HPLC-UV法測(cè)定人血漿及尿中多尼培南

秦永平梅亞君章 麗毛 銳南 峰向 瑾梁茂植余 勤

（1.四川大學(xué)華西醫(yī)院臨床藥理研究室，四川 成都 610041；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 611137）

HPLC-UV法測(cè)定人血漿及尿中多尼培南

秦永平1，梅亞君1，2，章 麗1，毛 銳1，南 峰1，向 瑾1，梁茂植1，余 勤1

（1.四川大學(xué)華西醫(yī)院臨床藥理研究室，四川 成都 610041；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 611137）

建立HPLC-UV法測(cè)定人血漿及尿中多尼培南（DP）的質(zhì)量濃度，用于DP人體藥代動(dòng)力學(xué)研究。采用Ultimate XB-C18（150 mm×4.6 mm×3 μm）色譜柱，血漿及尿樣測(cè)定用流動(dòng)相分別為10 mmol/L醋酸鈉：乙腈：三乙胺（體積比94：6：0.1，冰乙酸調(diào)pH為4.51）和8mmol/L醋酸鈉：乙腈：三乙胺（體積比95.5：4.5：0.1，冰乙酸調(diào)pH值為4.99），流速均為1mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為297nm。血漿樣品經(jīng)乙睛沉淀蛋白，再用二氯甲烷反洗后取上清液進(jìn)樣，以美羅培南（MRP）做內(nèi)標(biāo)；尿樣直接用水稀釋后進(jìn)樣，外標(biāo)法定量。血藥濃度在0.0625～200μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，定量限為0.0625μg/mL，批內(nèi)精密度在1.0%～6.0%之間，批間精密度在3.0%～6.7%之間，方法回收率在92.4%～104.5%之間，預(yù)處理回收率在91.2%～103.8%之間。尿藥濃度在0.625～4 800 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，定量限為0.625μg/mL，批內(nèi)精密度在0.7%～4.0%之間，批間精密度在1.1%～5.3%之間，方法回收率在94.1%～106.7%之間。該方法具有簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確等特點(diǎn)，適用于人血漿及尿中多尼培南質(zhì)量濃度的測(cè)定。

多尼培南；高效液相色譜法；血藥濃度；尿藥濃度

0 引 言

多尼培南是一種新的1β甲基碳青霉烯類抗生素[1]，其抗菌譜廣、抗菌活性強(qiáng)，對(duì)各種需氧、厭氧G+及G-菌均有很強(qiáng)的抗菌活性[2]。Sutherland C和Iked K等[3-4]分別采用固相萃取法和超濾法進(jìn)行樣品預(yù)處理，采用HPLC-UV法對(duì)DP的血藥濃度進(jìn)行測(cè)定。國(guó)內(nèi)有多尼培南的臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究報(bào)道[5-6]，但無(wú)多尼培南尿液濃度的相關(guān)測(cè)定。本實(shí)驗(yàn)建立了人血漿及尿液中多尼培南濃度的HPLC-UV測(cè)定方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與色譜條件

日本SHIMADZU公司2010-HPLC型高效液相色譜儀，采用Ultimate XB-C18分析柱（150 mm× 4.6mm×3μm），柱溫35℃，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)297nm。血漿和尿液樣品用流動(dòng)相分別為10mmol/L醋酸鈉：乙腈：三乙胺（體積比94：6：0.1，冰乙酸調(diào)pH為4.51）和8mmol/L醋酸鈉：乙腈：三乙胺（體積比95.5：4.5：0.1，冰乙酸調(diào)pH為4.99），流量均為1mL/min。

1.2 藥品與試劑

多尼培南（Doripenem，DP）對(duì)照品（成都地奧九泓制藥廠，含量：91.79%，批號(hào)：20131001）；美羅培南（Meropenem，MRP）對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，含量：87.0%，批號(hào)：30506-200702）。乙腈、甲醇、三乙胺均為色譜純?cè)噭黄溆嘣噭榉治黾?；?shí)驗(yàn)用水由美國(guó)Millipore公司Milli-Q型超純水器制備所得。

1.3 溶液配制

1）血漿樣品測(cè)定用儲(chǔ)備液。精密稱取DP對(duì)照品21.79 mg（相當(dāng)于DP20 mg）于25 mL容量瓶中，用純水溶解并定容至刻度，即得血漿樣品測(cè)定用DP儲(chǔ)備液（800μg/mL），分裝于EP管中-80℃冰箱保存。臨用前，用水稀釋得DP血樣測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)系列工作液。

2）尿液樣品測(cè)定用儲(chǔ)備液。稱取DP對(duì)照品130.7mg（相當(dāng)于DP120mg）于25mL的容量瓶中，用純水溶解并定容至刻度，即得尿液樣品測(cè)定用DP儲(chǔ)備液（4 800 μg/mL），分裝于EP管中-80℃冰箱保存。臨用前，用水稀釋得DP尿樣測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)系列工作液。

3）內(nèi)標(biāo)（IS）儲(chǔ)備液及工作液。精密稱取MRP對(duì)照品22.99 mg（相當(dāng)于MRP20 mg）于50 mL的容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度即得MRP儲(chǔ)備液（400μg/mL），分裝于EP管中-80℃冰箱保存。臨用前，用水稀釋得MRP內(nèi)標(biāo)工作液（40μg/mL）。

1.4 樣品預(yù)處理

1）血漿樣品。取待測(cè)血漿樣品200μL，加入純水50 μL、加入內(nèi)標(biāo)工作液50 μL，混勻，再加入乙腈600μL，充分混合后離心10min（13000r/min，8℃）；傾倒上清液于圓底管，加入2mL二氯甲烷反洗，渦旋5min，離心7min（3000r/min，8℃），取20μL上清液進(jìn)樣。

2）尿液樣品。取待測(cè)尿液樣品100 μL，加入純水900μL，混勻后離心10 min（13000r/min，8℃），取20μL上清液進(jìn)樣。

2 方法與結(jié)果

2.1 專屬性

空白血漿（6個(gè)）、對(duì)照品、空白血漿加對(duì)照品及血漿樣品色譜圖見圖1，DP（1）與IS（2）保留時(shí)間分別為5.3min和8.5min。結(jié)果顯示：血漿中的內(nèi)源性雜質(zhì)對(duì)藥物和內(nèi)標(biāo)峰均無(wú)干擾。

空白尿樣（6個(gè)）、對(duì)照品、空白尿樣加對(duì)照品及尿液樣品色譜圖見圖2，DP（1）保留時(shí)間為8.3 min。結(jié)果顯示：尿液中的內(nèi)源性雜質(zhì)對(duì)藥物峰無(wú)干擾。

2.2 線性及最低定量限考察

圖1 血漿測(cè)定色譜圖

圖2 尿液測(cè)定色譜圖

1）血漿。分別取200μL空白血漿9份，空白管補(bǔ)水50μL，其余各管依次加入血樣測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)系列工作液50μL，使DP血漿質(zhì)量濃度分別為0.0625，0.125，3.125，12.5，25，50，100，200μg/mL。按1.4項(xiàng)下1）自“加入內(nèi)標(biāo)工作液50μL”起操作，進(jìn)樣20μL。記錄藥物及內(nèi)標(biāo)色譜峰面積，以二者峰面積之比（Y）對(duì)多尼培南血漿質(zhì)量濃度（X）進(jìn)行加權(quán)（1/x2）線性回歸，得DP的血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：Y=0.090 73X+ 0.006 93（r2=0.999 8），結(jié)果顯示多尼培南血漿質(zhì)量濃度在0.062 5～200 μg/mL范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好。定量限為0.062 5 μg/mL，測(cè)定5次的平均值為0.057 2μg/mL，RSD為9.16%，準(zhǔn)確度和精密度均符合相關(guān)規(guī)定。

2）尿液。取空白尿11份，每份100μL，空白管補(bǔ)水900μL，其余管先依次加入尿液測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)系列工作液100 μL，使其尿藥濃度分別為：0.625，1.25，5，20，100，400，800，1600，3200，4800μg/mL，再加水800μL，按1.4項(xiàng)下2）混勻離心處理后進(jìn)樣。記錄藥物色譜峰面積，以峰面積（Y）對(duì)尿藥濃度（X）進(jìn)行加權(quán)（1/x2）線性回歸，得DP的尿液標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：Y=2359.74X-485.866（r2=0.999 8），結(jié)果顯示多尼培南尿液質(zhì)量濃度在0.625～4 800 μg/mL范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好。最低定量限為0.625μg/mL，測(cè)定5次的平均值為0.643μg/mL，RSD為2.73%，準(zhǔn)確度和精密度均符合相關(guān)規(guī)定。

2.3 方法精密度和回收率

1）血漿樣品。取用空白血漿加DP工作液配成的低（0.125 μg/mL）、中（10 μg/mL）、高（160 μg/mL）3個(gè)質(zhì)量濃度血漿樣品各5份，按1.4項(xiàng)下1）自“加入內(nèi)標(biāo)工作液50μL”起同法操作。以多尼培南與內(nèi)標(biāo)峰面積之比在當(dāng)日血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出多尼培南質(zhì)量濃度，于1d內(nèi)連續(xù)測(cè)定5次，測(cè)得DP平均血藥濃度分別為0.121，10.277，152.533 μg/mL，對(duì)應(yīng)的批內(nèi)精密度RSD分別為5.98%，1.03%和2.58%。血漿方法回收率分別為（97.02±5.81）%、（102.77±1.06）%和（95.33±2.46）%。于7d內(nèi)測(cè)定3批，每批5次，測(cè)得DP平均血藥濃度分別為0.121，10.673，158.518μg/mL，對(duì)應(yīng)的批間精密度RSD分別為6.66%、2.98%和3.53%。

2）尿液樣品。用空白尿液加DP工作液配成的低（1.875μg/mL）、中（3.75μg/mL）、中高（240μg/mL）、高（3 840 μg/mL）4個(gè)質(zhì)量濃度的尿液樣品各5份，按1.4項(xiàng)下2）處理進(jìn)樣。以多尼培南峰面積在當(dāng)日血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出多尼培南質(zhì)量濃度，在1 d內(nèi)連續(xù)測(cè)定5次，測(cè)得DP平均尿藥濃度分別為1.736，3.760，256.030，3 811.533μg/mL，對(duì)應(yīng)的批內(nèi)精密度RSD分別為3.99%、4.02%、0.72%和0.91%。方法回收率分別為（94.05±3.756）%、（103.09±5.612）%、（106.68±0.766）%和（99.26±0.902）%。于7d內(nèi)測(cè)定3批，每批5次，測(cè)得DP平均尿藥濃度分別為1.699，3.536，254.702，3 811.598μg/mL，對(duì)應(yīng)的批間精密度RSD分別為4.10%、5.25%、1.13%和1.15%。

2.4 血漿預(yù)處理回收率

取用空白血漿加DP工作液配成的低（0.125 μg/mL）、中（10 μg/mL）、高（160 μg/mL）3個(gè)質(zhì)量濃度血漿樣品，每個(gè)濃度3份，按1.4項(xiàng)下1）自“加入內(nèi)標(biāo)工作液50μL”起同法操作，將所得藥物及內(nèi)標(biāo)峰面積與相應(yīng)濃度的工作液直接進(jìn)樣所得峰面積相比，得血漿樣品預(yù)處理平均回收率分別為118.35%、104.53%和101.32%，內(nèi)標(biāo)的預(yù)處理平均回收率為96.63%。

2.5 樣品穩(wěn)定性考察

取用空白血漿加DP工作液配成的低（0.125 μg/mL）、中（10μg/mL）、高（160μg/mL）的3個(gè)質(zhì)量濃度的血漿樣品及用空白尿液加DP工作液配成的低（1.875 μg/mL）、中（3.75 μg/mL）、中高（240μg/mL）、高（3 840μg/mL）4個(gè)質(zhì)量濃度的尿液樣品各3份，分別考察-80℃長(zhǎng)期放置、反復(fù)凍融、室溫放置、處理后樣品在進(jìn)樣室（8℃）放置及重復(fù)進(jìn)樣穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，所有穩(wěn)定性試驗(yàn)中實(shí)測(cè)值與理論值的相對(duì)偏差均小于15%。表明血漿樣品在-80℃條件下保存30d，反復(fù)凍融3次，室溫放置6h，進(jìn)樣室放置16h，重復(fù)進(jìn)樣1次均穩(wěn)定；尿液樣品在-80℃條件下保存34d，反復(fù)凍融3次，室溫放置4h，進(jìn)樣室放置14h、重復(fù)進(jìn)樣2次均穩(wěn)定。

2.6 尿樣稀釋因子考察

在尿液樣品測(cè)定中，有樣品質(zhì)量濃度超過了標(biāo)準(zhǔn)曲線上限（4800μg/mL）的，進(jìn)行4倍稀釋因子的考察。取空白尿液加DP對(duì)照品配成的尿液樣品（8000μg/mL）0.5mL，加入空白尿樣1.5mL稀釋，充分混勻后按尿液樣品預(yù)處理方法處理后進(jìn)樣。將直接測(cè)得的質(zhì)量濃度乘以4即為換算的實(shí)際質(zhì)量濃度，其測(cè)定5次的平均質(zhì)量濃度為7670.85μg/mL，與配制偏差為4.12%，RSD為0.85%，表明樣品稀釋4倍后測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

3 應(yīng) 用

本文建立的方法已用于12名健康志愿者在3個(gè)周期里分別單次靜脈滴注多尼培南低（0.25 g）、中（0.5g）、高（1.0g）劑量的藥動(dòng)學(xué)研究。其低、中、高劑量單次給藥的均值藥時(shí)曲線見圖3；尿液中多尼培南平均累積排泄率-時(shí)間曲線見圖4（低劑量12例，中劑量9例，高劑量8例）。由圖可知：多尼培南血藥濃度隨劑量增加而相應(yīng)增加，低、中、高劑量尿中24h累積排泄率在70%以上。

4 討 論

4.1 流動(dòng)相的選擇

圖3 12名健康受試者單次靜脈注射DP后的均值藥-時(shí)曲線

圖4 12名健康受試者單次靜脈注射DP后的均值尿藥累積排泄率曲線

由多尼培南的化學(xué)結(jié)構(gòu)可知，多尼培南屬于極性較大的化合物。因此所需乙腈量較少，且乙腈量的微小改變對(duì)藥物及內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間影響很大。同時(shí)，pH對(duì)血漿和尿液中的雜質(zhì)出峰也有較大的影響。流動(dòng)相選擇時(shí)分別考察了不同乙腈比例和不同的pH值對(duì)出峰的影響，以確保藥物、內(nèi)標(biāo)與雜質(zhì)峰能完全分開，并最終選定了本文所用流動(dòng)相。

4.2 樣品預(yù)處理方法

DP和內(nèi)標(biāo)極性大，不溶于有機(jī)溶劑，無(wú)法使用液液萃取法。Sutherland C和Iked K等分別采用固相萃取法和超濾法進(jìn)行樣品預(yù)處理，固相萃取法和超濾法成本高，重現(xiàn)性較差。本文根據(jù)對(duì)同類藥物樣品的預(yù)處理經(jīng)驗(yàn)[7]，首先選擇用乙腈沉淀蛋白，再用二氯甲烷反洗去除脂溶性雜質(zhì)和沉淀蛋白的乙腈，離心取上清液直接進(jìn)樣，不僅操作簡(jiǎn)便、成本低，而且樣品沒有被稀釋，測(cè)定的靈敏度高、精密度好。方法優(yōu)化中考察了沉淀蛋白的乙腈用量以及反洗劑二氯甲烷的體積，確定了上述預(yù)處理方法。

4.3 尿液外標(biāo)法定量

首先考慮采用血樣測(cè)定方法對(duì)尿樣進(jìn)行測(cè)定，但由于尿液樣品中雜質(zhì)較多，在DP與內(nèi)標(biāo)處均有雜質(zhì)干擾。通過調(diào)節(jié)流動(dòng)相比例及pH，在DP出峰處可避開雜質(zhì)干擾，但在內(nèi)標(biāo)MRP出峰處仍有干擾。用水直接稀釋進(jìn)樣，預(yù)處理過程簡(jiǎn)單，操作誤差可控，經(jīng)方法學(xué)評(píng)價(jià)，尿液樣品測(cè)定采用外標(biāo)法定量完全符合生物樣本測(cè)定的相關(guān)要求。

5 結(jié)束語(yǔ)

本文建立的HPLC-UV法測(cè)定血漿及尿液中DP質(zhì)量濃度，具有樣品具有儀器設(shè)備要求低、預(yù)處理簡(jiǎn)便、測(cè)定結(jié)果靈敏準(zhǔn)確等特點(diǎn)，適用于DP血藥濃度及尿藥濃度的測(cè)定及藥代動(dòng)力學(xué)研究。

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HPLC-UV determination of doripenem in human plasma and urine

QIN Yongping1，MEI Yajun1，2，ZHANG Li1，MAO Rui1，NAN Feng1，XIANG Jin1，LIANG Maozhi1，YU Qin1
（1.Laboratoryof ClinicalPharmacologyGCPCenterof WestChinaHospital，SichuanUniversity，Chengdu610041，China；2.College of Pharmacy，Chengdu University of TCM，Chengdu 611137，China）

To establish a HPLC-UV method for determining Doripenem（DP）in human plasma and urine to perform DPhuman pharmacokinetic studies.The assay was conducted on a HPLC-UV column of Ultimate XB-C18（150mm×4.6mm×3μm）.Mobile phases were 10mmol/L natrium aceticumacetonitrile-triethylamine（94：6：0.1（ν：ν：ν），pH adjusted to be 4.51 with acetic acid）and 8 mmol/L natrium aceticum-acetonitrile-triethylamine（95.5：4.5：0.1（ν：ν：ν），pH adjusted to be 4.99 with acetic acid）.The above mobile phases were pumped at the rate of 1mL/min through the column，with the detection wavelength set at 297nm.Plasma samples were deproteinized with acetonitrile，which was extracted and removed with dichloromethane.Meropenem（MRP）was used as the internal standard（IS）. Urine samples were diluted in distilled water and then quantified with the external reference method. The plasma concentration was in a linear relationship with the calibration curve within the range of 0.0625-200μg/mL while the quantitation limit was 0.0625μg/mL.The within-run and between-run precisions were 1.0%-6.0%and 3.0%-6.7%，respectively.The method recovery was 92.4%-104.5% and the plasma pretreatment recovery was 91.2%-103.8%.The urine concentration had a linear correlation to the calibration curve in the range of 0.625-4 800 μg/mL while the quantization limit was 0.625 μg/mL.The within-run and between-run precision were 0.7%-4.0%and 1.1%-5.3%，respectively.The method recovery was 94.1%-106.7%.This method is simple and rapid，sensitive and accurate，suitable for determining DPconcentration in human plasma and urine.

doripenem；HPLC；plasma concentration；urine concentration

A

：1674-5124（2015）05-0054-04

10.11857/j.issn.1674-5124.2015.05.014

2014-11-08；

：2015-01-05

秦永平（1963-），男，四川長(zhǎng)寧縣人，技師，碩士，主要從事體內(nèi)藥物分析工作。