孕馬尿中3種主要結(jié)合雌激素含量一測多評(píng)新方法研究

姚 軍李東雨張煌濤鹿 毅高曉黎

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830054；2.新疆維吾爾自治區(qū)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，新疆 烏魯木齊 830004）

孕馬尿中3種主要結(jié)合雌激素含量一測多評(píng)新方法研究

姚 軍1，2，李東雨1，張煌濤2，鹿 毅2，高曉黎1

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830054；2.新疆維吾爾自治區(qū)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，新疆 烏魯木齊 830004）

建立基于質(zhì)譜檢測的一測多評(píng)（QAMS)測定孕馬尿中3種主要結(jié)合雌激素方法。樣品經(jīng)大孔吸附樹脂固相萃取小柱凈化，利用HPLC-MS進(jìn)行檢測，以雌酮硫酸鈉為內(nèi)標(biāo)，測定馬烯雌酮硫酸鈉及17α-雙氫馬烯雌酮硫酸鈉的相對(duì)校正因子，進(jìn)行3種成分的含量測定。結(jié)果表明，3種成分的線性、精密度、穩(wěn)定性及回收率均較好。馬烯雌酮硫酸鈉及17α-雙氫馬烯雌酮硫酸鈉的相對(duì)校正因子分別為0.8663和0.9884。色譜柱、碎片電壓等均對(duì)校正因子影響較小，兩種方法測定10批孕馬尿樣品中的3種結(jié)合雌激素含量，無顯著性差異，該方法在測定孕馬尿中3種主要結(jié)合雌激素方面有更大的優(yōu)勢。

結(jié)合雌激素；一測多評(píng)；LC-MS；相對(duì)校正因子

0 引 言

孕馬結(jié)合雌激素作為激素補(bǔ)充療法（hormonere placement therapy，HRT)的重要藥物已經(jīng)得到普遍應(yīng)用[1]，惠氏制藥公司生成的倍美力、倍美安、倍美盈等藥物中雌激素均為從孕馬尿中獲得。孕馬雌激素是一類雌激素硫酸鈉鹽的混合物，被稱為結(jié)合雌激素（conjugated estrogens，CE)，種類較多，其中以雌酮硫酸鈉（sodium estrone sulfate，ES)、馬烯雌酮硫酸鈉（sodium equilin sulfate，EqS)、17α-雙氫馬烯雌酮硫酸鈉（sodium 17α-dihydroequilin sulfate，17α-EqS)為主，3者占結(jié)合雌激素總含量的90%以上，這3種成分是美國藥典及歐盟藥典作為孕馬CE藥物含量測定的質(zhì)控成分[2]。

新疆伊犁河谷是我國馬匹資源最為豐富的地區(qū)，當(dāng)?shù)財(cái)?shù)量眾多的孕馬資源使得提取孕馬CE成為可能，在伊犁河谷已經(jīng)有制藥企業(yè)研發(fā)CE藥物。在孕馬尿原料、中間體、原料藥及制劑等含量檢測方面均需要測定其中主要的結(jié)合雌激素，但由于CE對(duì)照品合成困難，均需要從國外購買，售價(jià)高昂，尤其是EqS、17α-EqS的獲得更為困難；因此，一測多評(píng)成為解決對(duì)照品短缺的方法之一。本課題組已經(jīng)建立了一測多評(píng)HPLC-UV法測定孕馬尿中主要CE的方法[3]，但由于馬尿樣品成分復(fù)雜，在實(shí)際檢測過程中發(fā)現(xiàn)部分馬尿樣品中這3種主要待測組分分離不佳，存在定量誤差較大、定性不可靠的情況，使得該方法在實(shí)際應(yīng)用方面受到限制，這也是復(fù)雜樣品中利用HPLC-UV一測多評(píng)方法的不足之處。本實(shí)驗(yàn)建立的基于MS檢測的一測多評(píng)新方法能夠很好地解決以上問題，在實(shí)際檢測過程具有更大的優(yōu)勢。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

1100型LC-MS聯(lián)用儀（1100型高效液相系統(tǒng)，G1946C四級(jí)桿質(zhì)譜檢測器，配大氣壓電離源及電噴霧電離源，Agilent科技有限公司)；AB135-S電子分析天平（梅特勒托利多公司)；HERAEUS MULTIFUGE X3R高速冷凍離心機(jī)（Thermo scientific公司)；Milli-Q超純水處理系統(tǒng)（Millipore公司)。

乙腈為色譜純；醋酸銨為優(yōu)級(jí)純；乙醇、氯化鈉、氫氧化鈉均為分析純；超純水（≥18.2mΩ)；大孔樹脂 （上海摩速公司，HPD-400型)；ES、EqS及17α-EqS對(duì)照品（新疆新姿源生物制藥公司提供，純度≥99.0%)；10批孕馬尿樣品來自新疆伊犁新源縣土爾根鄉(xiāng)牧戶，均為懷孕母馬尿液，編號(hào)1#～10#。

1.2 方法原理

一測多評(píng)法（quantitative analysis of multi-components with single marker，QAMS)是指在多指標(biāo)質(zhì)量評(píng)價(jià)時(shí)，以藥材中某一典型組分為內(nèi)標(biāo)，測定該成分與其他成分間的相對(duì)校正因子，通過相對(duì)校正因子計(jì)算其他成分含量，各成分相對(duì)校正因子計(jì)算公式如下：fks=fk/fs=Wk×As/（Ws×Ak)（式中Wk為內(nèi)標(biāo)物濃度；Ak為內(nèi)標(biāo)物面積；Ws為組分S的濃度；As為組分S的峰面積)[4]。本實(shí)驗(yàn)采用MS作為檢測器，以ES為內(nèi)標(biāo)，測定EqS及17α-EqS的相對(duì)校正因子并計(jì)算其含量。該方法測定的原理是基于3種CE化學(xué)結(jié)構(gòu)相似，如圖1所示，在一定碎片電壓下采用ESI源、負(fù)離子模式，其產(chǎn)生準(zhǔn)分子離子[M-Na+]的能力相似。在一定條件下各組分校正因子為一相對(duì)固定值。

圖1 ES、EqS、17α-EqS化學(xué)結(jié)構(gòu)

1.3 溶液制備

1.3.1 結(jié)合雌激素對(duì)照品溶液制備

精密稱取ES、EqS和17α-EqS對(duì)照品適量，用50%的甲醇水溶液配制成質(zhì)量濃度分別為300，150，100μg/mL的儲(chǔ)備液。精密吸取上述3種對(duì)照品儲(chǔ)備液各2.00mL，置于同一50mL量瓶中，50%甲醇水溶液定容，制得ES、EqS、17α-EqS濃度分別為12.00，6.00，4.00 μg/mL的混合對(duì)照品溶液，分別精密吸取上述混合對(duì)照品溶液0.2，1.0，2.0，4.0，8.0，10.0 mL置于10mL量瓶中，50%甲醇水溶液定容，作為混合對(duì)照品系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.2 供試品溶液制備

固相萃取小柱：取5mL注射器管，1.0g HPD-400大孔吸附樹脂干法裝填，5 mL無水乙醇活化，之后5mL純水，重力作用下洗脫。

取5 mL孕馬尿于高速離心機(jī)5 000 r/min離心5min，精密吸取上清液1.00mL，緩慢滴入固相萃取小柱中，用4mL 5%NaCl溶液淋洗，再用4mL 1.5% NaOH溶液淋洗，棄去流出液，再用乙醇洗脫并收集流出液至10mL，搖勻，過0.22μm濾膜，作為孕馬尿供試品溶液。

1.4 色譜、質(zhì)譜檢測條件

色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱（4.6mm×150mm×5μm)；以乙腈-0.01mol/L醋酸銨（30∶70，ν/ν)為流動(dòng)相；柱溫為35℃；流量為1.0mL/min，柱后分流：分流比2∶3，0.4 mL/min進(jìn)質(zhì)譜；進(jìn)樣體積：10μL。

采用選擇離子（SIM)掃描模式，選擇m/z349，347；ESI離子源；負(fù)離子檢測；碎片電壓：80V；霧化氣（N2)壓力為35 psi（1 psi=6.895 kPa)，干燥氣（N2)流量10.0 mL/min，干燥氣溫度350℃，毛細(xì)管電壓3500V。

在該條件下，對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性樣品（不含3種CE的馬尿)的總離子流圖（TIC)見圖2，由SIM的總離子流圖可以看出，由于只選擇ES、EqS及17α-EqS的特征碎片離子的質(zhì)荷比m/z為349、347、349，3種主要CE的分離情況較好，分離度＞1.5，陰性樣品無干擾。如果檢測過程隨柱效降低，EqS和ES無法基線分離，可以采用在TIC圖中進(jìn)行提取離子色譜（EIC)進(jìn)行處理，能夠得到各組分準(zhǔn)確峰面積，而孕馬尿中其他成分不會(huì)產(chǎn)生干擾。

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)果

2.1.1 線性方程

分別取“1.3.1”項(xiàng)下系列標(biāo)準(zhǔn)溶液10 μL進(jìn)樣，按“1.4”項(xiàng)下條件檢測，以測得的峰面積與被測物的質(zhì)量濃度（μg/mL)進(jìn)行線性回歸，得ES、EqS、17α-EqS的線性方程及線性范圍如表1所示。結(jié)果表明3種CE線性良好。

2.1.2 精密度試驗(yàn)

另制備 ES、EqS、17α-EqS質(zhì)量濃度分別為200，100，75μg/mL的混合儲(chǔ)備液，稀釋為質(zhì)量濃度分別為8.00，4.00，3.00 μg/mL的ES、EqS、17α-EqS混合對(duì)照品溶液，進(jìn)樣5μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果ES、EqS、17α-EqS峰面積的RSD分別為1.18%，1.15%，1.08%。

表1 線性方程和線性范圍

圖2 對(duì)照品、供試品、陰性樣品的總離子流（TIC)圖

2.1.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取批號(hào)為1#孕馬尿樣品處理后的供試品溶液，分別于0，3，6，9，12，24h進(jìn)樣，記錄峰面積。結(jié)果ES、EqS、17α-EqS峰面積的RSD分別為1.82%、2.11%、1.73%。

2.1.4 重復(fù)性試驗(yàn)

取批號(hào)為1#孕馬尿樣品按“1.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品6份，分別進(jìn)樣5μL，記錄峰面積，計(jì)算含量，結(jié)果ES、EqS、17α-EqS含量平均值（n=6)分別為89.8，23.5，15.7μg/mL；RSD分別為0.70%、2.18%、1.92%。

2.1.5 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量批號(hào)為1#的孕馬尿樣品9份，每份5 mL，每3份為一組，置于10 mL容量瓶中，按高、中、低加入量分別加入ES、EqS、17α-EqS質(zhì)量濃度為200，100，75μg/mL的儲(chǔ)備液溶液各0.50，1.00，1.50mL后混勻，用純水定容，混勻，在“1.4”項(xiàng)色譜條件下測定，計(jì)算ES、EqS、17α-EqS的平均回收率，平均回收率分別為96.3%、95.7%和94.9%。

2.1.6 基質(zhì)效應(yīng)的考察

取“2.1.2”中ES、EqS、17α-EqS分別為8.00，4.00，3.00μg/mL的待測液；按“1.4”方法下測定，3種CE在上述兩種基質(zhì)中的峰面積分別為A1、A2、A3和B1、B2、B3，機(jī)制效應(yīng)ME（%)=A/B×100%，基質(zhì)效應(yīng)在93%～109%，說明基質(zhì)效應(yīng)影響較小。

2.1.7 相對(duì)校正因子的確定

1)CE相對(duì)校正因子的測定。取“1.3.1”項(xiàng)下系列標(biāo)準(zhǔn)溶液按“1.4”項(xiàng)下條件進(jìn)樣10μL，測定各組分的峰面積。分別測定10次，根據(jù)“1.2”項(xiàng)下公式分別計(jì)算EqS、17α-EqS與ES的相對(duì)校正因子，結(jié)果見表2。

表2 EqS、17α-EqS與ES的相對(duì)校正因子

2)相對(duì)校正因子重復(fù)性考察。取“2.1.2”儲(chǔ)備液制備ES、EqS、17α-EqS質(zhì)量濃度為1.60，0.80，0.60μg/mL的CE對(duì)照品溶液6份，分別進(jìn)樣2，4，6，8，10μL，測定EqS、17α-EqS的相對(duì)校正因子分別為0.869 3，0.992 0，RSD分別為 1.20%、1.92%，表明 EqS、17α-EqS相對(duì)校正因子重復(fù)性良好。

3)不同色譜柱對(duì)校正因子的影響。采用Agilent Eclipse XDB-C18、DiKMA Diamonsil C18、YMC-Pack ODS，均為4.6mm×150mm×5μm色譜柱，取ES、EqS、17α-EqS濃度分別為1.60，0.80，0.60μg/mL的CE對(duì)照品溶液6份，進(jìn)行測定，測得EqS、17α-EqS的相對(duì)校正因子分別為0.8618，0.9830，RSD分別為1.80%、2.20%，表明EqS、17α-EqS相對(duì)校正因子重復(fù)性良好。

4)LC-MS碎片電壓對(duì)相對(duì)校正因子的影響。采用碎片電壓分別為70，75，80，85，90 V，取ES、EqS、17α-EqS濃度分別為1.60，0.80，0.60μg/mL的CE對(duì)照品溶液，測定EqS、17α-EqS的相對(duì)校正因子分別為0.867 2，0.978 9，RSD分別為2.10%、2.30%，表明EqS、17α-EqS相對(duì)校正因子重復(fù)性良好。

5)兩種方法的比較。取孕馬尿樣品1#～10#，共10批，采用本實(shí)驗(yàn)建立一測多評(píng)方法進(jìn)行測定，同時(shí)采用3種待測物的對(duì)照品外標(biāo)法測定，兩種測定結(jié)果見表3，通過統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，兩種方法的檢測結(jié)果無顯著性差異。

表3 10批樣品中3種CE的測定結(jié)果

2.2 討 論

2.2.1 前處理方法的建立

本實(shí)驗(yàn)建立的大孔吸附樹脂為填料的SPE方法，適合孕馬尿樣品，加入5%的NaCl能夠使CE通過鹽析作用較好地被大孔吸附樹脂吸附，1.5%的NaOH溶液可以將馬尿中大量的酚類物質(zhì)（如甲酚等)中和為鹽，被提前洗脫出去，最后用乙醇（或甲醇)洗脫待測物。

2.2.2 HPLC-UV一測多評(píng)方法的不足

本課題組建立了孕馬尿中3種結(jié)合雌激素的HPLC-UV一測多評(píng)方法[3]，部分馬尿樣品色譜圖見圖3，由圖可知3種主要CE對(duì)照品溶液色譜圖分離效果較好，而對(duì)于供試品，由于孕馬尿成分復(fù)雜，雖然經(jīng)過SPE樣品前處理，但采用UV檢測，部分樣品的色譜圖中3種成分分離度不佳，無法進(jìn)行準(zhǔn)確的定性、定量，如果利用一測多評(píng)方法會(huì)產(chǎn)生較大的誤差。

圖3 HPLC-UV一測多評(píng)方法色譜圖

本實(shí)驗(yàn)基于質(zhì)譜檢測的總離子流圖（TIC)如圖2所示，由于采用選擇離子模式（SIM)掃描，只針對(duì)ES、EqS及17α-EqS進(jìn)行測定，因此沒有其他物質(zhì)干擾，分離效果好，專屬性強(qiáng)。

3 結(jié)束語

一測多評(píng)在中藥材及復(fù)雜樣品質(zhì)量控制方面的應(yīng)用越來越多[5]，目前文獻(xiàn)中采用的方法多基于HPLC-UV法進(jìn)行測定，利用HPLC-UV方法進(jìn)行一測多評(píng)所需儀器較為普及，測試成本較為低廉[6-8]。但定性方面采用相對(duì)保留時(shí)間進(jìn)行定性，專屬性方面存在一些困難，盡管可以采用PDA檢測器進(jìn)行驗(yàn)證，但由于通常檢測的是一類化合物，紫外光譜差異較小，其作用有限。如果樣品成分復(fù)雜，由于分離不佳，待測化合物的定量和定性都會(huì)影響一測多評(píng)的準(zhǔn)確性。本文建立的基于MS檢測的一測多評(píng)技術(shù)在樣品的專屬性、分離度方面有著明顯的優(yōu)勢，對(duì)于復(fù)雜體系中結(jié)構(gòu)較為相似的一類化合物采用一測多評(píng)方法提供了一種更為可靠的方法。

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經(jīng)過計(jì)算得到：測試壓力為（300±5)kPa條件下，單件重復(fù)測量50次的平均值xˉ=0.38006，標(biāo)準(zhǔn)偏差s=0.0081，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=2.1%。其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差＜5%，證明該檢測方法重復(fù)性好。

4 結(jié)束語

基于二氧化碳傳感器的氣密性檢測方法，通過高準(zhǔn)確度氣敏傳感器的濃度檢測實(shí)現(xiàn)氣體微量泄漏的快速、高效、高準(zhǔn)確度檢測，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明實(shí)測值與標(biāo)準(zhǔn)漏孔參考值誤差均小于3%，檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠。在相同壓力測試條件下，測試結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差＜5%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好，提高了氣密性檢測方法的多樣性和準(zhǔn)確度。檢測方法優(yōu)良的設(shè)計(jì)和可靠的性能，為提高生產(chǎn)效率和提升氣密性檢測準(zhǔn)確度發(fā)揮了重要作用，具有廣闊的應(yīng)用前景。

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Study on the contents of three main conjugated estrogens in the pregnant mare’s urine using a new method of QAMS

YAO Jun1，2，LI Dongyu1，ZHANG Huangtao2，LU Yi2，GAO Xiaoli1
（1.College of Pharmacy，Xinjiang Medical University，Urumqi 830054，China；2.Xinjiang Uygur Autonomous Region Product Quality Supervision and Inspection Institute，Urumqi 830004，China）

The purpose of this paper is to establish the Quantitative Analysis of Multi-Components by Single Marker（QAMS）to determine the contents of three main conjugated estrogens in pregnantmares'urine based on mass spectrometry analysis.Samples were purified by a macroporous adsorption resin solid-phase extraction column and then detected by HPLC-MS.The relative correction factors in sodium equilin sulfate and sodium 17α-dihydroequilin sulfate were determined using sodium estrone sulfate as the internalstandard to assay the three main conjugated estrogens.The results show that the three main components are good in linear and precision，stability and recovery.The relative correction factors of sodium equilin sulfate and sodium 17α-dihydroequilin sulfate were 0.8663 and 0.9884 respectively.The chromatographic column and fragmentation voltage have little effect on the relative correction factors.There are no significant differencesin determining the three main conjugated estrogens in ten batchesof pregnant mares'urine samples.Therefore，this method has greater advantages in determining pregnant conjugated estrogens described in above.

conjugated estrogens；QAMS;LC-MS；relative correction factor

A

：1674-5124（2015）10-0058-05

10.11857/j.issn.1674-5124.2015.10.013

2015-05-14；

：2015-06-30

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金（2013211A054)

姚 軍（1973-)，男，新疆烏魯木齊市人，副教授，研究方向?yàn)樗幬锓治觥?/p>