副豬嗜血桿菌平板凝集檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用

高 艷，張定全，楊增岐，梁留存，劉海金，吳朋朋，高小龍，常旭東，杜恩岐

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西 楊凌712100)

副豬嗜血桿菌平板凝集檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用

高 艷，張定全，楊增岐，梁留存，劉海金，吳朋朋，高小龍，常旭東，杜恩岐

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西 楊凌712100)

【目的】 建立快速檢測(cè)副豬嗜血桿菌抗體的平板凝集試驗(yàn)方法，以便能夠?qū)Ω必i嗜血桿菌病進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的診斷。【方法】 利用9株(Ea、Ec、Ew、A1、A2、B1、B2、C1、C2)副豬嗜血桿菌陜西分離株制備平板凝集抗原，用其免疫健康家兔制備血清抗體，建立副豬嗜血桿菌平板凝集檢測(cè)方法，對(duì)制備抗原的優(yōu)勢(shì)菌株進(jìn)行篩選，并對(duì)該方法的特異性、敏感性、抗原最佳工作濃度進(jìn)行檢測(cè)?！窘Y(jié)果】 選出Ew株作為制備抗原的種子菌株，成功建立了檢測(cè)副豬嗜血桿菌抗體的平板凝集試驗(yàn)方法；該方法具有良好的特異性和敏感性，抗原最適工作濃度為8×109CFU/mL。采用本試驗(yàn)建立的副豬嗜血桿菌平板凝集試驗(yàn)方法對(duì)臨床血清樣品的檢測(cè)結(jié)果與臨床診斷結(jié)果基本一致?！窘Y(jié)論】 建立的副豬嗜血桿菌平板凝集試驗(yàn)方法能夠?qū)Ω必i嗜血桿菌病做出較為快速、準(zhǔn)確的診斷；陜西省存在副豬嗜血桿菌不同程度的感染，規(guī)模豬場(chǎng)集中飼養(yǎng)的豬感染副豬嗜血桿菌的比率明顯高于散戶。

副豬嗜血桿菌；抗原制備；平板凝集；抗體檢測(cè)

副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis,Hps)通常寄生于豬的上呼吸道，一般情況下不發(fā)病[1]，但在豬群存在其他病原感染以及環(huán)境變化等因素的影響下，能夠引發(fā)以多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎、腦膜炎、支氣管肺炎等為特征的嚴(yán)重全身性疾病[2]。臨床上，豬鏈球菌、胸膜肺炎放線桿菌、巴氏桿菌、沙門(mén)菌等可引起與副豬嗜血桿菌病相似的癥狀，且往往與這些菌混合感染豬，所以應(yīng)特別注意副豬嗜血桿菌病與這些病的鑒別診斷[3-4]。檢測(cè)副豬嗜血桿菌病的方法有很多種，如間接血凝抑制試驗(yàn)法、平板凝集試驗(yàn)法、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)法、ELISA等[5]。但目前國(guó)內(nèi)采用平板凝集試驗(yàn)法來(lái)檢測(cè)副豬嗜血桿菌的詳細(xì)文獻(xiàn)報(bào)道較少。本試驗(yàn)在制備副豬嗜血桿菌平板凝集抗原的基礎(chǔ)上，初步建立了副豬嗜血桿菌平板凝集檢測(cè)方法，并用此方法對(duì)陜西部分地區(qū)豬場(chǎng)的豬進(jìn)行了副豬嗜血桿菌血清抗體檢測(cè)，證明本試驗(yàn)建立的副豬嗜血桿菌平板凝集試驗(yàn)方法具有簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，可用于集約化豬場(chǎng)和散養(yǎng)豬副豬嗜血桿菌病的檢疫及流行病學(xué)調(diào)查。

1 材料與方法

1.1 材 料

9株副豬嗜血桿菌(Ea、Ec、Ew、A1、A2、B1、B2、C1、C2株)，由西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院傳染病實(shí)驗(yàn)室從陜西省關(guān)中地區(qū)患多發(fā)性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎豬場(chǎng)中分離鑒定和保存。豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌陽(yáng)性血清、豬鏈球菌陽(yáng)性血清、副豬嗜血桿菌標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清，均由西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院傳染病實(shí)驗(yàn)室提供；其他血清是2012-2013年期間，采集自陜西部分豬場(chǎng)和散養(yǎng)戶。1.5 kg/只左右的健康家兔，購(gòu)自西北農(nóng)林科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 方 法

1.2.1 副豬嗜血桿菌的復(fù)蘇與擴(kuò)大培養(yǎng) 從冰箱中取出凍存的副豬嗜血桿菌菌液，在38 ℃左右水浴中快速使其復(fù)蘇，將復(fù)蘇菌液移至TSA固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24～36 h，觀察菌落形態(tài)并進(jìn)行鑒定。

[6-8]中的方法并加以改進(jìn)，將復(fù)蘇鑒定好的菌株移至TSA固體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，連續(xù)傳2～3代復(fù)壯后制備抗原。

1.2.2 免疫陽(yáng)性血清與陰性血清的制備 用制備好的副豬嗜血桿菌抗原與氫氧化鋁佐劑按照體積比1∶1混合，背部皮下多點(diǎn)注射免疫健康家兔，每個(gè)點(diǎn)注射500 μL，共免疫3次，每次8×109CFU/mL。一免以后間隔7 d進(jìn)行二免，二免后間隔7 d進(jìn)行三免，三免后7 d無(wú)菌心臟采血，分離血清，小量分裝，置-20 ℃保存?zhèn)溆?。采集無(wú)副豬嗜血桿菌感染的健康家兔血清，作為陰性血清，置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 副豬嗜血桿菌平板凝集檢測(cè)方法的建立 按照平板凝集試驗(yàn)方法[8]，取1塊潔凈的玻璃板，垂直滴加制備好的抗原和血清各50 μL，用火柴棒充分混勻，室溫放置3～5 min，觀察結(jié)果。同時(shí)，用生理鹽水設(shè)立對(duì)照。

1.2.4 可靠性試驗(yàn) 以9株副豬嗜血桿菌為抗原，用本試驗(yàn)建立的副豬嗜血桿菌平板凝集試驗(yàn)方法，檢測(cè)134份豬副豬嗜血桿菌標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清和50份標(biāo)準(zhǔn)陰性血清，記錄結(jié)果。

1.2.5 優(yōu)勢(shì)抗原菌株的篩選 以9株副豬嗜血桿菌為抗原，用本試驗(yàn)建立的平板凝集試驗(yàn)方法檢測(cè)276份血清，根據(jù)抗原與檢測(cè)血清出現(xiàn)凝集反應(yīng)程度的不同，篩選出制備抗原的最佳菌株。試驗(yàn)檢測(cè)的276份血清中142份是2012-2013年期間采集自陜西省的一些發(fā)病豬場(chǎng)(神木某豬場(chǎng)95份、扶風(fēng)某豬場(chǎng)32份、寶雞某豬場(chǎng)15份)，另外134份陽(yáng)性血清由傳染病實(shí)驗(yàn)室采集并檢測(cè)。

1.2.6 抗原最佳工作濃度的確定 用0.5%的無(wú)菌石炭酸生理鹽水調(diào)整副豬嗜血桿菌抗原為1×1010，9×109，8×109，7×109，6×109，5×109，4×109和3×109CFU/mL 8個(gè)梯度，用此8個(gè)梯度的副豬嗜血桿菌抗原測(cè)定免疫兔血清中副豬嗜血桿菌抗體，以確定抗原的最佳工作濃度。

1.2.7 特異性試驗(yàn) 以Ew株副豬嗜血桿菌為抗原，用本試驗(yàn)建立的平板凝集試驗(yàn)方法檢測(cè)制備好的兔副豬嗜血桿菌免疫陽(yáng)性血清30份、兔陰性血清30份、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌陽(yáng)性血清30份、豬鏈球菌陽(yáng)性血清30份，同時(shí)用生理鹽水設(shè)立對(duì)照。

1.2.8 副豬嗜血桿菌平板凝集試驗(yàn)對(duì)臨床樣品的檢測(cè) 試驗(yàn)檢測(cè)的血清是2012-2013年期間，采集自陜西省的一些豬場(chǎng)和散養(yǎng)戶，共282份，其中扶風(fēng)某豬場(chǎng)32份、寶雞某豬場(chǎng)15份、勉縣某豬場(chǎng)14份、華縣某豬場(chǎng)18份、神木縣某商品豬場(chǎng)95份、神木某種豬場(chǎng)(1)20份、神木縣某種豬場(chǎng)(2)38份、神木縣散養(yǎng)戶豬場(chǎng)50份。所有采血豬均未進(jìn)行副豬嗜血桿菌病疫苗免疫。用本試驗(yàn)建立的副豬嗜血桿菌平板凝集試驗(yàn)方法檢測(cè)采集血清樣，并結(jié)合臨床診斷結(jié)果判斷副豬嗜血桿菌病的流行情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 副豬嗜血桿菌平板凝集試驗(yàn)方法的可靠性

9株副豬嗜血桿菌抗原與陽(yáng)性血清凝集反應(yīng)率達(dá)96.3%～100.0%(表1)，與陰性血清的凝集反應(yīng)率為0。說(shuō)明本試驗(yàn)制備的副豬嗜血桿菌抗原及建立的平板凝集試驗(yàn)方法可靠，且具有很強(qiáng)的實(shí)用性。

2.2 制備副豬嗜血抗原優(yōu)勢(shì)菌株的篩選

由表2可以看出，本試驗(yàn)制備的副豬嗜血桿菌抗體基本可檢測(cè)出陜西地區(qū)副豬嗜血桿菌流行株；Ew株較其他菌株抗原與陽(yáng)性血清反應(yīng)的凝集程度強(qiáng)，其次為Ea株，其他菌株反應(yīng)凝集情況基本相同。表明Ew菌株具有較強(qiáng)的凝集反應(yīng)性，可作為今后制備副豬嗜血桿菌抗體和弱毒苗的備選菌株。

2.3 副豬嗜血桿菌抗原最佳工作濃度的確定

平板凝集試驗(yàn)結(jié)果(表3)表明，兔副豬嗜血桿菌陽(yáng)性血清4倍稀釋，抗原濃度為8×109CFU/mL時(shí)，抗原與血清凝集現(xiàn)象最明顯，液體完全透明，凝集顆粒物大如沙粒，因而確定抗原的最適工作濃度為8×109CFU/mL。

注：“++++”.液體完全透明，凝集顆粒物如大沙粒；“+++”.出現(xiàn)較多的凝集顆粒物,液體幾乎完全透明，即75%凝集；“++”.有沙粒狀凝集顆粒物，液體不完全透明，即50%凝集；“+”.液體混濁，有較少的小的顆粒狀物，即25%凝集;“-”.液體均勻混濁，無(wú)凝集物。

Note:“++++”.Liquid is completely transparent,aggregation of particles such as large sand;“+++”.Appearing more aggregated particles,liquid is completely transparent with 75% agglutination;“++”.Agglutination particles such as sand granular,the liquid is not completely transparent with 50% agglutination;“+”.Liquid is turbid, there are fewer small pellets with 25% agglutination;“-”.Liquid is evenly turbid,no aggregate.

2.4 副豬嗜血桿菌平板凝集試驗(yàn)方法的特異性

特異性試驗(yàn)結(jié)果表明，兔陰性血清對(duì)照組、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌陽(yáng)性血清和豬鏈球菌陽(yáng)性血清無(wú)凝集現(xiàn)象；兔副豬嗜血桿菌陽(yáng)性血清試驗(yàn)組100%凝集，說(shuō)明副豬嗜血桿菌平板凝集試驗(yàn)方法具有良好的特異性。

2.5 副豬嗜血桿菌平板凝集試驗(yàn)方法對(duì)臨床樣品的檢測(cè)

對(duì)7個(gè)豬場(chǎng)和神木縣部分散養(yǎng)戶的282份血清樣進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)合表4結(jié)果及發(fā)病情況可知：(1) 檢測(cè)出為陽(yáng)性血清的豬，臨床表現(xiàn)為被毛粗亂、消瘦、體溫升高、關(guān)節(jié)腫脹、呼吸困難；剖檢可觀察到胸腔內(nèi)纖維素性滲出嚴(yán)重，肺與胸腔壁黏連，胸腹腔積液較多，出現(xiàn)典型的絨毛心，脾臟梗死，肝臟有大量的出血斑等典型的副豬嗜血桿菌臨床癥狀。檢測(cè)結(jié)果與病豬剖檢結(jié)果相符，表明試驗(yàn)結(jié)果可靠。進(jìn)一步證明，建立的副豬嗜血桿菌平板凝集試驗(yàn)方法具有較強(qiáng)的臨床實(shí)用性。

(2)供檢豬場(chǎng)均有副豬嗜血桿菌檢出，其中關(guān)中3個(gè)豬場(chǎng)(扶風(fēng)某豬場(chǎng)、寶雞某豬場(chǎng)和華縣某豬場(chǎng))平均陽(yáng)性檢出率為81.5%，陜南1個(gè)豬場(chǎng)(勉縣某豬場(chǎng))陽(yáng)性檢出率為64.3%，陜北神木縣3個(gè)豬場(chǎng)的平均陽(yáng)性率達(dá)到60.1%。表明陜西已有副豬嗜血桿菌病流行，且流行覆蓋面較廣。

(3)發(fā)病季節(jié)多集中在秋冬、冬春冷熱交替的季節(jié)，說(shuō)明副豬嗜血桿菌病在秋冬、冬春冷熱交替的季節(jié)較其他時(shí)間更容易發(fā)生。另外，檢測(cè)血清多為31～70日齡保育舍發(fā)病豬，表明4～10周齡豬更容易感染此病。

(4)神木縣散養(yǎng)戶豬場(chǎng)的50份血清中陽(yáng)性血清3份，陽(yáng)性率為6.0%；3個(gè)豬場(chǎng)的153份血清，檢出副豬嗜血桿菌陽(yáng)性血清92份，陽(yáng)性檢出率為60.1%。此結(jié)果表明，副豬嗜血桿菌病在散養(yǎng)戶豬場(chǎng)的發(fā)病率明顯低于集約化豬場(chǎng)。因此，要求集中飼養(yǎng)的豬場(chǎng)在管理與疫病防控方面更要重視，以避免副豬嗜血桿菌的規(guī)模集中感染。

3 討 論

檢測(cè)副豬嗜血桿菌的方法很多，如用滅活的副豬嗜血桿菌菌體作為包被抗原的ELISA法、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)以及多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)法等[9-10]，另外，林雪玲等[11]還建立了副豬嗜血桿菌的快速聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)診斷技術(shù)，可對(duì)該病作出迅速的診斷。這些方法具有較強(qiáng)特異性和較高敏感性，但檢測(cè)成本較高。本試驗(yàn)采用平板凝集試驗(yàn)法檢測(cè)副豬嗜血桿菌血清抗體，雖然與上述幾種方法相比，特異性和敏感性稍差，但操作簡(jiǎn)便快捷、易掌握、成本低，可對(duì)該病作出快速的診斷。本試驗(yàn)所用菌株是由西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院傳染病實(shí)驗(yàn)室從陜西關(guān)中地區(qū)豬場(chǎng)中分離得到，是陜西地區(qū)流行的菌株。本試驗(yàn)制備的抗原可檢測(cè)出陜西地區(qū)副豬嗜血桿菌陽(yáng)性血清，可用于區(qū)別感染豬與非感染豬，也可用于陜西地區(qū)豬場(chǎng)副豬嗜血桿菌臨床快速診斷和流行病學(xué)調(diào)查。

通過(guò)對(duì)陜西地區(qū)一些豬場(chǎng)及散養(yǎng)戶豬的血清抗體檢測(cè)，了解和掌握了陜西地區(qū)副豬嗜血桿菌病的流行情況，對(duì)陜西地區(qū)該病的預(yù)防和控制有一定的指導(dǎo)價(jià)值。本研究結(jié)果顯示，副豬嗜血桿菌病已成為陜西地區(qū)普遍流行的疾病，應(yīng)提高警惕，加強(qiáng)防治管理。此外，規(guī)模豬場(chǎng)集中飼養(yǎng)的豬感染Hps的比率明顯高于散戶，說(shuō)明集中飼養(yǎng)更容易造成豬的成批感染[12]；另外，從采樣豬發(fā)病的時(shí)間可以看出，該病在秋冬、冬春等冷熱交替的季節(jié)更容易發(fā)生。因此，氣候變化時(shí)，豬場(chǎng)更應(yīng)該注意加強(qiáng)飼養(yǎng)管理[13]。豬場(chǎng)可利用“二點(diǎn)三點(diǎn)法”飼喂，即將豬場(chǎng)分散在不同的地點(diǎn)，按照豬成長(zhǎng)階段分批分群飼養(yǎng)在不同的地點(diǎn)，以避免疫病的交叉感染[14]。具體操作方法為:哺乳仔豬在21 d前斷乳，然后將其轉(zhuǎn)移飼養(yǎng)到另外一個(gè)生產(chǎn)區(qū)，并對(duì)該生產(chǎn)區(qū)徹底消毒，保持豬舍干凈清潔，以減少病原微生物，使仔豬處于較好的環(huán)境中生長(zhǎng)發(fā)育，而且此時(shí)仔豬體內(nèi)的特殊疾病免疫抗體還沒(méi)有完全消失，具有較好的抵抗力[15]。

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Establishment and application of plate agglutination method for detecting antibody againstHaemophilusparasuis

GAO Yan,ZHANG Ding-quan,YANG Zeng-qi,LIANG Liu-cun,LIU Hai-jin,WU Peng-peng,GAO Xiao-long,CHANG Xu-dong,DU En-qi

(CollegeofVeterinaryMedicine,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

【Objective】 This study aimed to establish a rapid method for detecting antibody of Hps and prepare the plate agglutination antigen for the detection of serum Hps antibody. 【Method】 9 Hps strains (Ea,Ec,Ew,A1,A2,B1,B2,C1,and C2) stored in the infectious disease lab were revived and serum antibodies of immunizing rabbits was prepared.Then the plate agglutination method for detecting serum Hps antibody was established and the specificity,sensitivity,and best working concentration were decided.【Result】 Ew strain was selected as the strain for generating antigen.The plate agglutination method for detecting antibody againstHaemophilusparasuiswas successfully established.The method had good specificity and sensitivity,and the suitable working concentration of antigen was 8×109CFU/mL.The test results of clinical serum samples with the clinical diagnosis were basically the same.【Conclusion】 The established plate agglutination method of Hps measurement diagnosed Gl?sser’s disease more rapidly and accurately.The results also showed that the Hps infection rate of scale pig farm was higher than that of scattered farms in Shaanxi.

Haemophilusparasuis;antigen preparation;agglutination;antibody detection

2013-09-13

陜西省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新項(xiàng)目(2011NXC01-10)

高 艷(1986-)，女，陜西榆林人，在讀碩士，主要從事動(dòng)物傳染病的診斷與防制研究。E-mail：616291725@qq.com

楊增岐(1963-)，男，陜西岐山人，教授，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事動(dòng)物疫病診斷與防制研究。 E-mail:yzq1106@nwsuaf.edu.cn

時(shí)間:2014-12-12 09:30

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.01.028

S853.31

A

1671-9387(2015)01-0021-05

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