睪穿精畸形部位對(duì)ICSI 受精及胚胎發(fā)育的影響

于成和，阿周存，張若鵬，吳 睿，張麗蓉，朱 莉

（大理大學(xué)附屬醫(yī)院 生殖醫(yī)學(xué)科，云南 大理 671000）

ICSI 技術(shù)（Intracytoplasmic Sperm Injection）即卵泡漿內(nèi)單精子注射，1992 年P(guān)alerml 首次對(duì)人卵子進(jìn)行ICSI 操作，成功得到了首例ICSI 嬰兒[1]，1996 廣州中山醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖中心為一對(duì)少精癥不育夫婦助孕成功生下一女嬰，成為我國(guó)第一例ICSI 嬰兒，為我國(guó)ICSI 行業(yè)做出突破性的貢獻(xiàn)。然而影響ICSI 技術(shù)的因素很多：精子因素、卵子因素、技術(shù)操作、體外環(huán)境等。活精子、死精子、不運(yùn)動(dòng)的精子、附睪精子和睪丸精子都可被用于ICSI 操作[2]。

世界衛(wèi)生組織出版的《 人類精液檢驗(yàn)與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》（第五版）[3]規(guī)定人類精子畸形（Sperm Malformation Rate，SMR）分類：一、頭 部（錐形、梨形、圓形、無頂體、小、無定形、有空泡、頂體區(qū)域小），二、頸部和中段的畸形（頸部彎折、不對(duì)稱、中段和頭部連接點(diǎn)粗、細(xì)），三、尾部畸形（短尾、成角彎折、卷尾、過多的胞漿殘余體、精子頭部大小的1/3）。本實(shí)驗(yàn)研究睪丸穿刺所獲得正常形態(tài)、頭部畸形、頸部畸形、尾部畸形的精子行ICSI，分析不同畸形部位對(duì)受精、胚胎發(fā)育的影響。

資料與方法 2012 年1 月－2014 年12 月，在大理大學(xué)附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科經(jīng)患者簽署《 大理大學(xué)附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科未成熟配子、廢棄卵子、廢棄胚胎的處理意向書》并選擇用于科學(xué)研究的未成熟卵子，經(jīng)體外培養(yǎng)成熟，玻璃管化冷凍累計(jì)達(dá)213 枚，玻璃管化解凍后存活194 枚。精子來源于我科室并簽署上述協(xié)議所廢棄的梗阻性無精患者（染色體分析正常）睪丸穿刺所獲得精子。

實(shí)驗(yàn)分組：實(shí)驗(yàn)分為四組，形態(tài)正常組、頭部畸形組、頸部畸形組、尾部畸形組，分別對(duì)應(yīng)注射正常形態(tài)、頭部畸形、頸部畸形、尾部畸形睪丸穿刺精子。將上述復(fù)蘇得194 枚卵子隨機(jī)分為4 組，每組數(shù)目分別為48 枚、49 枚、49 枚、48 枚，并標(biāo)記為形態(tài)正常組、頭部畸形組、頸部畸形組、尾部畸形組。

ICSI 注射：上針，配注射盤 先上Holding 針，再上注射針，調(diào)節(jié)Holding 針和注射針的平面。根據(jù)卵子多少，用M-HTF 液制成若干小圓形液滴，中央加入PVP，右邊緣用M-HTF 液制成長(zhǎng)條形液滴，迅速覆蓋油，使液面全部覆蓋。并將卵子吸入小圓形液滴內(nèi)，精子吸入長(zhǎng)條形液滴內(nèi)。

ICSI 操作：將單個(gè)活動(dòng)的精子吸入PVP 中，在精子尾部1/3 處制動(dòng)，精子吸入顯微注射針內(nèi)，轉(zhuǎn)動(dòng)卵子使得紡錘體區(qū)處于6 或12 點(diǎn)鐘位置，其3 點(diǎn)鐘位置用Holding 針將卵子固定，將精子推至注射針尖口，將針從卵子的9 點(diǎn)鐘方向插入卵子，抽吸胞漿至觀察到胞質(zhì)流動(dòng)突然加劇，停止抽吸并以正壓將精子頭注入卵胞漿內(nèi)再以輕微的負(fù)壓小心抽出顯微注射針，隨后Holding 針釋放卵子。每組注射結(jié)束后，轉(zhuǎn)移至與之相對(duì)應(yīng)標(biāo)記的生長(zhǎng)皿中，放入5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

受精與胚胎觀察：授精后16～18h 觀察并記錄受精（記為D1），43～45h 觀察并記錄胚胎分裂（記為D2），67～69h 觀察并記錄胚胎發(fā)育（記為D3），114～164h 根據(jù)囊胚形成情況觀察并記錄囊胚形成（記為D5-D7）。

統(tǒng)計(jì)分析：應(yīng)用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用精確概率法的雙側(cè)χ2檢驗(yàn)，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

結(jié) 果 與形態(tài)正常組相比，頭部畸形組的受精率（42.86VS64.58）、2PN 受精率（36.73VS60.42）顯著性下降（P＜0.05），但對(duì)胚胎發(fā)育的影響無顯著性差異；頸部畸形組的受精率、胚胎發(fā)育都無顯著性下降；尾部畸形組的受精率（54.17VS 64.58）下降，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，該組胚胎發(fā)育無顯著性下降。

討 論 精子在男性睪丸中產(chǎn)生，在附睪中成熟，經(jīng)輸精管運(yùn)輸至精囊并儲(chǔ)存其中，以性交、遺精、手淫取精等方式排出體外。精子發(fā)生及成熟過程中發(fā)生形態(tài)異常機(jī)制可能有：活性氧產(chǎn)生的增多、精子的異常凋亡、染色質(zhì)異常、免疫性損傷。精子頭部是遺傳物質(zhì)所在部位。尾部主要成分是細(xì)胞質(zhì)，在自然受精過程，主要起運(yùn)動(dòng)功能。頸部是連接頭部和尾部的結(jié)點(diǎn)，具體功能尚未清楚。謝文燕等研究表明人精子染色質(zhì)的狀態(tài)與其形態(tài)明顯相關(guān)，頭部形態(tài)異常的精子其染色體異常的幾率要比正常精子染色體異常的幾率高4倍[4]。精子畸形率高的患者行IVF 時(shí)，其受精率、流產(chǎn)率降低，然而楊帆等[5]報(bào)道挑選正常形態(tài)的精子行ICSI 時(shí)受精率、胚胎發(fā)育與正常形態(tài)率的精子無差別，但形態(tài)異常精子使受精率和臨床妊娠率均低于精子形態(tài)正常的患者。目前對(duì)精子形態(tài)異常對(duì)輔助生殖技術(shù)的影響，國(guó)內(nèi)外報(bào)道尚未一致，多數(shù)研究結(jié)果[6]表明，基于形態(tài)學(xué)和功能的精子優(yōu)選技術(shù)有理論上的價(jià)值，但對(duì)于ICSI 的臨床結(jié)局并沒有顯著的改善。

附表 睪丸精畸形部位對(duì)ICSI受精及胚胎發(fā)育的影響

ICSI 技術(shù)影響因素很多，本實(shí)驗(yàn)在確保其他條件相同的情況下，研究睪穿精子的不同畸形部位對(duì)復(fù)蘇卵子ICSI 受精及胚胎發(fā)育的影響。卵子經(jīng)過冷凍、液氮低溫保存、復(fù)蘇后，受精率及胚胎質(zhì)量不及新鮮卵子，冷凍復(fù)蘇過程對(duì)卵子造成一定程度損傷。有學(xué)者認(rèn)為睪丸精子受精率比附睪精子低，但睪丸、附睪及射出精子ICSI 后妊娠結(jié)局無顯著差異，可能存在后期自我修復(fù)[7]。在臨床工作中，睪丸穿刺所獲得的精子未經(jīng)過附睪等部位的發(fā)育與成熟，精子活動(dòng)力、活動(dòng)率差，精子密度低，畸形率極高，對(duì)于部分患者挑選出一條形態(tài)正常的活精子十分困難。因此在睪丸穿刺術(shù)+ICSI 術(shù)臨床應(yīng)用中，我們盡可能挑選形態(tài)正常的活動(dòng)精子注入，但如果找不到正常形態(tài)的活精子，可首先挑選頸部畸形的精子，其次再挑選尾部畸形的精子，最后再考慮頭部畸形的精子，以減少精子形態(tài)對(duì)受精、胚胎的影響。

［1］PALERMO G,JORI H,DEVROEY P,et al.Pregnancies after intracytoplasmic injection of single spermatozoom into an oocyte[J]．Lancet,1992,340,17-18.

［2］嚴(yán)阿勇，李明，安曉榮，等．胞漿內(nèi)精子注射技術(shù)生產(chǎn)小鼠[J]．生物工程學(xué)報(bào)，2005,21(2)：305-309.

［3］World Health Organization.WHO Laboratory Manual for the Examination and Processing of Human Semen. 5th ed[M]．Geneva：World Health Organization,2010.66-67．

［4］謝文燕．畸形精子癥精液的處理方法及精子形態(tài)對(duì)輔助生殖技術(shù)治療結(jié)局影響的研究[D]．汕頭：汕頭大學(xué)，2007.

［5］楊帆．精子形態(tài)對(duì)輔助生殖結(jié)果影響的相關(guān)研究[D]．河北：河北醫(yī)科大學(xué)，2014.

［6］胡燁，滕曉明．精子優(yōu)選技術(shù)的進(jìn)展及其對(duì)卵細(xì)胞質(zhì)內(nèi)單精子注射結(jié)局的影響[J]．診斷學(xué)理論與實(shí)踐，2014,13(3)：341-344.

［7］朱海波．精子質(zhì)量相關(guān)因素對(duì)ICSI 助孕結(jié)局影響的初步分析[D]．吉林：吉林大學(xué)，2014.