bFGF和PDGF-B蛋白在腦缺血再灌注大鼠模型中的表達和血管形成的研究

劉伯芹　王國峰　仲　玲　趙仁亮

266002　青島市第九人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(劉伯芹　王國峰　仲　玲)；青島大學附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科[趙仁亮(通信作者)]

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bFGF和PDGF-B蛋白在腦缺血再灌注大鼠模型中的表達和血管形成的研究

劉伯芹王國峰仲玲趙仁亮

266002青島市第九人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(劉伯芹王國峰仲玲)；青島大學附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科[趙仁亮(通信作者)]

腦血管病嚴重危害人類的健康，急性腦缺血、缺氧可誘導缺血區(qū)血管保護性增生，新生血管能夠改善缺血區(qū)周圍的組織灌流，增加半暗帶氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的供應，促進缺血后神經(jīng)功能的恢復[1]。堿性成纖維細胞生長因子(bFGF))和血小板源性生長因子-B(PDGF-B)在缺血性腦損傷后血管的再生和重塑過程中扮演重要角色。PDGF-B是一種分泌性蛋白，是機體內(nèi)較強的促有絲分裂劑和化學誘導劑，不但與機體組織的生長發(fā)育以及各種損傷后修復有密切的關系，而且在血管新生中發(fā)揮重要生物效應如細胞增殖、趨化、遷移及成管作用等，調(diào)節(jié)血管壁形成、促進血管成熟。bFGF在體內(nèi)和體外均能明顯促進新生血管形成，可趨化血管內(nèi)皮細胞(ECs)及平滑肌細胞，并促進其增殖和遷移，使缺血性腦損傷后血管得以再生和重塑，是主要的血管生成因子[2]。

本研究通過建立局灶性腦缺血再灌注模型，動態(tài)檢測缺血再灌注不同時間窗bFGF、PDGF-B 蛋白的表達和微血管密度(MVD)的變化，以探討缺血再灌注損傷時新生血管的形成，bFGF、PDGF-B在腦損傷中的作用及其與血管形成的關系。

1材料與方法

1.1實驗動物分組SPF級SD大鼠48只，體重250～300 g，清潔級，由青島市藥物檢驗所實驗動物中心提供。實驗大鼠隨機分成假手術(shù)組(6只)和MCAO/R組。缺血2 h后根據(jù)再灌注時間窗的不同分為0、6、24 h、3、7、14、21 d共7組，每組各6只大鼠。

1.2模型制作采用Zea-Longa線栓法[3]建立左側(cè)大腦中動脈缺血再灌注模型。采用10%水合氯醛35 mg/100 g腹腔注射麻醉，頸正中切口，分離左側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)外動脈，然后經(jīng)左側(cè)頸外-頸內(nèi)動脈插線(18.5±2) mm，阻斷大腦中動脈2 h后拔線，分別于再灌注0、6、24 h、3、7、14、21 d后處死大鼠。大鼠清醒后觀察其行為和神經(jīng)癥狀，以大鼠清醒后出現(xiàn)右前肢不能伸展、爬行時向右側(cè)轉(zhuǎn)圈并存活至規(guī)定時間點作為造模成功的標準。各組大鼠術(shù)中均用白熾燈使其肛溫維持在(37±0.5) ℃，術(shù)后單籠飼養(yǎng)。假手術(shù)組大鼠血管分離同前，但不阻斷左側(cè)大腦中動脈。

1.3腦梗死體積的測定每組大鼠在規(guī)定時間內(nèi)用4%多聚甲醛行心內(nèi)灌注后斷頭取腦；將大腦沿冠狀位橫切為6片(厚2 mm)，去除額極，將切好的腦片固定于同一固定液中4 h；常規(guī)脫水、透明、浸蠟和石蠟包埋。每個蠟塊切取一張(片厚5 μm)，行HE染色觀察病理變化，并使用Simple PCI圖像分析軟件(美國Compix公司)計算梗死體積百分比=(非缺血側(cè)體積-缺血側(cè)正常腦組織體積)/非缺血側(cè)體積×100%，非缺血側(cè)體積或者缺血側(cè)正常腦組織體積= (s1+s2+s3+s4+s5)×2 [s表示每片應該計算的面積，2表示每片厚度(mm)]。

1.4bFGF、PDGF-B及CD34蛋白表達水平檢測對bFGF、PDGF-B蛋白表達水平的檢測采用鏈酶親和素-生物素-過氧化物酶復合物(Streptavidin-biotin- peroxidase complex，SABC)免疫組織化學染色法，嚴格按試劑盒提供的實驗步驟進行操作：石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，3% H2O2室溫10 min以滅活內(nèi)源性酶；微波爐加熱至沸騰后斷電，熱修復抗原；滴加封閉液，室溫20 min；滴加1∶100工作濃度的一抗，4 ℃過夜后；滴加生物素化二抗，37 ℃孵育30 min；滴加試劑SABC，37 ℃孵育30 min；DAB室溫顯色，鏡下控制反應時間；蒸餾水洗滌中止反應；梯度酒精脫水，二甲苯透明，封片。位于胞漿或胞核內(nèi)棕黃色或黃褐色顆粒為陽性表達。

CD34蛋白的表達水平檢測亦采用SABC法進行檢測，嚴格按試劑盒提供的實驗步驟進行操作。位于胞漿內(nèi)棕黃色顆粒為陽性表達。計數(shù)CD34抗體染色的單細胞或細胞團，有無管腔形成不限，只要與周圍血管和組織有清楚的分離即認為是可計數(shù)的微血管。計數(shù)微血管密度(microvascular density，MVD)MVD參照Weidner等方法[4]進行：每張切片先在低倍鏡(×100倍)下選擇梗死灶周圍4個血管密度最高的區(qū)域，再在高倍鏡(×400倍)下計數(shù)微血管數(shù)，均值即為MVD。即用型SABC試劑盒、兔抗大鼠CD34多克隆抗體、兔抗大鼠bFGF多克隆抗體、兔抗大鼠PDGF-B多克隆抗體試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司。

2結(jié)果

2.1腦梗死體積假手術(shù)組大鼠HE染色神經(jīng)細胞的數(shù)量及形態(tài)分布正常，無缺血灶。MCAO/R組大鼠左側(cè)大腦中動脈供血區(qū)包括大腦額、頂皮質(zhì)、紋狀體、海馬等表現(xiàn)出不同程度的損傷改變?nèi)绻Ｋ涝钪行目梢娒黠@組織稀疏，神經(jīng)細胞出現(xiàn)脫失及細胞變形；梗死灶周圍神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細胞腫脹，部分細胞核固縮、濃染，出現(xiàn)膠質(zhì)細胞浸潤。MCAO/R 0h組梗死灶體積最小，隨缺血再灌注時間的延長梗死灶體積逐漸增加，到第3 d達到高峰，持續(xù)至7 d左右，14 d梗死灶體積有所減小，組間有明顯差異(P<0.05)(表1)。

表1　各組大鼠腦組織梗死體積百分比比較±s)

注：與MCAO/R 0 h組比較，﹡P<0.05

2.2各組間MVD表達水平假手術(shù)組CD34蛋白表達不明顯。MCAO/R組在梗死灶周邊可見有形態(tài)不規(guī)則微血管存在，管腔由染成棕黃色的內(nèi)皮細胞圍成，主要分布在額頂葉皮質(zhì)和紋狀體(圖1)。缺血再灌注6～24 h微血管分布比較稀疏，組間差異不明顯(P>0.05)，CD34陽性細胞在缺血再灌注3 d明顯升高，7 d到達高峰，微血管在缺血灶周邊區(qū)分布最為密集。MVD在缺血再灌注3、7、14 d組與缺血再灌注6 h組比較有統(tǒng)計學差異(P<0.05)(表2)。

圖1 MVD表達水平 A為MCAO/R6h組,B為MCAO/R7d組,箭頭指示為新生血管(SABC法×400倍)

2.3各組間bFGF、PDGF-B的表達水平bFGF在假手術(shù)組有少量表達，缺血再灌注6 h后開始升高，隨再灌注時間延長表達繼續(xù)增加，3 d到達高峰，主要表達于梗死灶周邊的神經(jīng)元、膠質(zhì)細胞和血管內(nèi)皮細胞(圖2)；MCAO/R 3 d組與MCAO/R 6 h組比較，有明顯差異(P<0.05)，持續(xù)至7 d左右，bFGF 在再灌注14 d時開始降低，MCAO/R 21 dbFGF陽性細胞數(shù)明顯減少，與MCAO/R 6 h組比較無明顯差異(P>0.05)。 PDGF-B在假手術(shù)組神經(jīng)元也有陽性表達，MCAO/R組PDGF-B陽性細胞數(shù)在MCAO/R 24 h后明顯升高，梗死周邊小膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞及神經(jīng)元均可見到顆粒狀特異免疫著色(圖3)；與假手術(shù)組比較，有明顯差異(P<0.05)；隨再灌注時間延長表達也繼續(xù)增加，3 dPDGF-B表達到高峰，7 dPDGF-B表達有所下降，但是與假手術(shù)組比較，仍有明顯差異(P<0.05)，14 dPDGF-B陽性細胞數(shù)又有所升高，形成第2個表達高峰，主要表達于梗死灶周圍血管內(nèi)皮細胞中(表2)。

圖2 bFGF蛋白表達水平 A為MCAO/R6h組,B為MCAO/R3d組(SABC法×400倍)

圖3 PDGF-B蛋白表達水平 A為MCAO/R6h組,B為MCAO/R3d組(SABC法×400倍)

表2　　各組大鼠腦梗死灶MVD、bFGF及PDGF-B蛋白

注：與假手術(shù)組比較，﹡P<0.05，與MCAO/R 6 h組比較，﹟P<0.05

2.4bFGF、PDGF-B表達水平與血管形成的相關性Pearson相關分析顯示，bFGF及PDGF-B蛋白表達水平與MVD的變化呈正相關(r分別為0.642、0.706，P<0.01)(圖4)。

圖4 bFGF、PDGF-B蛋白表達與MVD的相關性 A為bFGF蛋白表達與MVD的相關性;B為PDGF-B蛋白表達與MVD的相關性

3討論

盡快恢復缺血區(qū)的血液供應對缺血后神經(jīng)功能的恢復至關重要，缺血半暗帶血流的恢復有賴于側(cè)支循環(huán)的建立[5]。局灶性腦缺血再灌注是在局灶性腦缺血的基礎上閉塞的血管再通，血流重新恢復。本實驗通過缺血2 h后再灌注模型，結(jié)果顯示缺血2 h后出現(xiàn)腦梗死灶，隨再灌注時間延長梗死體積增加，到3 d梗死體積最大，表明缺血再灌注后啟動損傷機制。但是缺血再灌注14 d梗死體積減小，提示隨血流逐漸恢復，再灌注后期腦損傷逐漸修復。因此，缺血再灌注后血流的重新恢復對機體可能有雙重作用，即早期可能加劇腦損傷，但是隨著灌注時間的延長腦損傷得到修復。有研究發(fā)現(xiàn)，急性腦缺血后缺血半暗帶微血管的密度與患者生存時間的延長有關，血管的新生對患者的恢復非常重要。缺血后血管新生是一個多因子參與調(diào)節(jié)的復雜過程，包括血管生成生長因子、血管外基質(zhì)、蛋白水解酶系統(tǒng)以及血流的剪切力等眾多因素，其中ECs的增殖、遷移和重塑是血管新生的根本途徑[6]。bFGF和PDGF-B 作為血管新生調(diào)節(jié)因子，在缺血性腦損傷后血管形成過程中發(fā)揮重要作用。

bFGF是一種堿性蛋白，可以直接作用于ECs，促進其增殖和遷移，對血管形成起正調(diào)控的作用。動物模型發(fā)現(xiàn)，腦缺血后1 h梗死區(qū)域的神經(jīng)元出現(xiàn)bFGF mRNA的表達，14 d內(nèi)表達持續(xù)升高，梗死灶周邊的神經(jīng)元在缺血后1 d出現(xiàn)bFGF表達，ECs和膠質(zhì)細胞在梗死后14 d內(nèi)均不同程度地表達bFGF[7-8]。本實驗發(fā)現(xiàn)，bFGF蛋白表達水平在缺血再灌注6 h后開始升高，隨再灌注時間延長表達明顯增加，3 d到達高峰，主要表達于梗死灶周邊的神經(jīng)元、膠質(zhì)細胞和ECs，持續(xù)至7 d左右；同時發(fā)現(xiàn)在缺血再灌注6～24 h內(nèi)微血管分布比較稀疏，新生血管形成較少，MVD在缺血再灌注早期表達不明顯，MVD在缺血再灌注3 d開始明顯升高，7 d到達高峰，這提示缺血再灌注損傷后bFGF蛋白表達高峰與新生血管形成的高峰并不完全一致。雖然bFGF蛋白表達早于血管的形成，但是Pearson相關分析顯示，bFGF蛋白表達水平與MVD的變化呈正相關；這說明腦缺血再灌注后刺激內(nèi)源性bFGF應激表達，隨著bFGF持續(xù)表達增高，bFGF促進血管的新生，改善腦局部血流，從而促進受損神經(jīng)組織的修復。此外，bFGF作為一種神經(jīng)營養(yǎng)因子，促進血管新生的同時，在神經(jīng)細胞的生長和發(fā)育中也起重要作用；它可以直接營養(yǎng)神經(jīng)元，還可以通過促進神經(jīng)干細胞的增殖、分化，促進缺氧、缺血腦損傷后神經(jīng)系統(tǒng)的修復與再生[9]。因此，缺血再灌注損傷后，bFGF可能通過包括促進血管新生在內(nèi)的多種途徑保護神經(jīng)組織，改善腦梗死大鼠預后。

PDGF-B是一種促細胞分裂劑，具有刺激ECs、成纖維細胞等特定細胞群分裂增殖的能力，在缺血性腦損傷的修復中具有重要作用[10]。有研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠左側(cè)大腦中動脈閉塞模型中雙側(cè)腦組織PDGF-B mRNA在造模后3 h～7 d內(nèi)均有升高[11]。缺血性腦卒中后PDGF及其受體系統(tǒng)通過介導內(nèi)皮細胞與周細胞的相互作用來支持血管增生以及重塑，但同時也參與血管損傷后的血管新生內(nèi)膜形成，導致血管再狹窄[12]。本實驗中PDGF-B蛋白在假手術(shù)組神經(jīng)元也有陽性表達；在MCAO/R組PDGF-B蛋白表達在MCAO/R 24 h后明顯升高，梗死灶內(nèi)和梗死周邊膠質(zhì)細胞及神經(jīng)元均可見陽性表達，隨再灌注時間延長表達繼續(xù)增加，3 dPDGF-B表達到高峰，7 dPDGF-B表達有所下降，14 d PDGF-B在梗死灶周圍ECs中表達增多，并形成第2個高峰。PDGF-B在缺血再灌注損傷后表達變化與新生血管變化基本一致，且Pearson相關分析顯示PDGF-B蛋白表達與MVD的變化呈正相關，這提示PDGF-B在缺血再灌注損傷后血管新生過程中發(fā)揮重要作用。此外，盡管在缺血再灌注3 d開始出現(xiàn)血管新生，但梗死體積仍為最大，主要考慮可能與早期新生血管結(jié)構(gòu)、功能不全相關，由于新生血管不完整、不成熟，微血管滲漏及血腦屏障的通透性增加，一定程度上加重腦水腫，并增加出血風險；到缺血再灌注14 d隨著新生血管結(jié)構(gòu)和功能的成熟，梗死體積開始減輕。

綜上所述，局灶性腦缺血再灌注后可刺激內(nèi)源性bFGF和PDGF-B表達增加，并誘導新生血管形成，產(chǎn)生內(nèi)源性腦保護機制，在缺血性腦損傷修復中具有重要作用。

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(2014-12-24收稿)

【摘要】目的探討腦缺血再灌注大鼠不同時間堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)和血小板源性生長因子-B(PDGF-B)的表達水平及其與血管形成的關系。方法采用線栓法制備大鼠大腦中動脈局灶性腦缺血再灌注(MCAO/R)模型，分為假手術(shù)組和MCAO/R組，MCAO/R組缺血2 h后根據(jù)再灌注時間窗的不同分為0、6、24 h、3、7、14、21 d共7組，應用HE染色觀察病理變化并測定腦梗死體積，用免疫組化法檢測CD34蛋白的表達水平并計數(shù)微血管密度(MVD)，用免疫組化法檢測bFGF和PDGF-B蛋白的表達水平。結(jié)果bFGF蛋白表達水平在MCAO/R 6 h后即開始升高，3 d到達高峰，7 d開始降低。PDGF-B蛋白表達水平在MCAO/R 24 h后明顯升高，3 d到達高峰，7 d有所下降，持續(xù)到14 d左右。MVD表達在MCAO/R 3 d開始升高，7 d到達高峰。bFGF和PDGF-B蛋白表達水平與MVD變化呈正相關(P<0.01)。結(jié)論局灶性腦缺血再灌注損傷可誘導bFGF、PDGF-B和新生血管表達增加，激活內(nèi)源性腦保護機制。

【關鍵詞】堿性成纖維細胞生長因子血小板源性生長因子-B血管形成腦缺血

【DOI】10.3969/j.issn.1007-0478.2015.04.002

The expression of basic fibroblast growth factor，platelet-derived growth factor B chain and its effects on angiogenesis in rats following cerebral ischemia/reperfusionLiuBoqin，WangGuofeng,ZhongLing,etal.DepartmentofNeurology，QingdaoNinthPeople'sHospital，Qingdao266002

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effects of angiogenesis and the expression changes of basic fibroblast growth factor (bFGF) and platelet-derived growth factor B chain(PDGF-B ) in rats following focal cerebral ischemia/reperfusion.MethodsA model of the middle cerebral artery occlusion 2h / reperfusion (MCAO/R) in rats was performed with the intraluminal filament occlusion. Rats were divided into sham operation group and MCAO/R group. Two hours after ischemia the MCAO/R group was divided into 7 subgroups according to reperfusion time difference, including 0, 6, 24 h, 3, 7, 14, 21 d. Brain sections were stained with hematoxylin and eosin (HE) for surveying the volume of infraction. The expression of microvascular density(MVD)was determined by immunohistochemical staining. The expression of bFGF and PDGF-B protein were determined by mmunohistochemical staining.ResultsThe expressions of bFGF began to increase at 6 h after ischemia/reperfusion. It reached climax at 3 d and reduced after 7 d. The expressions of PDGF-B were significantly increased at 24 h after ischemia/reperfusion, with the first peak at 3 d and the second peak was at 14 d. The expressions of MVD began to increase at 3 d after ischemia/reperfusion and continue to 14 d. There was a significant positive correlation between expression of bFGF, PDGF-B and change of MVD(P<0.05).ConclusionsIschemia and reperfusion injury can induce expression of bFGF, PDGF-B and angiogenesis, which might play an important role in the internal protection of neurons.

【Key words】Basic fibroblast growth factorPlatelet-derived growth factor B chainAngiogenesisCerebral ischemia

【中圖分類號】R743

【文獻標識碼】A

【文章編號】1007-0478(2015)04-0198-05