基于細(xì)胞3D打印技術(shù)的體外腫瘤模型構(gòu)建研究

石 然 徐銘恩 周青青 羅 莉 李 歡 鄭淵悅

(杭州電子科技大學(xué)生命信息與儀器工程學(xué)院，杭州 310018)

?

基于細(xì)胞3D打印技術(shù)的體外腫瘤模型構(gòu)建研究

石 然 徐銘恩*周青青 羅 莉 李 歡 鄭淵悅

(杭州電子科技大學(xué)生命信息與儀器工程學(xué)院，杭州 310018)

細(xì)胞在三維環(huán)境中的形態(tài)、功能、基因表達(dá)等生理特性與二維培養(yǎng)存在顯著差異，因此構(gòu)建與體內(nèi)生長環(huán)境相似的三維細(xì)胞培養(yǎng)模型對腫瘤研究有極其重要的作用。利用細(xì)胞3D打印技術(shù)，將人卵巢癌細(xì)胞/明膠/海藻酸鈉在體外定位裝配成三維類腫瘤組織模型。首先利用MTT比色法檢測了細(xì)胞3D打印過程對卵巢癌細(xì)胞存活率的影響，其次利用Alamar Blue法檢測了第1、3、5、7 d卵巢癌細(xì)胞在二維平面培養(yǎng)和三維結(jié)構(gòu)體中的增殖情況，最后利用qPCR技術(shù)比較了卵巢癌細(xì)胞在二維和三維培養(yǎng)下p53和bcl-2的表達(dá)差異。結(jié)果表明：細(xì)胞3D打印過程對卵巢癌細(xì)胞活性的損傷很小，細(xì)胞存活率為95%以上；相比二維平面培養(yǎng)，卵巢癌細(xì)胞在三維結(jié)構(gòu)體中起初增殖速度較慢，但在第5 d之后增殖速度加快，而二維培養(yǎng)的細(xì)胞由于接觸抑制增殖緩慢，出現(xiàn)脫落死亡；第5和第7 d二維和三維培養(yǎng)下細(xì)胞中p53和bcl-2基因表達(dá)有顯著性差異(P<0.05)。研究證明，構(gòu)建具有功能性組織結(jié)構(gòu)和體內(nèi)更相似的三維系統(tǒng)，可為腫瘤研究提供新的模型。

細(xì)胞3D打印；水凝膠；腫瘤模型；卵巢癌

引言

惡性腫瘤是嚴(yán)重威脅人類健康的疾病之一，但目前對于惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展機制仍沒有充分認(rèn)識，嚴(yán)重影響了患者的預(yù)后和治療[1]。臨床試驗是研究腫瘤和抗腫瘤藥物篩選最有效的方法，但由于倫理和安全因素并不能得到廣泛推廣[2]。為克服這一困難，傳統(tǒng)的二維平面培養(yǎng)細(xì)胞模型得到廣泛應(yīng)用，它能夠模擬人類腫瘤的部分生理生化特性，有助于了解腫瘤的部分發(fā)生發(fā)展機制。然而，二維平面培養(yǎng)細(xì)胞模型由于缺乏細(xì)胞/胞外基質(zhì)在三維環(huán)境下的相互作用，腫瘤細(xì)胞的形態(tài)和功能在體外發(fā)生了一定的改變，因此該模型并不能完全真實模擬體內(nèi)腫瘤。

細(xì)胞3D打印技術(shù)[3-4]是近年來發(fā)展起來的一門新興技術(shù)，建立在計算機3D建模和先進制造離散堆積理論基礎(chǔ)上，在計算機的控制下，以活細(xì)胞為操控對象，能夠按照預(yù)先設(shè)計的3D模型準(zhǔn)確定位與輸送細(xì)胞/細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)材料復(fù)合物，為構(gòu)建復(fù)雜仿生結(jié)構(gòu)的組織模型研究提供了新的技術(shù)可能。由于細(xì)胞3D打印的材料為勻質(zhì)的細(xì)胞/細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)合物，能有效克服細(xì)胞直接接種到支架上所帶來的接種密度不足和細(xì)胞分布不均勻的問題[5]，有助于建立細(xì)胞間通訊和促進細(xì)胞增殖。細(xì)胞三維打印已在體外骨組織模型[6]、體外肝臟組織模型[7]、脂肪組織[8]以及具有血管狀結(jié)構(gòu)的混合型組織模型[9]構(gòu)建上得到了應(yīng)用，但在建立體外三維腫瘤模型領(lǐng)域的研究還較少。

本研究借助細(xì)胞3D打印技術(shù)，以明膠、海藻酸鈉和卵巢癌細(xì)胞復(fù)合物為打印材料，構(gòu)建了可模擬體內(nèi)腫瘤生長微環(huán)境的卵巢癌三維模型。首先檢測了打印過程中細(xì)胞的存活率，其次與二維平面培養(yǎng)細(xì)胞模型做比較，檢測了兩種模型培養(yǎng)過程下細(xì)胞增殖的情況，同時還檢測了與細(xì)胞增殖相關(guān)的基因(p53和bcl-2)表達(dá)情況。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

RPMI 1640培養(yǎng)基、優(yōu)級胎牛血清、明膠、海藻酸鈉、熒光倒置顯微鏡(CKX41)、ABI 7300 實時熒光定量PCR儀、掃描電子顯微鏡(JSM-6460，JEOL)、酶聯(lián)免疫檢測儀(Thermo)、細(xì)胞3D打印機(杭州捷諾飛生物科技有限公司)。

1.2 卵巢癌三維結(jié)構(gòu)體打印

卵巢癌的模型結(jié)構(gòu)如圖1(a)所示。取明膠和海藻酸鈉粉末，分別溶于超純水中，配成濃度為20%(w/v)的明膠溶液和10%(w/v)的海藻酸鈉溶液。將明膠溶液、海藻酸鈉溶液和卵巢癌單細(xì)胞懸液按體積比為5∶5∶1混合均勻，得到密度約為106cells/mL的細(xì)胞/基質(zhì)材料混合物，置于細(xì)胞3D打印機的成型室中準(zhǔn)備打印。 打印溫度為8℃，模型尺寸大小為10×10×2 mm3。打印好的卵巢癌三維結(jié)構(gòu)體如圖1(b)所示。

圖1 卵巢癌模型。(a)卵巢癌三維模型; (b)打印好的卵巢癌三維結(jié)構(gòu)體Fig.1 Ovarian tumor model. (a) Schematic of three-dimensional ovarian tumor model (b) Finished three-dimensional ovarian tumor construct

1.3 卵巢癌三維結(jié)構(gòu)體分析

1.3.1 細(xì)胞存活率

利用MTT比色法檢測打印過程中細(xì)胞的存活率。分別取大小相同的打印過程初和打印過程末的細(xì)胞/材料混合物支架(n=3)，每孔分別加入MTT終濃度為0.5 mg/ mL的培養(yǎng)基，在CO2培養(yǎng)箱中孵育12 h后加入DMSO溶液溶解。用酶標(biāo)儀分別檢測兩組溶液在570、630 nm處的吸光度(OD值)。設(shè)打印過程初三維結(jié)構(gòu)體中細(xì)胞的存活率為100%，則打印過程末細(xì)胞存活率為

同時，利用活、死細(xì)胞活力/毒性檢測試劑盒來檢測剛打印出的三維腫瘤結(jié)構(gòu)體，在熒光顯微鏡下觀察。

1.3.2 二維平面培養(yǎng)和三維結(jié)構(gòu)體中細(xì)胞的增殖

利用Alamar Blue法檢測二維平面培養(yǎng)和三維立體培養(yǎng)下細(xì)胞的增殖。將打印好的三維腫瘤結(jié)構(gòu)體進行培養(yǎng)，總計7 d。分別在第1、3、5、7 d時換液，加入與培養(yǎng)基體積比為1∶10 的Alamar Blue試劑，并在培養(yǎng)箱中孵育4 h后用酶標(biāo)儀檢測570 nm處的OD值。

二維平面培養(yǎng)的細(xì)胞以每孔密度為2 000 cells/mL接種于24孔板中，分別在相同的時間點用Alamar Blue試劑檢測OD值。三維腫瘤結(jié)構(gòu)體和二維平面培養(yǎng)的細(xì)胞分別在體外培養(yǎng)4 h后，用Alamar Blue試劑檢測在570 nm處的OD值，用于上述第1、3、5、7 d檢測值的歸一化處理。

1.3.3 三維腫瘤結(jié)構(gòu)體內(nèi)細(xì)胞的分布和形態(tài)

首先在光學(xué)顯微鏡下觀察第1、3、5、7 d時三維腫瘤結(jié)構(gòu)體內(nèi)細(xì)胞的形態(tài)。同時，在相同的時間點，取出三維腫瘤結(jié)構(gòu)體并用10%多聚甲醛固定2.5 h后梯度脫水、二甲苯透明，石蠟包埋后將樣品切成10 μm切片，最后蘇木精和伊紅染色，脫水封固，在顯微鏡下觀察結(jié)構(gòu)體中細(xì)胞的分布和形態(tài)。

1.3.4 實時熒光定量PCR分析

采用實時熒光定量PCR檢測二維平面培養(yǎng)和三維結(jié)構(gòu)體中細(xì)胞內(nèi)p53和bcl-2基因的表達(dá)情況。分別取第1、3、5、7 d的卵巢癌貼壁細(xì)胞，加入TRIzol裂解液，按試劑說明進行總RNA提取。將抽提出的總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈，分裝后置于-20℃冰箱備用。利用SYBR Green實時熒光定量PCR試劑盒(TaKaRa)在ABI 7300熒光定量PCR儀上進行PCR擴增與熒光檢測。分別取第1、3、5、7 d培養(yǎng)的三維腫瘤結(jié)構(gòu)體(n=3)，在每個樣品中分別加入TRIzol裂解液，用勻漿器勻漿后，離心取上清至EP管中，按照說明進行后續(xù)總RNA提取。逆轉(zhuǎn)錄步驟及熒光定量PCR步驟如前所述。

用ΔΔCT法[10]分析二維平面培養(yǎng)和三維立體培養(yǎng)下細(xì)胞內(nèi)目的基因的表達(dá)差異。

引物序列表示如下：

β-actin：Forward 5′-GTGGACATCCGCAAAGAC-3′ Reverse 5′-GAAAGGGTGTAACGCAACT-3′

p53：Forward 5′-CAGCACATGACGGAGGTTGT-3′ Reverse 5′-TCATCCAAATACTCCACACGC-3′

bcl-2：Forward 5′-GGTGGGGTCATGTGTGTGG-3′ Reverse 5′-CGGTTCAGGTACTCAGTCATCC-3′

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析采用t檢驗，以P<0.05作為差別有顯著性意義。

2 結(jié)果

2.1 三維腫瘤結(jié)構(gòu)體建立

由圖2可以看出，打印過程初和打印過程末三維結(jié)構(gòu)體內(nèi)細(xì)胞的活性差異較小(P>0.05)。打印過程初檢測的OD值為1.14±0.013，打印過程末檢測的OD值為1.080±0.016，按前述的細(xì)胞存活率計算公式可得細(xì)胞存活率為95%以上。圖3為倒置熒光顯微鏡下拍攝的熒光圖片，其中，活細(xì)胞被染成綠色熒光，死細(xì)胞被染成紅色熒光。由圖可看出，紅色熒光很少，即三維結(jié)構(gòu)體中死細(xì)胞的數(shù)目很少，也證明了細(xì)胞的存活率很高。

圖2 打印過程中細(xì)胞存活率檢測Fig.2 Cell survival rate in printing process (n=3)

圖3 利用活、死細(xì)胞活力/毒性檢測試劑盒檢測三維結(jié)構(gòu)體內(nèi)細(xì)胞活性，其中活細(xì)胞被染成綠色熒光，死細(xì)胞被染成紅色熒光。Fig.3 Cell viability in 3D construct after printing measured by live & Dead viability/cytotoxicity assay kit,live cells were stained in green and dead cells were stained in red.

2.2 二維和三維培養(yǎng)下細(xì)胞的增殖

增殖曲線如圖4所示?？梢钥闯觯诘?d之前，二維平面培養(yǎng)的細(xì)胞比三維培養(yǎng)的細(xì)胞增殖速度快，我們認(rèn)為這種現(xiàn)象是由于細(xì)胞在三維模型的環(huán)境中存在一個適應(yīng)期，適應(yīng)期過后，細(xì)胞增殖速度呈上升趨勢，而二維平面培養(yǎng)的細(xì)胞由于出現(xiàn)接觸抑制，增殖速度明顯減慢并停止生長。

圖4 Alamar Blue 法檢測二維和三維培養(yǎng)下卵巢癌細(xì)胞的增殖曲線(增殖速率用T/T0表示)Fig.4 Proliferation rate of ovarian cancer cells in 3-D hydrogels and on cell culture plates (2-D) measured by Alamar Blue assay. (Fold increase is represented by T/T0，n=3)

2.3 三維結(jié)構(gòu)體中細(xì)胞的分布與形態(tài)

在顯微鏡下可以看出(見圖5)，隨著培養(yǎng)時間增加，三維模型內(nèi)的細(xì)胞成團生長，為立體球形結(jié)構(gòu)，與二維平面培養(yǎng)的短梭形細(xì)胞形態(tài)有明顯差異。為了進一步驗證二維和三維培養(yǎng)下細(xì)胞形態(tài)的不同，采用H&E染色方法觀察。由圖6可以看出，細(xì)胞不僅成團生長，而且均勻分布在模型中。

圖5 光學(xué)顯微鏡觀察不同培養(yǎng)天數(shù)下三維結(jié)構(gòu)體中卵巢癌細(xì)胞的形態(tài)(其中黑色小點為細(xì)胞)。(a) 第1 d；(b) 第3 d；(c) 第5 d；(d) 第7 dFig.5 Ovarian cancer cellular morphology in 3D constructs on different culturing day observed by light microscope. (a) Day 1; (b) Day 3; (c) Day 5; (d) Day 7

圖6 H&E染色觀察不同培養(yǎng)天數(shù)下三維結(jié)構(gòu)體中卵巢癌細(xì)胞的形態(tài)。(a) 第1 d；(b) 第3 d；(c) 第5 d；(d) 第7 dFig.6 Ovarian cancer cellular morphology in 3D constructs on different culturing day observed by H&E staining. (a) Day 1; (b) Day 3; (c) Day 5; (d) Day 7

2.4 p53和bcl-2表達(dá)

圖7 二維和三維培養(yǎng)下細(xì)胞內(nèi)p53和bcl-2基因在第1,3,5和7 d的表達(dá)差異(*P<0.05)。(a) p53; (b) bcl-2Fig.7 p53 and bcl-2 gene expression differences in 3D construct and 2D plates on day 1，3，5 and 7(n=3). (a) p53; (b) bcl-2

由圖7可以看出，二維平面培養(yǎng)和三維立體培養(yǎng)下p53和bcl-2的表達(dá)量不同。由圖7(a)可以看出，隨著培養(yǎng)時間增加，三維培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)p53基因表達(dá)量下調(diào)，第5d和第7d與二維平面培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)p53基因表達(dá)差異較大(P<0.05)。隨著培養(yǎng)時間增加，三維培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)bcl-2基因表達(dá)量上調(diào)，其中第5d和第7d與二維平面培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)差異較大(P<0.05)。

3 討論與結(jié)論

體外三維細(xì)胞培養(yǎng)模型在腫瘤發(fā)生發(fā)展機制及抗腫瘤藥物篩選研究中起到越來越重要的作用。筆者利用細(xì)胞3D打印技術(shù)，將卵巢癌細(xì)胞/明膠/海藻酸鈉在體外定位組裝成三維類腫瘤組織結(jié)構(gòu)體，并從細(xì)胞形態(tài)和功能兩方面對其進行了研究。

利用細(xì)胞3D打印技術(shù)體外構(gòu)建類腫瘤組織模型，其中細(xì)胞存活率是關(guān)鍵因素之一。在本研究中，利用MTT比色法對打印過程初和打印過程末混合材料中的細(xì)胞活性進行比較，結(jié)果表明打印過程對細(xì)胞活性幾乎沒有影響，細(xì)胞存活率為95%以上。同二維平面培養(yǎng)的細(xì)胞相比，三維結(jié)構(gòu)體中細(xì)胞的形態(tài)、增殖以及一些基因的表達(dá)均有很大差異。首先在光學(xué)顯微鏡下觀察二維和三維培養(yǎng)環(huán)境下細(xì)胞的形態(tài)，其中二維平面培養(yǎng)的細(xì)胞呈短梭形，而三維模型中的細(xì)胞則會隨著培養(yǎng)時間的增加成團生長(見圖5(d))，呈立體球狀結(jié)構(gòu)，與體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的生長方式類似。為進一步驗證，H&E染色分析(見圖6)，結(jié)果與顯微鏡下觀察一致。二維平面培養(yǎng)和三維結(jié)構(gòu)體內(nèi)細(xì)胞的增殖情況也不同(見圖4)：二維平面培養(yǎng)的細(xì)胞隨著培養(yǎng)天數(shù)增加，在第5d出現(xiàn)接觸抑制，增殖速度減慢，最后停止增殖，細(xì)胞開始脫落死亡；三維培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞，相對二維平面培養(yǎng)的細(xì)胞，在培養(yǎng)初期增殖速度較慢，但第5d之后，細(xì)胞增殖速度明顯加快。細(xì)胞增殖是受一系列基因調(diào)控的，其中bcl-2[11]是細(xì)胞增殖相關(guān)基因研究中研究最多的一類，它可以促進細(xì)胞增殖；而p53是重要的腫瘤抑制基因[12]，能夠抑制細(xì)胞增殖。由圖7可以看出，三維培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)p53和bcl-2基因在第5和7d與二維平面培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)有較大差異，p53基因表達(dá)下調(diào)，bcl-2基因表達(dá)上調(diào)。筆者猜測，隨著培養(yǎng)時間增加，二維和三維培養(yǎng)環(huán)境下細(xì)胞中p53和 bcl-2基因表達(dá)的差異引起了細(xì)胞增殖情況的不同(見圖4)。

本研究表明，利用細(xì)胞3D打印技術(shù)可以在體外構(gòu)建準(zhǔn)確的類腫瘤模型，為腫瘤發(fā)生發(fā)展機制和抗腫瘤藥物研究提供了新的模型。

[1] Vargo-Gogola T, Rosen JM. Modelling breast cancer: one size does not fit all [J]. Nature Reviews Cancer, 2007, 7(9): 659-672.

[2] Zhao Y, Yao R, Ouyang L,etal. Three-dimensional printing of Hela cells for cervical tumor model in vitro [J]. Biofabrication, 2014, 6(3): 035001.

[3] Wang X, Yan Y, Zhang R. Rapid prototyping as a tool for manufacturing bioartificial livers[J]. Trends in Biotechnology, 2007, 25(11): 505-513.

[4] 胡金夫，徐銘恩，徐瑩，等. 基于細(xì)胞三維受控組裝技術(shù)的細(xì)胞芯片構(gòu)建[J]. 中國生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)報, 2012, 31(3): 374-381.

[5] Stephens JS, Cooper JA, Phelan FR,etal. Perfusion flow bioreactor for 3Dinsituimaging: investigating cell/biomaterials interactions [J]. Biotechnology and Bioengineering, 2007, 97(4): 952-961.

[6] Fedorovich NE, De Wijn JR, Verbout AJ,etal. Three-dimensional fiber deposition of cell-laden, viable, patterned constructs for bone tissue printing [J]. Tissue Engineering Part A, 2008, 14(1): 127-133.

[7] Chang R, Emami K, Wu H,etal. Biofabrication of a three-dimensional liver micro-organ as an in vitro drug metabolism model [J]. Biofabrication, 2010, 2(4): 045004.

[8] Yao R, Zhang R, Yan Y,etal. In vitro angiogenesis of 3D tissue engineered adipose tissue [J]. Journal of Bioactive and Compatible Polymers, 2009, 24(1): 5-24.

[9] Li S, Xiong Z, Wang X,etal. Direct fabrication of a hybrid cell/hydrogel construct by a double-nozzle assembling technology [J]. Journal of Bioactive and Compatible Polymers, 2009, 24(3): 249-265.

[10] Schmittgen TD, Livak KJ. Analyzing real-time PCR data by the comparative CTmethod [J]. Nature Protocols, 2008, 3(6): 1101-1108.

[11] Szegezdi E, Logue SE, Gorman AM,etal. Mediators of endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis[J]. EMBO Reports, 2006, 7(9): 880-885.

[12] Aloni-Grinstein R, Shetzer Y, Kaufman T,etal. p53: the barrier to cancer stem cell formation [J]. FEBS Letters, 2014, 588(16): 2580-2589.

Research of Bioengineered Tumor ModelinvitroBased on Three-Dimensional Cell Printing Technique

Shi Ran Xu Mingen*Zhou Qingqing Luo Li Li Huan Zheng Yuanyue

(CollegeofLifeInformationScience&InstrumentEngineering,HangZhouDianZiUniversity,Hangzhou310018)

3D cell printing; hydrogel; tumer model; ovarian cancer

10.3969/j.issn.0258-8021. 2015. 05.014

2014-11-25， 錄用日期:2015-03-30

國家自然科學(xué)基金(KYZ193713071)

R318

D

0258-8021(2015) 05-0618-05

*通信作者(Corresponding author)， E-mail: xumingen@hdu.edu.cn