9種中藥口服制劑微生物限度與控制菌檢查法的建立及方法學(xué)驗(yàn)證

張小華，王婷婷，徐玉娥

甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050

細(xì)菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)是檢測非規(guī)定滅菌制劑及原、輔料受微生物污染程度的方法。也是用于評價生產(chǎn)企業(yè)的藥用原料、輔料、設(shè)備、器具、工藝流程、環(huán)境和操作者的衛(wèi)生狀況的重要手段和依據(jù)。由于某些供試品具有抗菌活性，在建立測定方法或原測定法的檢驗(yàn)條件發(fā)生改變時，可能影響檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，必須對供試品的抑菌活性及測定方法的可靠性進(jìn)行驗(yàn)證。而驗(yàn)證的目的是確認(rèn)所采用的方法是否適合于供試品的微生物限度檢查。

本研究按照2010年版《中國藥典》(一部)微生物限度檢查法的規(guī)定，根據(jù)中藥制劑抑菌作用強(qiáng)度不同，采用常規(guī)法，培養(yǎng)基稀釋法進(jìn)行9個品種醫(yī)院制劑的細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證及控制菌檢查方法的驗(yàn)證，以建立適合該品種的微生物限度檢查方法。

1 材料

1.1 儀器 LDZX-50FBS立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠)；SPX-智能型生化培養(yǎng)箱(寧波江南儀器廠)；MJX-智能型霉菌培養(yǎng)箱(寧波江南儀器廠)；METTLER AE240電子分析天平(賽多利斯公司)。

1.2 驗(yàn)證用菌株 枯草芽孢桿菌CMCC(B)63501、大腸埃希菌CMCC(B)44102、金黃色葡萄球菌CMCC(B)26003、白色念珠菌CMCC(F)98001、黑曲霉CMCC(F)98003，均由中國藥品生物制品檢定所提供。

1.3 培養(yǎng)基 PH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液(批號：100328)、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(批號：1003292)、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基(批號：100409)、膽鹽乳糖培養(yǎng)基(批號：100429)、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基(批號：0912282)、曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基(批號：090303)、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(批號：100319)，均由中國藥品生物制品檢定所提供。

1.4 樣品 健胃清腸合劑(批號：20130724，20130725，20130726)、復(fù)方萱草顆粒(批號：20130722，20130731，20130808)、通竅鼻淵丸(批號：20130401，20130415，20130425)、健胃消食合劑(批號：20130621，20130708，20130807)、健 胃 止 瀉 合 劑 (批 號 ：20130808，20130822，20131012)、健胃止血合劑(批號：20130514，20130717，20131202)、姜石腸炎康顆粒(批號：20130727，20130814，20130829)、清熱解毒合劑(批號：20130418，20130611，20130727)、痛風(fēng)平顆粒(批號：20130725，20130806，20130827)以上制劑均由甘肅省中醫(yī)院藥學(xué)部制劑室提供。

2 方法與結(jié)果［1-7］

2.1 菌液制備 接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，經(jīng)30～35℃培養(yǎng)18～24小時。取上述肉湯培養(yǎng)物1mL，加9mL 0.9%無菌氯化鈉溶液，10倍逐級稀釋至菌數(shù)約為50～100 cfu/mL，做菌液組計(jì)數(shù)備用。接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中25℃培養(yǎng)24～48小時后，用9mL 0.9%無菌氯化鈉溶液，10倍逐級稀釋至菌數(shù)約為50～100 cfu/mL，做菌液組計(jì)數(shù)備用。取經(jīng)25℃培養(yǎng)7天的黑曲霉斜面培養(yǎng)物，加3～5mL 0.9%無菌氯化鈉溶液洗下霉菌孢子，吸取霉菌孢子液1mL加9mL 0.9%無菌氯化鈉溶液，10倍逐級稀釋為菌數(shù)約為50～100 cfu/mL，做菌液組計(jì)數(shù)備用。

2.2 供試液制備 液體樣品各取10mL，固體樣品各取10 g，加入pH7.0的氯化鈉-蛋白胨緩沖液100 mL中，45℃水浴振搖，使樣品完全分散均勻，作為1∶10供試液；通竅鼻淵丸取10 g，加入pH 7.0的氯化鈉-蛋白胨緩沖液100mL中，乳缽研勻，45℃水浴振搖，使樣品完全分散均勻，作為1∶10供試液。

2.3 細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法選擇實(shí)驗(yàn)及有效性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

2.3.1 常規(guī)法 依法進(jìn)行下列3組實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)組：分別取1mL 1∶10的供試液及50～100 cfu/mL的陽性菌液，同時加入平皿中，立即傾注20 mL 45℃左右的瓊脂培養(yǎng)基，每株陽性菌平行制備2個平皿，待凝固后，置規(guī)定溫度培養(yǎng)24～72小時觀察，按平皿法測定其菌數(shù)；菌液組：測定所加的陽性菌數(shù)；供試品對照組：取與實(shí)驗(yàn)組同一供試液測定供試品本底菌數(shù)。

2.3.2 培養(yǎng)基稀釋法 取1 mL 1∶10的供試液，分別采用加0.5mL/皿、0.2mL/皿供試液及50～100 cfu實(shí)驗(yàn)菌的方法，分別加入2～10個平皿中，同常規(guī)法進(jìn)行其他操作。

2.3.3 計(jì)算回收率 回收率(%)=［(實(shí)驗(yàn)組菌數(shù)－供試品組菌數(shù))/菌液組菌數(shù)］×100%，《中國藥典》2010年版規(guī)定對各陽性菌株的回收率均不得低于70%。

2.3.4 細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法選擇實(shí)驗(yàn) 細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法選擇實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1—3。

表1 培養(yǎng)基稀釋度(0.5 mL/皿)法對各實(shí)驗(yàn)菌株的回收率均值

表2 培養(yǎng)基稀釋度(0.2mL/皿)法對各實(shí)驗(yàn)菌株的回收率均值

表3 常規(guī)法測定9種中藥制劑對各實(shí)驗(yàn)菌株的回收率均值

由表1結(jié)果可見，金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌用培養(yǎng)基稀釋法0.5mL/皿時，通竅鼻淵丸、清熱解毒合劑各陽性菌的回收率均＞70%，說明供試品稀釋至0.5mL/皿時，其抑菌活性可忽略不計(jì)，供試品中各類污染的細(xì)菌均能順利檢出；姜石腸炎康顆粒在用培養(yǎng)基稀釋法0.2mL/皿實(shí)驗(yàn)時，陽性菌的回收率均＞70%，細(xì)菌可用培養(yǎng)基稀釋法(0.2mL/皿)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，霉菌及酵母菌均可用常規(guī)法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

由表2結(jié)果可見，健胃清腸合劑、復(fù)方萱草顆粒、健胃消食合劑、健胃止瀉合劑、健胃止血合劑、痛風(fēng)平顆粒6個品種用常規(guī)方法實(shí)驗(yàn)，對陽性菌大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽胞桿菌、白色念珠菌、黑曲霉無抑菌作用，回收率均大于70%；通竅鼻淵丸、清熱解毒合劑、姜石腸炎康顆粒的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌回收率低于70%，表明其具有一定的抑制大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的作用，檢驗(yàn)時應(yīng)消除其抑菌活性后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.4 控制菌大腸埃希菌及大腸菌群檢查方法有效性驗(yàn)證［8］

2.4.1 大腸埃希菌 取1∶10供試液10mL及10～100 cfu大腸埃希菌加至100mL膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18～24小時后，按《中國藥典》2010年版控制菌檢驗(yàn)方法檢查。同法操作，加10～100 cfu金黃色葡萄球菌作陰性對照。

2.4.2 大腸菌群 取 1∶10、1∶100、1∶1000供試液各1.0mL及10～100 cfu大腸埃希菌加至10mL膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18～24小時后，按《中國藥典》2010年版控制菌檢驗(yàn)方法檢查。同法操作，加10～100 cfu金黃色葡萄球菌作陰性對照。

結(jié)果表明，健胃清腸合劑等9個品種實(shí)驗(yàn)組都檢出大腸埃希菌、陰性菌對照組都未檢出金黃色葡萄球菌，表明控制菌檢查方法學(xué)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)成立，即取1∶10供試液10mL或1mL按常規(guī)法進(jìn)行控制菌檢查可行，在此條件下樣品溶液對控制菌大腸埃希菌無抑制作用。

3 討論

藥品污染微生物不僅危及患者用藥安全，而且也直接影響藥品的有效性。微生物限度檢驗(yàn)中，確認(rèn)供試品在該檢驗(yàn)量、該檢驗(yàn)條件下無抑菌活性或其抑菌活性已被充分消除，才能保證檢驗(yàn)結(jié)果真實(shí)反應(yīng)制劑的微生物污染情況［9］。

中藥制劑成方藥味通常較多，抑菌活性強(qiáng)度不同，實(shí)驗(yàn)過程中，對具有較強(qiáng)抑菌活性的制劑進(jìn)行檢驗(yàn)時，首選簡便有效的培養(yǎng)基稀釋法，抑菌作用強(qiáng)的制劑還可選擇離心沉淀法、薄膜過濾法等。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，健胃清腸合劑、復(fù)方萱草顆粒、健胃消食合劑、健胃止瀉合劑、健胃止血合劑、痛風(fēng)平顆粒6個品種基本無抑菌活性，細(xì)菌、霉菌及酵母菌的檢驗(yàn)均可采用常規(guī)法。姜石腸炎康顆粒、通竅鼻淵丸、清熱解毒合劑3個品種具有不同程度的抑菌活性，但可通過稀釋法消除抑菌作用。

由于控制菌檢查為一次性報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果，故應(yīng)注意方法的有效性確認(rèn)，以提高檢驗(yàn)結(jié)果的可靠性?？诜o藥制劑中，不含藥材原粉的制劑需要檢查大腸埃希菌，含藥材原粉的制劑除檢查大腸埃希菌外，還要進(jìn)行大腸菌群的檢查。對9個品種的口服中藥制劑控制菌檢查方法有效性驗(yàn)證結(jié)果表明，健胃清腸合劑等9個品種中藥制劑均可使用常規(guī)法進(jìn)行控制菌檢查。

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