏈，同時在病毒復(fù)制過程中也起到重要作用。在27℃~37℃時VP1蛋白在哺乳動物和昆蟲細(xì)胞內(nèi)均具有最高活性[14]。

早期的BTVmRNA是不具有生物活性的，需要進一步修飾，才能使mRNA更穩(wěn)定，并使其有效地翻譯。在細(xì)胞內(nèi)，參加這一過程的主要有四種酶，這四種酶的反應(yīng)都需要VP4蛋白催化。這是因為VP4蛋白的晶體結(jié)構(gòu)為它們提供了支架作用。

VP6蛋白具有ATP結(jié)合活性，依賴RNA ATP酶活性和解旋功能，能展開BTV的雙鏈并輔助mRNA的合成[25]。

2.2非結(jié)構(gòu)蛋白NS1、NS2、NS3、NS3A和NS4

在電子顯微鏡下觀察被BTV感染的細(xì)胞，可以看到一個顯著的BTV感染細(xì)胞的胞內(nèi)形態(tài)特征，由大量的病毒特異性小管（直徑52.3 nm，長1 000 nm）組成的多聚體NS1蛋白[14]。實驗證明，NS1蛋白在病毒蛋白的合成的過程中起正調(diào)節(jié)作用[26]。

NS2蛋白主要存在于被感染細(xì)胞的細(xì)胞核附近。NS2可以與單鏈RNA相結(jié)合并且可以使三磷酸核苷酸水解成單磷酸核苷酸[27]。這兩個功能意味著NS2蛋白在病毒復(fù)制的過程中起著重要作用。

NS1和NS2蛋白是兩個較大的非結(jié)構(gòu)蛋白，在被感染的細(xì)胞內(nèi)這兩個蛋白具有很高的表達(dá)量[28]，其中NS1表達(dá)量最高。而NS3 /NS3A蛋白在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)僅僅可以勉強檢測出來，但是在昆蟲體內(nèi)這兩種蛋白卻具有很高的表達(dá)量，因此可以猜想，這兩種蛋白可能的主要作用是參與了BTV在昆蟲體內(nèi)的傳播。

S9基因除了編碼結(jié)構(gòu)蛋白VP6外，在其基因的開放閱讀框中還編碼一種非結(jié)構(gòu)蛋白NS4[29]。在BTV復(fù)制過程中，在NS3和NS3A的作用下，部分新合成的病毒顆粒從細(xì)胞中釋放出來并重新感染細(xì)胞。

3 疫苗的研究

目前，藍(lán)舌病疫苗有弱毒疫苗、滅活疫苗、病毒樣顆粒和重組疫苗。其中弱毒疫苗因在南非已經(jīng)使用超過了50年，免疫效果仍然很好[30]。弱毒疫苗和滅活疫苗的機制是血清型特異性保護作用，這個過程中外層蛋白VP2在B細(xì)胞和T細(xì)胞的保護免疫過程中起到重要作用。BTV的26個血清型之間無交叉免疫，所以在該病流行地區(qū)，人們根據(jù)當(dāng)?shù)氐难逍?，選擇相應(yīng)的單價或多價疫苗進行免疫接種。一種理想的BTV疫苗應(yīng)該能夠預(yù)防流行地區(qū)內(nèi)所有BTV的血清型，而對于接種動物和妊娠母畜及胎兒不產(chǎn)生致病作用、不會出現(xiàn)毒力回升，并且不與野毒株發(fā)生重組，性能穩(wěn)定，價格低廉。以下介紹BTV四種疫苗。

3.1弱毒疫苗

弱毒疫苗是最早應(yīng)對藍(lán)舌病爆發(fā)的疫苗。弱毒疫苗在注射后至少一年之內(nèi)都會有很好的效果，而且成本低[21]。但是對于一些易感種群弱毒疫苗任存在安全問題[31]。且有研究指出，BTV減毒活疫苗出現(xiàn)了各種已證實或潛在的不足，包括效價的衰減，其原因有可能與羊的品種不同有關(guān)。接種弱毒疫苗后都會出現(xiàn)一些輕微的臨床癥狀，如懷孕母畜流產(chǎn)，死胎，產(chǎn)奶量下降和公畜精子質(zhì)量下降等。接種動物在接種后10 d左右出現(xiàn)抗體。新生的羔羊可通過初乳獲得抗體，這時羔羊接種疫苗，就會影響疫苗免疫的效果。近些年來，反向遺傳學(xué)被應(yīng)用于弱毒疫苗的研究，針對BTV1和BTV6的研究已經(jīng)開展開來[13]。

3.2 滅活疫苗

相對于BTV的多價弱毒疫苗可能導(dǎo)致的病毒基因重組和毒力的增強，滅活疫苗的安全性更高。因此，人們首選滅活疫苗[32-34]。然而，滅活疫苗的免疫效應(yīng)很差，只能誘導(dǎo)產(chǎn)生很短暫的免疫中和效應(yīng)，通常它的免疫效應(yīng)一般只有幾個月。但是這個缺點可以通過多次注射來彌補，產(chǎn)生高效、長期的免疫效應(yīng)[35]。歐洲食品安全局建議各國使用滅活疫苗[36]，并且自從2005年以來，歐洲的一些國家已經(jīng)開始實施，包括法國和意大利[35]。但是，目前可用的滅活疫苗只能針對少數(shù)幾個血清型。歐盟及歐盟成員國對于BTV-8引起的重大疫情用滅活疫苗接種防治達(dá)成共識。2008年歐洲用于控制BTV-8的兩種滅活疫苗為BTVPUR ALSAPR 8(MERIAL)和BOVILIS R BTV8(Intervet/SP-AH)，經(jīng)研究表明山羊兩次注射接種BTVPUR ALSAP 8或BOVILIS BTV8臨床保護顯著，并能阻止山羊發(fā)生病毒血癥[37]。

3.3病毒樣顆粒(VLPs)

病毒樣顆粒(VLPs)疫苗是含有病毒的一個或多個結(jié)構(gòu)蛋白的空心顆粒，無病毒核酸，不能進行自主復(fù)制，可通過和病毒一樣的感染途徑呈遞給免疫細(xì)胞，有效地誘導(dǎo)機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫保護反應(yīng)。這種疫苗被認(rèn)為是天然安全的、無需經(jīng)過任何失活過程、具DIVA性質(zhì)。BTV中的VP2蛋白能誘發(fā)動物產(chǎn)生特異性中和抗體，因此可以利用基因克隆技術(shù)生產(chǎn)純化病毒外殼蛋白作為疫苗使用。有研究表明，衣殼蛋白VP2和VP5蛋白聯(lián)合表達(dá)比單個VP2產(chǎn)生更好的免疫效應(yīng)。BTV的4種結(jié)構(gòu)蛋白可以利用桿狀病毒作載體，轉(zhuǎn)染入昆蟲細(xì)胞進行表達(dá)（桿狀病毒重組表達(dá)疫苗），構(gòu)成類似病毒結(jié)構(gòu)的病毒樣顆粒。目前有實驗室對BTV8的VLPs的免疫效應(yīng)進行了測試，其數(shù)據(jù)表明，BTV-8 VLPs作為一個單一的抗原或作為多價疫苗的組成成免疫效果都很好，并且接種VLPs的動物注入BTV-8后沒有臨床表現(xiàn)或病毒血癥。該實驗進一步強調(diào)了BTV病毒樣顆粒是安全有效的免疫原，對致命病毒侵入的能夠提供完整的保護[38]。

3.4重組疫苗

無論是使用弱毒疫苗還是滅活疫苗，目前均沒有血清學(xué)檢測的方法“區(qū)分被感染的動物與疫苗接種的動物”(distinguish infected from vaccinated animals, DIVA assays)，而重組BTV疫苗的安全性相對更高，并具有DIVA性質(zhì)，基于以上原因重組載體疫苗一直都是研究重點[39]。一些實驗室早期的實驗證明，利用痘病毒衍生載體具有較好的實驗效果。實驗證明，將含有VP2和VP5聯(lián)合蛋白的牛痘病毒重組疫苗對羊進行免疫注射（免疫3次間隔21 d）[14]，在羊體內(nèi)能產(chǎn)生有效地保護性免疫[40]。近年來，禽痘病毒作為哺乳動物基因工程疫苗的重要載體已被確認(rèn)，尤其是其中的非復(fù)制性金絲雀痘病毒載體，以金絲雀痘病毒為載體，重組VP2和VP5蛋白的重組疫苗（免疫2次間隔22 d）[14]產(chǎn)生了較高水平的中和抗體。最近有實驗用馬皰疹病毒1型(EHV-1)作為BTV-8中的VP2和VP5的疫苗遞送系統(tǒng)，結(jié)果表明，EHV-1表達(dá)BTV-8的VP2和VP5能夠引發(fā)保護免疫應(yīng)答[41]。目前，重組載體疫苗任處于研究階段，雖取得了一定的成功，但仍有由許多問題待解決。

4 小 結(jié)

隨著藍(lán)舌病的分布范圍的擴大和新疫情的不斷出現(xiàn)，藍(lán)舌病病毒的研究也在不斷的加深。自2008年歐洲爆發(fā)BTV-8后滅活疫苗成為歐盟國家預(yù)防藍(lán)舌病的首選疫苗。近幾年重組疫苗成為藍(lán)舌病疫苗的研究熱點，從痘病毒到皰疹病毒，成果顯著，但相對于實際應(yīng)用上還有待發(fā)展。疫苗的研制離不開與病毒相關(guān)的特異性結(jié)構(gòu)蛋白。BTV中的VP2、VP5、VP7等病毒蛋白，由于它們各自結(jié)構(gòu)和功能上的特點，在疫苗的研制中它們表達(dá)與否和表達(dá)量的多少與疫苗的成功息息相關(guān)。對于BTV流行地區(qū)，及時的防控疫病才是關(guān)鍵所在。因此除了有效的接種疫苗，臨床檢測也至關(guān)重要。目前我國臨床上用于檢測藍(lán)舌病抗體的均為國外的藍(lán)舌病C-ELISA試劑盒，由于價格昂貴無法普及使用。針對這一難題，在國內(nèi)對藍(lán)舌病多克隆抗體C-ELISA檢測方法進行研究，并已得到了較好的成果，實驗顯示該檢測方法與中和試驗檢測結(jié)果符合率達(dá)100%，與進口試劑盒符合率為96.7%[43]。這將對國內(nèi)藍(lán)舌病的檢測效率有一個很大的提升。因此開發(fā)研制可推廣應(yīng)用的測試劑盒，對流行地區(qū)的易感家畜及野生動物及時進行檢測，才能遏制疫病的擴散，減少經(jīng)濟損失。

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Research Progress of Protein Structures and Vaccines of Bluetongue Virus

ZHANG Ling1,2,WANG Yu1,2, GU Wen-xi1, SHI Bao-xin1，YI Xin-ping1，YAO Gang2, YE Feng1, MA Xiao-jing1, ZHONG Qi1*
(1.Veterinary Institute, Xinjiang Academy of Animal Science，Urumqi 830000, China;
2.College of Animal Medicine，Xinjiang Agricultural University，Urumqi 830052，China)

Bluetongue(BT), a zoonotic disease reported by the OIE, led to a serious threat for global animal husbandry. It has been shown that vaccination can effectively prevent the disease. Bluetongue virus(BTV)a ring virus from reovirus families, spreads through insect vectors(Culicoides)that bites cattle, sheep, deer and other susceptible ruminants. It causes hemorrhagic diseases of susceptible animals. BTV contains 10 doublestrand RNA fragments that encode seven structural proteins(VP1 ~ VP7)and five non-structural proteins(NS1, NS2, NS3, NS3α and NS4). Within double capsid proteins in BTV, the coat protein, VP2 and VP5, is BTV type-specific antigen, while the capsid protein, VP3 and VP7, contains BTV group specific epitopes. The current study summarizes the research progresses of structures and functions of BTV proteins, and different types of vaccines including attenuated vaccines, inactivated vaccines, virus-like particle and recombinant vaccines.

Bluetongue virus; viral protein; vaccine

S852.65

A

1003－6377（2015）03－0017-07

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項“重要牛羊蟲媒病毒病防控關(guān)鍵技術(shù)研究與應(yīng)用”(201303035)

張玲(1990-），女，在讀碩士，主要從事蟲媒病的研究。

E-mail：1459760360@qq.com

鐘旗（1964-），女，研究員，博士，主要從事病原微生物的研究。

E-mail：yyyzqok@yahoo.com.cn

2014-12-14，