乳腺癌外周血cfDNA ErbB-2啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)及與腫瘤Her-2表達(dá)的關(guān)系

梁　驍，　郭　萌，　宋文哲，　李　瑩，　祝志強(qiáng)

作者單位： 221006　江蘇　徐州，徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院　甲乳外科

第一作者： 梁　驍，男，碩士研究生，主治醫(yī)師，研究方向：甲狀腺和乳腺腫瘤的臨床及基礎(chǔ)研究，E-mail:liangxiao@live.com

乳腺癌外周血cfDNA ErbB-2啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)及與腫瘤Her-2表達(dá)的關(guān)系

梁驍，郭萌，宋文哲，李瑩，祝志強(qiáng)

作者單位： 221006江蘇徐州，徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院甲乳外科

第一作者： 梁驍，男，碩士研究生，主治醫(yī)師，研究方向：甲狀腺和乳腺腫瘤的臨床及基礎(chǔ)研究，E-mail:liangxiao@live.com

【摘要】目的探討非轉(zhuǎn)移乳腺癌患者外周血中游離無細(xì)胞的DNA(cfDNA)中ErbB-2基因啟動子區(qū)5’CpG甲基化狀態(tài)及其與腫瘤組織中Her-2表達(dá)的關(guān)系。方法分離非轉(zhuǎn)移乳腺癌患者外周血中的cfDNA，利用重亞硫酸鹽測序法(BSP)對分離出的cfDNA及外周血細(xì)胞DNA的ErbB-2基因啟動子區(qū)進(jìn)行5’CpG甲基化分析，免疫組化及FISH方法檢測腫瘤組織中Her-2的表達(dá)情況。結(jié)果ErbB-2基因啟動子區(qū)5’CpG的甲基化只在乳腺癌患者的血漿cfDNA中檢測到(19/40)，在其對應(yīng)的外周血血細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)；乳腺癌患者外周血cfDNA的ErbB-2基因啟動子區(qū)5’CpG甲基化和其腫瘤組織Her-2的表達(dá)成負(fù)相關(guān)。結(jié)論乳腺癌患者外周血cfDNA ErbB-2啟動子區(qū)5’CpG的甲基化狀態(tài)與腫瘤組織Her-2表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。提示外周血cfDNA ErbB-2啟動子區(qū)5’CpG甲基化狀態(tài)能從某種程度上反映乳腺癌患者腫瘤組織Her-2表達(dá)情況，有可能作為乳腺癌Her-2狀態(tài)觀察的新窗口，可用于幫助乳腺癌分子分型判斷，是否能作為乳腺癌治療的新靶點(diǎn)，并作為Her-2陽性患者早期診斷的指標(biāo)，尚有待于進(jìn)一步研究。

【關(guān)鍵詞】乳腺癌；BSP；Her-2；ErbB-2；cfDNA；甲基化

cfDNA ErbB-2 promoter methylation status in peripheral blood of non-metastatic breast cancer patients and its relationship with Her-2 expression in tumor tissueLIANGXiao,GUOMeng,SONGWenzhe，LIYin,ZHUZhiqiang.(DepartmentofBreastandThyroid,TheAffiliatedHospitalofXuzhouMedicalCollege，Xuzhou221000，China)

Correspondingauthor:GUOMeng,E-mail:guomeng62@126.com

Abstract：ObjectiveTo investigate the relationship of methylation of ErbB-2 gene 5’CpG of cfDNA in peripheral blood of non-metastatic breast cancer patients with expression of Her-2 in tumor tissue.MethodsIsolate cell-free DNA in peripheral blood of non-metastatic breast cancer patients, analysis methylation of 5’CpG in ErbB-2 gene promoter using bisulfite-sequencing PCR (BSP), detect the expression of Her-2 using immunohistochemistry and FISH.ResultsMethylation of ErbB-2 gene promoter was only detected in plasma cfDNA of breast cancer patients (19/40), not found in the corresponding peripheral blood cells; Methylation of ErbB-2 gene 5’CpG of cfDNA in peripheral blood of breast cancer patients was negatively correlated with the expression of Her-2 in tumor tissue.ConclusionsMethylation of ErbB-2 gene 5’CpG in peripheral blood of breast cancer patients was negatively correlated with the expression of Her-2 in tumor tissue. We can speculate that the methylation of ErbB-2 gene 5’CpG in peripheral blood of breast cancer patients can reflect the expression of Her-2 breast cancer tissues to some extent, which may be used as a new method to observe Her-2 status of breast cancer, and which also can be used to help determine the molecular typing of breast cancer, and used as a new target for breast cancer treatment, and as an early diagnosis indicator of Her-2 positive patients still needs further study.

Keywords：breast cancer;BSP;Her-2;ErbB-2;CfDNA;methylation

基于Her-2及雌、孕激素等指標(biāo)的乳腺癌的分子分型是乳腺癌分類的重要依據(jù)，不同的分子分型在判斷乳腺癌的自然轉(zhuǎn)歸、治療方案的選擇、治療的敏感性及預(yù)后的判斷上均有不同的特點(diǎn)。Her-2高表達(dá)的乳腺癌患者預(yù)后相對較差，針對Her-2陽性患者的分子靶向治療如曲妥珠單抗效果顯著，Her-2狀態(tài)也影響腫瘤對內(nèi)分泌治療及化療等綜合治療的反應(yīng)[1]。DNA甲基化作為表觀遺傳學(xué)的重要概念，在機(jī)體生理狀態(tài)及腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用[2-3]。外周血是人體宏觀系統(tǒng)的一個指示窗口，游離DNA(cfDNA)檢測具有方便、相對無創(chuàng)、可重復(fù)等優(yōu)點(diǎn)。已有文獻(xiàn)證實(shí)外周血DNA甲基化狀態(tài)的變化與腫瘤組織甲基化狀態(tài)的變化類似，均與腫瘤的分子特點(diǎn)具有相關(guān)性[4]。本課題探討非轉(zhuǎn)移乳腺癌患者外周血cfDNA ErbB-2啟動子區(qū)5’CpG甲基化狀態(tài)及其與腫瘤組織Her-2表達(dá)的關(guān)系，以探索乳腺癌治療新的靶點(diǎn)。

1材料與方法

1.1研究對象

徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2014年非轉(zhuǎn)移乳腺癌患者40例(研究組)及非乳腺癌患者20例(對照組)。

1.2免疫組化及FISH(fluorescent in situ hybridization，熒光原位雜交)檢測腫瘤組織Her-2蛋白表達(dá)和Her-2基因擴(kuò)增

用多聚甲醛將乳腺癌組織固定過夜，經(jīng)石蠟包埋，5μm切片，伊紅蘇木精染色確認(rèn)為乳腺癌組織。免疫組化檢測ErbB-2蛋白表達(dá)：光鏡觀察，陽性反應(yīng)物為棕黃色顆粒，定位于細(xì)胞質(zhì)中。高倍顯微鏡下觀察10個視野：沒有染色或<30%腫瘤細(xì)胞染色為陰性(-)；>30%的腫瘤細(xì)胞有不完整胞質(zhì)著色為弱陽性(+)；>30%的腫瘤細(xì)胞有較弱但完整的胞質(zhì)著色為陽性(++)；>30%的腫瘤細(xì)胞較強(qiáng)完整胞質(zhì)著色為強(qiáng)陽性(+++)。(-)與(+)定義為Her-2陰性，(+++)定義為Her-2陽性，(++)者進(jìn)行FISH檢測：切片經(jīng)常規(guī)脫蠟、水化，酸性亞硫酸鈉處理，胃蛋白酶消化，HCl浸泡，脫水，丙酮固定，50 ℃烘片15 min，加探針工作液于組織切片上，60 ℃變性10 min，40 ℃濕盒雜交過夜，第二天漂洗，避光干燥玻片，DAPI復(fù)染后封片。結(jié)果判定：計數(shù)30個細(xì)胞，統(tǒng)計Ratio值(Ratio值=30個細(xì)胞核中紅熒光總數(shù)/30個細(xì)胞核中綠熒光信號總數(shù))。Ratio<1.8為陰性結(jié)果，提示該樣本無Her-2基因擴(kuò)增；Ratio>2.2為陽性結(jié)果，提示樣本中Her-2基因發(fā)生擴(kuò)增(Ratio在2.3～4.0提示低水平擴(kuò)增，4.1～10提示中水平擴(kuò)增，>10提示高水平擴(kuò)增)；Ratio在1.8～2.2之間時，選擇增加計數(shù)細(xì)胞至100個，或重做FISH來判定最終結(jié)果。

1.3外周血漿cfDNA和血細(xì)胞DNA的提取和亞硫酸鹽修飾

患者采血5 ml置于乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)處理后的抗凝管中，正常對照人群需采血量10 ml。采血過程如果發(fā)生溶血，樣品應(yīng)該棄用。采血后1 h內(nèi)完成血漿cfDNA分離,抗凝血先用800 g離心10 min，取出上清后將該上清再用1 600 g離心10 min，取用上清進(jìn)行cfDNA抽提，第一次離心后的血細(xì)胞進(jìn)行血細(xì)胞DNA的抽提。分別采用QIAamp DNA mini Kit和QIAamp Blood Mini Kit(德國Qiagen公司產(chǎn)品)抽提血漿中的DNA。所獲得的DNA置于-20 ℃保存。采用EpiTect 96 Bisulfate Kit(德國Qiagen公司產(chǎn)品)對DNA進(jìn)行亞硫酸輕鹽修飾。純化后的DNA加入15 μl去離子水溶解。如前所述，這種亞硫酸鹽處理后的DNA可以作為BSP擴(kuò)增的模板進(jìn)行ErbB-2啟動區(qū)表型遺傳狀態(tài)的分析。

1.4BSP分析血漿cfDNA中ErbB-2基因啟動區(qū)5’CpG表型遺傳狀態(tài)及外周血血細(xì)胞中ErbB-2基因啟動子區(qū)5’CpG甲基化狀態(tài)

ErbB-2基因啟動子區(qū)CpG島經(jīng)過重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后，未甲基化的胞嘧啶被修飾為U，而甲基化的胞嘧啶則不發(fā)生此種轉(zhuǎn)化，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增該CpG島后進(jìn)行測序分析就可以了解不同樣品中ErbB-2基因啟動子區(qū)域甲基化的差異。ErbB-2基因啟動子區(qū)域BSP的上游引物為：5’TGGGGTTTATTTGTTAGATTTA 3’，下游引物為：5’CCTCAAAAAAAATCATAAAAAA 3’，擴(kuò)增的ErbB-2基因啟動區(qū)域大小為456 bp。該區(qū)域含有32個CG位點(diǎn)。采用TAKARA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增試劑進(jìn)行擴(kuò)增，PCR的反應(yīng)體系為30 μl，包括修飾后的DNA樣品2 μl，TAQ酶0.15 μl。PCR擴(kuò)增的條件為：第一步，94 ℃預(yù)變性5 min；第二步，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共進(jìn)行40個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR結(jié)束后行2.0%的瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物，回收大小符合預(yù)期的目標(biāo)片段，進(jìn)行TA克隆，T載體選用寶生物的pMD19T，將目標(biāo)PCR產(chǎn)物和載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌top10感受態(tài)細(xì)胞后涂氨芐抗性平板，第二天菌落鑒定，將陽性克隆接種的氨芐抗性的液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床過夜培養(yǎng)后，送上海杰里生物科技有限公司測序。

1.5統(tǒng)計分析

對得到的血漿cfDNA ErbB-2啟動子區(qū)5’CpG甲基化狀態(tài)與腫瘤組織Her-2表達(dá)兩組數(shù)據(jù)，采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件，進(jìn)行卡方檢驗(yàn)及Pearson相關(guān)分析，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1病例信息分析

40例乳腺癌患者的平均年齡53.7歲(SD 10.5)；初潮年齡平均14歲(SD 1.5)；絕經(jīng)前占60%，絕經(jīng)后占40%；初次生育時間平均24歲(SD 4.3)；85%哺乳，15%未哺乳?；颊卟±韺W(xué)特征見表1。

表1　乳腺癌患者病理學(xué)特征

2.2癌組織中Her-2表達(dá)分析(免疫組化及FISH)

40例乳腺癌患者中Her-2陽性11例，Her-2陰性29例。圖1～2為免疫組化陽性與陰性圖，圖3～4為FISH陽性與陰性圖。

圖1　免疫組化(+++)　　　　　　圖2　免疫組化(-)　　　　　　　　圖3　FISH陽性　　　　　　　圖4　FISH陰性

2.3外周血中ErbB-2基因啟動子區(qū)5’CpG甲基化狀態(tài)分析40例乳腺癌患者的外周血中，有19例的血漿cfDNA中檢測到了ErbB-2基因啟動子區(qū)5’CpG的甲基化(19/40)(見圖5)，但其對應(yīng)的外周血細(xì)胞DNA中未發(fā)現(xiàn)該基因的甲基化(見圖6)。在選用的正常對照樣品中無論是血漿cfDNA還是血細(xì)胞DNA中均未檢測到ErbB-2基因啟動子區(qū)5’CpG的甲基化(見圖7～8)。19例能檢測到ErbB-2啟動子區(qū)5’CpG甲基化的患者中有18例的組織中Her-2表達(dá)呈陰性(見表2)。

圖5　乳癌患者血漿cfDNA

圖6　乳癌患者血細(xì)胞DNA

表2　血漿cfDNA ErbB-2基因啟動子區(qū)5’CpG甲基化狀態(tài)與

應(yīng)用卡方檢驗(yàn)患者血漿cfDNA ErbB-2啟動子區(qū)5’CpG甲基化狀態(tài)與腫瘤組織Her-2表達(dá)的關(guān)系，χ2=8.976，P=0.003，說明兩者之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義。進(jìn)一步行pearson相關(guān)性分析，R=-0.474，P=0.002，兩者之間存在負(fù)相關(guān)。

3討論

甲基化是表觀遺傳學(xué)的重要概念。DNA甲基化對正常細(xì)胞的分化[5]，基因印記的維持[6]，X染色體的失活[7]，基因轉(zhuǎn)錄抑制[8]等均起著重要作用；在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中DNA甲基化的作用也已被證實(shí)[2-3]。健康細(xì)胞的抑癌基因啟動子區(qū)甲基化程度低或處于非甲基化狀態(tài)，使得抑癌基因能不斷表達(dá)并發(fā)揮其正常功能從而抑制腫瘤，而腫瘤細(xì)胞的抑癌基因啟動子區(qū)往往發(fā)生甲基化導(dǎo)致受其調(diào)控的基因表達(dá)減弱或被關(guān)閉[9]；反過來，有研究提示，在健康的細(xì)胞中高度甲基化的區(qū)域如果其甲基化水平降低，被這些區(qū)域調(diào)控的癌基因?qū)⒈患せ?，最后也會?dǎo)致腫瘤的發(fā)生[10]。

目前，外周血中存在的游離DNA(cfDNA)引起了腫瘤學(xué)界的極大關(guān)注。大量的研究表明外周血中游離的腫瘤相關(guān)基因的異常甲基化狀態(tài)，與其對應(yīng)的腫瘤組織相應(yīng)基因的異常甲基化狀態(tài)具有一定的相關(guān)性，使得檢測外周血中游離DNA的甲基化狀態(tài)有望成為新的病理診斷的窗口。cfDNA一般情況下來源于凋亡的造血細(xì)胞，而腫瘤患者較非腫瘤患者的外周血中含有更高濃度的cfDNA，可能與腫瘤細(xì)胞等釋放大量DNA入血有關(guān)。cfDNA檢測對惡性腫瘤的篩查、預(yù)后判斷與療效檢測等均有重要意義[4]。有實(shí)驗(yàn)表明，cfDNA中ITIH5等抑癌基因甲基化的改變可作為乳腺癌篩查的指標(biāo)[11]。

Her-2陽性乳腺癌具有惡性程度高，易轉(zhuǎn)移，易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)。2005年的St. Gallen國際乳腺癌治療專家共識將Her-2列為重要的單項(xiàng)風(fēng)險因素，乳腺癌患者的Her-2狀態(tài)，包括蛋白表達(dá)及基因擴(kuò)增情況，是評估患者預(yù)后的重要因素[1]。有研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者腫瘤組織中EerbB-2啟動子區(qū)5’CpG的甲基化明顯高于癌旁組織[12]，提示ErbB-2基因啟動子區(qū)5’CpG的甲基化導(dǎo)致其表達(dá)受抑是乳腺癌發(fā)生發(fā)展的一個重要因素。在本次實(shí)驗(yàn)中我們選用了BSP的方法，相比使用最多的MSP，此方法涵蓋的CpG區(qū)域更大。我們的這次研究中選用的該基因的啟動子區(qū)至少包含了22個CpG位點(diǎn)。

本研究顯示，乳腺癌患者外周血cfDNA ErbB-2啟動子區(qū)5’CpG甲基化狀態(tài)與腫瘤組織Her-2表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(R=-0.474，P=0.002)。提示：外周血cfDNA ErbB-2啟動子區(qū)5’CpG甲基化狀態(tài)能反映乳腺癌患者腫瘤組織Her-2表達(dá)狀況，可作為乳腺癌Her-2狀態(tài)觀察的新窗口，用于乳腺癌分子分型判斷，或可成為乳腺癌治療的新靶點(diǎn)，并作為Her-2陽性患者早期診斷的指標(biāo)。為避免干擾因素，本實(shí)驗(yàn)亦對外周血血細(xì)胞DNA中ErbB-2啟動子區(qū)5’CpG甲基化狀態(tài)進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，研究組及對照組外周血血細(xì)胞DNA的ErbB-2啟動子5’CpG區(qū)均未檢測到甲基化，排除了外周血細(xì)胞對本實(shí)驗(yàn)的干擾，增加了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性。

乳腺癌患者外周血cfDNA ErbB-2啟動子區(qū)5’CpG甲基化狀態(tài)與腫瘤組織Her-2表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。提示外周血cfDNA ErbB-2啟動子區(qū)5’CpG甲基化狀態(tài)能從某種程度上反映乳腺癌患者癌組織Her-2表達(dá)情況，有可能作為乳腺癌Her-2狀態(tài)觀察的新窗口，可用于幫助乳腺癌分子分型判斷，是否能作為乳腺癌治療的新靶點(diǎn)、并作為Her-2陽性患者早期診斷的指標(biāo)，尚有待于進(jìn)一步研究。

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論著

[收稿日期：2015-02-06][本文編輯：戴雅玥]

文章編號：1674-4136(2015)04-0212-05

doi：10.3969/j.issn.1674-4136.2015.04.003

通訊作者：郭萌，男，本科，副主任醫(yī)師，專業(yè)特長：甲狀腺和乳腺腫瘤的診斷與治療，E-mail:guomeng62@126.com