貴州鳳岡富鋅富硒綠茶對(duì)衰老模型小鼠Trx含量及肝臟超微結(jié)構(gòu)的影響*

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貴州鳳岡富鋅富硒綠茶對(duì)衰老模型小鼠Trx含量及肝臟超微結(jié)構(gòu)的影響*

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150113.1921.026.html

申雪慧子1， 姬曉云2, 岳蘭2， 劉華1， 吳寧1，3**

(1.貴陽醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室， 貴州 貴陽550004； 2.貴陽醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院， 貴州 貴陽550004； 3.貴陽醫(yī)學(xué)院 理化實(shí)驗(yàn)中心， 貴州 貴陽550004)

[摘要]目的： 研究貴州鳳岡富鋅富硒綠茶對(duì)衰老模型小鼠硫氧還原蛋白(Trx)含量及肝臟超微結(jié)構(gòu)的影響，探討富鋅富硒綠茶保肝抗衰老的機(jī)制。方法： 昆明雄性小鼠70只均分為正常對(duì)照組、衰老模型組、陽性對(duì)照組、富鋅富硒綠茶高、中、低劑量組和普通綠茶組，除正常對(duì)照組給予腹腔注射生理鹽水外，其余6組均給予腹腔注射0.2 mg/(g·d)D-半乳糖制備衰老模型；造模第3周正常對(duì)照組和衰老模型組均給予蒸餾水灌胃，其余5組分別給予維生素C，高、中、低3種濃度富鋅富硒綠茶及普通綠茶灌胃，1次/d，連續(xù)4周；最后1次灌胃后2 h取小鼠眼眶血，酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測(cè)小鼠血清Trx的含量，電鏡下觀察小鼠肝臟組織的超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果： 與正常對(duì)照組相比，衰老模型組Trx含量明顯降低(P<0.01)，說明造模成功；與衰老模型組相比，富鋅富硒綠茶組及普通綠茶組Trx含量升高(P<0.01，P<0.05)；與普通綠茶組相比，富鋅富硒綠茶組Trx含量升高(P<0.05)，說明富鋅富鋅綠茶抗氧化作用強(qiáng)于普通綠茶；富鋅富硒綠茶高劑量組Trx含量高于中、低劑量組，中劑量組高于低劑量組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；電鏡結(jié)果示衰老模型組肝細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞核和細(xì)胞器損傷嚴(yán)重；富鋅富硒綠茶組肝細(xì)胞體積正常，細(xì)胞核和細(xì)胞器接近正常；普通綠茶組肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)部分線粒體腫脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴(kuò)張；陽性對(duì)照組胞質(zhì)內(nèi)線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)接近正常，胞漿輕微腫脹疏松，肝細(xì)胞核形態(tài)基本接近正常細(xì)胞核。結(jié)論： 貴州鳳岡富鋅富硒綠茶能明顯增加衰老模型小鼠血清Trx含量，具有延緩衰老的作用。

[關(guān)鍵詞]小鼠； 細(xì)胞結(jié)構(gòu)； 硫氧還蛋白； 衰老模型；富鋅富硒綠茶

衰老是生物隨著時(shí)間的推移而表現(xiàn)出的機(jī)能退行性變[1]。雖不可違背，但可以延緩[2]。肝臟是研究機(jī)體衰老的重要器官，其衰老主要表現(xiàn)在超微結(jié)構(gòu)的改變。硫氧還原蛋白(Trx)參與了機(jī)體的氧化還原反應(yīng)，能減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致的細(xì)胞損傷[3]。有研究報(bào)道，貴州富鋅富硒綠茶中所含有的天然物質(zhì)成分對(duì)延緩衰老、殺菌、消炎等均有特殊效果[4]。本研究以腹腔注射D-半乳糖制備的衰老模型小鼠為研究對(duì)象，觀察貴州鳳岡富鋅富硒綠茶對(duì)衰老小鼠血清中Trx含量的變化及肝臟超微結(jié)構(gòu)的改變，探討鳳岡富鋅富硒綠茶保肝抗衰老的機(jī)制。

1材料及方法

1.1材料

昆明雄性小鼠70只，體重18~25 g，購自貴陽醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心[SCXK(貴)2007-004]。富硒富鋅綠茶由貴州鳳岡縣永安鎮(zhèn)田壩村生產(chǎn)，D-半乳糖(上海恒信化學(xué)試劑廠)，TRX ELISA (E03T0336，上海藍(lán)基生物科技有限公司)，透射電子顯微鏡(日本，HITACHI7650),酶標(biāo)儀(北京新風(fēng)，ZS-3型)，臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(湘儀貝克，TGL-20M)，37 ℃恒溫箱(天津泰斯特，202-2AB)。

1.2方法

1.2.1分組及造模70只小鼠適應(yīng)喂養(yǎng)3 d，隨機(jī)均分為7組，正常對(duì)照組、衰老模型組、陽性對(duì)照組、富鋅富硒綠茶(高、中、低)組及普通綠茶組。正常對(duì)照組給予腹腔注射0.9%生理鹽水(0.01 mL/g)，其他各組腹腔注射D-半乳糖0.2 mg/(g·d)，連續(xù)6周復(fù)制小鼠衰老模型[5-6]，造模第3周正常對(duì)照組和衰老模型組均給予蒸餾水灌胃，其余5組分別給予維生素C(1 g/L)，高、中、低3種濃度富鋅富硒綠茶及普通綠茶灌胃，1次/d，連續(xù)4周。富鋅富硒綠茶按0.1 g/mL沸水沖泡30 min，過濾即為高濃度綠茶，對(duì)倍稀釋為中濃度綠茶，再次對(duì)倍稀釋即為低濃度綠茶；普通綠茶按0.1 g/mL沸水沖泡30 min即可。

1.2.2觀察指標(biāo)最后1次灌胃后2 h處死小鼠，取眼眶血分離血清，用ELISA方法檢測(cè)Trx含量，電鏡觀察小鼠肝臟超微結(jié)構(gòu)[7]。小鼠肝臟超微結(jié)構(gòu)觀察：取小鼠肝臟組織約1 mm3，4%戊二醛磷酸緩沖溶液固定， EPON-812環(huán)氧樹脂包埋、切片、甲苯胺藍(lán)染色、光鏡下定位、超薄切片、透射電子顯微鏡觀察。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2結(jié)果

2.1血清Trx水平

與正常對(duì)照組相比，衰老模型組Trx含量明顯降低(P<0.01)，表明造模成功；與衰老模型組相比，富鋅富硒綠茶組及普通綠茶組Trx含量均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P<0.05)，提示綠茶均有抗氧化作用；與普通綠茶組相比，富鋅富硒綠茶組除低劑量組外Trx含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明富鋅富鋅綠茶抗氧化作用強(qiáng)于普通綠茶；富鋅富硒綠茶高劑量組Trx含量高于中、低劑量組，中劑量組高于低劑量組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1　各組小鼠血清Trx含量

(1)與正常對(duì)照組相比,P<0.01；與衰老模型組相比,(2)P<0.01，(3)P<0.05；(4)與普通綠茶組相比,P<0.05

2.2小鼠肝超微結(jié)構(gòu)

電鏡顯示正常對(duì)照組肝細(xì)胞核呈橢圓形，核膜平整光滑，無變形，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有豐富的線粒體，線粒體內(nèi)外膜及線粒體嵴較完整清晰可見，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有豐富核糖體附著(圖1-A)。衰老模型組肝細(xì)胞核體積較正常略有縮小且不規(guī)則，細(xì)胞核染色質(zhì)濃縮，電子密度增加，厚薄不均，細(xì)胞核異染色質(zhì)增多，染色加深；細(xì)胞質(zhì)內(nèi)線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量明顯減少，并有少量脂滴，可見細(xì)胞質(zhì)內(nèi)線粒體腫脹，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，并有輕度脫顆粒現(xiàn)象(圖1-B)。富鋅富硒綠茶高劑量(圖1-C)與陽性對(duì)照組(圖1-G)胞質(zhì)內(nèi)線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)接近正常，胞漿輕微腫脹疏松，肝細(xì)胞核形態(tài)基本接近正常細(xì)胞核。富鋅富硒綠茶中劑量組肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴(kuò)張，細(xì)胞核染色質(zhì)較均勻分布，余細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞器無明顯變化(圖1-D)。富鋅富硒綠茶低劑量(圖1-E)和普通綠茶組(圖1-F)肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)部分線粒體腫脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴(kuò)張。

A為正常對(duì)照組，B為衰老模型組，C、D、E分別為富鋅富硒綠茶高、中、低劑量組， F為普通綠茶組，G為陽性對(duì)照組圖1　各組小鼠肝組織電鏡下超微結(jié)構(gòu)Fig.1　EM pictures of liver tissue ultrastructure of mice in different groups

3討論

Trx是一類分布廣泛的小分子多功能蛋白，它的抗氧化作用是清除過氧化氫，也是GSH-PX的有效電子傳遞體，還能將被氧化的過氧化氫酶還原成單體[8]。硫氧還原蛋白還原酶(TrxR)是一種NADPH依賴的包含黃素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide，F(xiàn)AD)結(jié)構(gòu)域的二聚體硒酶，屬于吡啶核苷酸-二硫化物氧化還原酶家族成員，分為TrxR-1～3，可催化NADPH 將Trx上的-S2還原成(-SH)2的反應(yīng)，維持Trx的還原型[3]。TrxR每個(gè)單體都含有1個(gè)調(diào)節(jié)氧化還原活性的二硫化物和1個(gè)FAD；TrxR在NADPH 的參與下調(diào)節(jié)多種底物的還原反應(yīng)，在氧化還原調(diào)節(jié)和抗氧化防御中起重要的作用，TrxR和還原型TRX形成了一個(gè)有效的蛋白還原系統(tǒng)，具有重要的抗氧化損傷作用[9]，Trx功能如果受到抑制，就會(huì)導(dǎo)致氧化還原失衡，最終引起細(xì)胞凋亡[10]。本實(shí)驗(yàn)中ELISA的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與正常對(duì)照組相比，衰老模型組Trx含量明顯降低(P<0.01)，與本課題組前期研究抗氧化損傷指標(biāo)一致[7]，表明該指標(biāo)亦可用于鑒定衰老模型造模是否成功。本研究還發(fā)現(xiàn)，富鋅富硒綠茶組及普通綠茶組Trx含量均高于衰老模型組 (P<0.01，P<0.05)，說明綠茶有抗氧化損傷作用；而富鋅富硒綠茶組Trx含量高于普通綠茶組 (P<0.05)，證實(shí)了富鋅富鋅綠茶抗氧化作用強(qiáng)于普通綠茶；但在富鋅富硒綠茶，雖然高劑量組Trx含量高于中、低劑量組，中劑量組高于低劑量組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

肝臟是機(jī)體物質(zhì)代謝的關(guān)鍵器官，肝細(xì)胞的損傷和凋亡是機(jī)體衰老的重要標(biāo)志[11]。線粒體作為細(xì)胞內(nèi)能量合成的主要場(chǎng)所，產(chǎn)生的ATP是細(xì)胞內(nèi)的主要能量來源，其性狀改變與衰老過程密切相關(guān)。有研究報(bào)道，隨著年齡的增長(zhǎng)，多種組織中線粒體功能都出現(xiàn)了衰退、包括線粒體數(shù)量的減少[12]。此外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞中合成蛋白質(zhì)的主要場(chǎng)所，表面附著大量核糖體顆粒，細(xì)胞核內(nèi)的遺傳信息被帶到這里進(jìn)行“翻譯”而合成蛋白質(zhì)。其數(shù)量及形態(tài)的改變標(biāo)志著細(xì)胞衰老、損傷的程度[13]。本研究電鏡觀察結(jié)果顯示，衰老模型組肝臟超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了明顯異常改變，主要表現(xiàn)為細(xì)胞核染色質(zhì)濃縮，體積相對(duì)縮小，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)線粒體腫脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量明顯減少。而富鋅富硒綠茶低劑量和普通綠茶組肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)部分線粒體腫脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴(kuò)張，富鋅富硒綠茶中劑量組肝臟超微結(jié)構(gòu)明顯改善，高劑量組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常水平。說明貴州鳳岡富鋅富硒綠茶能明顯抑制衰老小鼠肝臟組織中細(xì)胞器的衰老、損傷改變，可能通過抗氧化機(jī)制發(fā)揮延緩衰老作用。

綜上所述，富鋅富硒綠茶能明顯增加衰老模型小鼠血清Trx含量，并抑制衰老導(dǎo)致的小鼠肝組織超微結(jié)構(gòu)的異常變化，具有延緩衰老的作用。

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(2014-10-22收稿，2014-11-12修回)

中文編輯： 吳昌學(xué)； 英文編輯： 劉華

·基礎(chǔ)研究·

Influences of Green Tea with Rich Zn and Se from Fenggang County, Guizhou

Province on Trx Content and Liver Ultrastructure of Aging Model Mice

SHENXUE Huizi1, JU Xiaoyun2, YUE Lan2, LIU Hua1, WU Ning1,3

(1.DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology,GuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,Guizhou,China;

2.SchoolofPharmacy,GuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,Guizhou,China; 3.ExperimentCenterof

PhysicsandChemistry,GuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To study the effect of Fenggang tea with rich Zn and Se on thioredoxin (Trx) content and liver ultrastructure of D-galactose-induced aging mice and to explore the mechanism of protecting liver and anti-aging of the tea. Methods: Seventy Kunming male mice (15~18 g) were randomly divided into control group, positive control group (Vitamin C), high, middle and low dose groups of zinc-rich and selenium-rich green tea (RZS tea groups), ordinary green tea group, and aging model group. Except control group, mice in all groups received intraperitoneal injection of 0.2 mg/(g·d) D-galactose to become aging mice model. In 3 weeks after model construction, RZS tea groups received intragastric administration of preset high, middle and low doses of zinc-rich and selenium-rich green tea. While positive control group, and ordinary green tea group received intragastric administration of Vitamin C and ordinary green tea respectively, and control group and aging model group received the same amount of saline. All intragastric administrations lasted four consecutive weeks, once per day. In 2 hours after the last administration, the orbital blood was taken for detection of Trx content by ELISA, and liver ultrastructure of mice was examined by electron microscope. Results: Compared with the control group, serum Trx content of aging model obviously decreased (P<0.01), which indicated the model was built successfully. Serum Trx contents in RZS tea groups were obviously higher than those of aging model group (P<0.01，P<0.05). Compared with ordinary green tea group, Trx content increased in RZS tea groups, showing the anti-oxidation effect of RZS tea was higher than that of ordinary tea. Among RZS tea groups Trx content in high dose group was higher than that in middle and low dose groups, but the differences were not significant (P>0.05). In aging model group, the volume of liver cells decreased. The cell nucleus and organelle of liver cell was seriously injuried. On the contrary, in RZS tea groups, the volume of liver cells was normal. The shape of cell nucleus and organelle of liver cell were close to that of normal control group. In ordinary green tea group, part of mitochondria in liver cytoplasm swelled and the endoplasmic reticulu expanded slightly. In positive control group, the structure of mitochondria and endoplasmic reticulu of liver cells was close to normal, and cytoplasm swelled and loosen slightly. The shape of liver cell nuclei was close to that of normal liver cell. Conclusions: Zinc-rich and selenium-rich green tea from Fenggang can increase serum Trx content in aging mice model and has some effects of anti-aging.

[Key words]mice; cellular structures; thioredoxin; aging model; green tea with rich Zn and Se

[中圖分類號(hào)]R151

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1000-2707(2015)01-0013-04

通信作者**E-mail:1638210715@qq.com網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015-01-13

[基金項(xiàng)目]*國(guó)家自然科學(xué) (81260417)；貴州省科學(xué)技術(shù)基金[黔科合J字(2010)2216號(hào)，黔科合LG(2012)019號(hào)]