三硝基苯磺酸／乙醇灌腸液誘導(dǎo)大鼠潰瘍性結(jié)腸炎TLR4／NF-κB和PI3K／AKT／NF-κB信號通路的表達(dá)及電針的干預(yù)作用

張超賢，郭李柯，郭曉鳳

（1．新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，河南衛(wèi)輝 453100；2．新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院口腔內(nèi)科，河南衛(wèi)輝 453100；3．杭州市第六人民醫(yī)院肝病科，浙江杭州 310014）

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）的病因和發(fā)病機制與免疫功能紊亂有密切的聯(lián)系。促炎細(xì)胞因子上調(diào)，可誘導(dǎo)和促進(jìn)炎癥發(fā)生，在UC的形成中起重要作用，而且這些細(xì)胞因子的表達(dá)和分泌量均與UC疾病的炎癥程度呈正相關(guān)。TNF-α和IL-1β是兩種重要的促炎細(xì)胞因子，通過免疫組化染色已證實TNF-α、IL-1β蛋白在UC腸黏膜細(xì)胞中呈高表達(dá)狀態(tài)［1-2］；核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）廣泛存在于各種細(xì)胞中，可調(diào)控多種基因、細(xì)胞因子及生長因子的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，參與調(diào)控機體免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡及腫瘤形成等多種生理和病理過程，與UC關(guān)系密切。國內(nèi)外研究表明，NF-κB在UC患者機體內(nèi)呈現(xiàn)過度激活狀態(tài)，導(dǎo)致并調(diào)控UC患者TNF-α、IL-1β等細(xì)胞因子過度和持續(xù)表達(dá)，從而參與了UC的發(fā)生和發(fā)展。toll樣受體4（TLR4）NF-κB和PI3K／AKT／NF-κB信號通路是活化NF-κB的兩條重要途徑［3-4］。電針對UC有良好的治療效果［5］，但這種作用是否與其阻斷 TLR4／NF-κB 和 PI3K／AKT／NF-κB 信 號 通路、抑制NF-κB活性及下游促炎細(xì)胞因子的表達(dá)有關(guān)尚不清楚。本研究以三硝基苯磺酸（TNBS）誘導(dǎo)大鼠 UC，以 TLR4單克隆抗體（TLR4mAb）和PI3K／AKT特異性抑制劑LY294002作為治療對照組，觀察電針對UC大鼠結(jié)腸黏膜病理組織學(xué)、TLR4／NF-κB和 PI3K／AKT／NF-κB通路和下游促炎細(xì)胞因子表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討電針治療UC的作用機制。

1 材料與方法

1．1 材料 成年雄性健康清潔級 Wistar大鼠240只，體質(zhì)量180～220g（由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供）。2、4、6-三硝基苯磺酸（TNBS，Sigma公司）；LY294002（美國Promega公司）；TLR4mAb（Biolegend公司）。DelDoc2000凝膠掃描儀（BLO-Rad公司，美國）；Trizol試劑 （美 國Invitrogen 公 司）；TLR4、PI3K、AKT、NF-κB、TNF-α、IL-1β及 β-actin基因引物（上海生工生物工程公司）；RT-PCR（一步法）試劑盒（寶生物工程有限公司）；NE-PER核蛋白-胞漿蛋白抽提試劑盒購自美國Thermo Scientific公司；抗磷酸化 Akt（ser473）抗體購自 CellSignalingTechnology；NF-κB兔抗鼠多克隆一抗和 HRP羊抗兔二抗購自美國Santa Cruz公司。

1．2 動物分組與模型制作 SD大鼠術(shù)前禁食24h，自由飲水，隨機分為6組：正常對照組、模型組、電針組、TLR4單克隆抗體（TLR4mAb）組、LY294002組、TLR4mAb＋LY294002聯(lián)合治療組，每組各40只。正常對照組不造模，模型組和治療組參考文獻(xiàn)［6］的方法造模，腹腔注射100g／L的水合氯醛使大鼠輕微麻醉，而后將一直徑2．0mm、長約12cm的硅膠管用石蠟油潤滑，由肛門輕緩插入大鼠體內(nèi)深約8cm，緩慢注入含100mg／kg TNBS的等容積無水乙醇溶液，然后提起大鼠尾部，持續(xù)倒置10min，使造模劑充分滲入大鼠腸腔內(nèi)。造模后，自然清醒，自由飲食。造模后第3天，各組開始給藥，連續(xù)4周。電針組取雙側(cè)足三里穴，采用華佗牌30號半寸毫針，針尖圓滑，針刺時大鼠固定為仰臥位，對足三里穴做常規(guī)消毒，術(shù)者右手持針，針體與皮膚呈90°刺入皮下，進(jìn)針深度為0．5cm，連接G6805電針治療儀，將電針儀調(diào)整如下：調(diào)整輸出調(diào)節(jié)旋鈕置于1檔（即輸出電壓為1V保持不變）頻率20Hz，每次留針30min，每日2次，1周為一療程，療程間休息2～3d，共4周。TLR4mAb組、LY294002組分別按5μg／（100g·d）和30μg／（100 g·d）腹腔注射。正常組和模型組以等體積8．5g／L氯化鈉灌腸。在造模過程中模型組和LY294002組各死亡1只。實驗4周后，末次給藥24h后，脫頸椎法處死大鼠，取距肛門8cm結(jié)腸，沿縱軸剪開，刮取腸黏膜組織，即置于液氮中速凍，轉(zhuǎn)入-70℃冰箱保存。

1．3 UC疾病活動指數(shù)（disease activity index，DAI）［7］在造模過程中，每天稱重，記錄大便情況，檢測便潛血、計算DAI。DAI結(jié)合大鼠的體質(zhì)量下降百分率（體質(zhì)量不變?yōu)?，1～5為1分，5～10為2分，10～15為3分，大于15為4分）、大便黏稠度（正常為0，松散的大便為2分，腹瀉為4分）和大便出血（正常0分，隱血陽性為2分，顯性出血為4分）3種情況進(jìn)行綜合評分，將3項結(jié)果的總分除以3即得到DAI值。即DAI＝（體重指數(shù)＋大便形狀＋出血情況）／3。

1．4 結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)（colonic mucosa damage index，CMDI）［8］肉眼觀察結(jié)腸病變組織腸黏膜形態(tài)，以正常、糜爛、潰瘍分級描述，進(jìn)行結(jié)腸黏膜大體形態(tài)損傷指數(shù)評分：0分：無損傷；1分：輕度充血、水腫，表面光滑，無糜爛或潰瘍；2分：輕、中度充血、水腫、糜爛，無潰瘍；3分：高度充血水腫，黏膜表面有壞死及潰瘍形成，潰瘍最大縱徑＜1cm，腸壁增厚或表面有壞死及炎癥；4分：在3分基礎(chǔ)上潰瘍最大縱徑＞1cm，或全腸壁壞死。

1．5 組織學(xué)損傷指數(shù)（tissue damage index，TDI）［9］取病變最明顯處組織置于100mL／L甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，HE染色，用于結(jié)腸組織形態(tài)觀察、光鏡觀察。評分標(biāo)準(zhǔn)如下：①炎細(xì)胞浸潤：無0分，輕度1分，重度2分；②浸潤深度：黏膜層1分，黏膜和黏膜下層2分，結(jié)腸全層3分；③潰瘍深度：無0分，上皮1分，黏膜固有層2分，黏膜肌層3分。

1．6 核蛋白、胞質(zhì)蛋白的提取 剪取結(jié)腸組織20 mg，4℃組織勻漿，500×g離心3min棄上清，加入CERⅠ200μL，高速渦旋15s，冰浴10min，加入CERⅡ11μL，渦旋5s，冰上孵育 min，渦旋5s，4℃1 600×g離心5min，取上清即為胞質(zhì)蛋白，將沉淀用預(yù)冷的NER 100μL重懸，渦旋5s，冰浴10min，并重復(fù)4次，最后4℃1 600×g離心10min，取上清即為胞核蛋白。

1．7 Western blot法檢測結(jié)腸組織AKT的表達(dá) 取100μg胞質(zhì)蛋白樣品于100g／L SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)印至PVDF膜，用封閉液（50g／L脫脂奶粉、0．05%Tween-20TBS）封閉后，加抗磷酸化Akt抗體（1∶1 000）、抗 Akt抗體（1∶1 000）孵育，4℃過夜。次日，再與辣根過氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)二抗于室溫孵育2h。最后，加ECL，X光曝片顯影，凝膠成像系統(tǒng)分析吸光度（A）比值。

1．8 Western blot法檢測結(jié)腸組織活化NF-κB的表達(dá)

用CBA蛋白濃度測定盒進(jìn)行蛋白定量后，每孔上樣50μg，蛋白樣品與上樣緩沖液共同煮沸3min，采用50g／L濃縮膠和12分離膠，100V，100min轉(zhuǎn)至PVDF膜，50g／L脫脂牛奶室溫封閉2h，一抗1∶1 000，4℃過夜。二抗1∶2 000，室溫4h，采用GAPDH作內(nèi)參，化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象于X光片。

1．9 TLR4mRNA的檢測 用 Trizol（Invitrogen公司）抽提RNA后，采用RT-PCR法檢測TLR4mRNA，TLR4mRNA引物序列：上游5′-TGGATACGTTTCCTTATAAG-3′，下游5′-GAAATGGAGGCACCCCTTC-3′，擴增產(chǎn)物長度508bp。內(nèi)參β-肌動蛋白序列：上 游 5′-ATCATGTTTGAGACCTTCAACA-3′，下 游5′-CATCTCTTGCTCGAAGTCCA-3′，擴 增 產(chǎn) 物 長 度250bp。RT反應(yīng)條件為：30℃反應(yīng)10min；50℃30 min滅活轉(zhuǎn)錄酶；99℃5min。TLR4mRNA擴增條件為：94℃預(yù)變性2min；94℃變性1min，62℃退火1min，72℃延伸1min，循環(huán)30次；72℃延伸8min。PCR產(chǎn)物在20g／L的瓊脂糖凝膠中電泳，加樣量為5μL。分析PCR產(chǎn)物，測定擴增帶（目的條帶和βactin）的吸收度值，計算TGF-β1mRNA與β-肌動蛋白的吸光度比值。

1．10 PI3KmRNA的檢測 Trizol試劑提取組織總RNA，采用 RT-PCR法檢測 PI3KmRNA，PI3K mRNA 引 物序 列：上 游：5′-CATCACTTCCTCCTGCTCTAT-3′，下游：5′-CAGTT2GTTGGCAATCTTCTTC-3′，擴增產(chǎn)物長度377bp。β-actin引物序列：上 游：5′-CAGAGCAAGAGAGGCATCC-3′，下游：5′-CTGGGGTGTTGAAGGTCTC-3′，擴增產(chǎn)物長度217bp。擴增條件為：95℃預(yù)變性5min后進(jìn)入30個循環(huán)（94℃0．5min，56℃1min，72℃1min），最后72℃延伸7min；擴增產(chǎn)物在18g／L瓊脂糖凝膠上電泳分離，并在圖像分析軟件中計算每個樣本擴增產(chǎn)物與β-actin的灰度比值。

1．11 AKT mRNA的檢測 取結(jié)腸組織用Trizol試劑提取大鼠結(jié)腸總RNA并測定純度后，在逆轉(zhuǎn)錄酶（MLV）催化下合成cDNA，以適量cDNA為模板在Taq DNA聚合酶催化下進(jìn)行PCR擴增。AKT mRNA引物序列：上游：5′-AAACCTGGCGGCCACGCTAC-3′，下 游：5′-TTGGCCAGGGCCACCTCCAT-3′，擴增產(chǎn)物長度361bp。GAPDH為內(nèi)參照，其上引 物：5′-TCTCCGCCCCTTCCGCTGAT-3′，下 游：5′-CCACAGCCTTGGCAGCACCA-3′，擴增片段為291bp。擴增條件為：預(yù)變性95℃2min后，進(jìn)入循環(huán)，95℃ 20s、59℃ 25s、72℃ 30s，45個循環(huán)后72℃延長5min。將PCR產(chǎn)物在20g／L瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，置于MUVB。20凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行吸光度掃描，以GADPH為內(nèi)參照，用目的基因的吸光度與GAPDH吸光度的比值代表目的基因的相對表達(dá)含量。

1．12 NF-κB mRNA的檢測 Trizol試劑盒提取大鼠結(jié)腸組織總 RNA，NF-κB mRNA（178bp）引物序列為上游引物：5′-CAAGATCTGCCGAGTAAACC-3′，下 游 引 物：5′-TCGGAACACAATGGCCACTT-3′。擴增產(chǎn)物全長178bp。以GAPDH作為內(nèi)參照，其引物序列為上游引物：5′-AGAACGGGAAGCTCACTGG-3＇，下 游 引 物：5′-TCCACCACCCTGTTGCTGGA-3′，擴增產(chǎn)物全長307bp。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2min，94℃變性30s，57℃復(fù)性30s，72℃延伸1min，30個循環(huán)后，72℃補充延伸5min。上述反應(yīng)結(jié)束后將PCR擴增產(chǎn)物4℃冰箱保存?zhèn)溆?。取PCR產(chǎn)物5μL，15g／L瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下照相，在圖像分析系統(tǒng)上進(jìn)行密度掃描，用NF-κB基因擴增產(chǎn)物的密度與GAPDH基因擴增產(chǎn)物的密度比值表示NF-κB mRNA的表達(dá)水平。

1．13 TNF-αmRNA的檢測 Trizol試劑盒提取大鼠結(jié)腸組織總RNA，TNF-α的上、下游引物分別為：上 游 5′-CGAGTGACAAGCCCGTAGCC-3′；下 游為：5′-GGATGAACACGCCAGTCGCC-3′，擴 增 產(chǎn)物全長255bp，β-actin的上游引物：5′-GAGACCTTCAACACCCAGCC-3′；下游引物為：5′-GCGGGGCATCGGAACCGCTCA-3′，擴增產(chǎn)物全長374bp。擴增條件為：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，退火TNF-α為54℃，β-actin為55℃，72℃延伸60s，30個循環(huán)，最后72℃延伸10min，擴增產(chǎn)物進(jìn)行15g／L瓊脂糖電泳，UVP凝膠顯像儀掃描并進(jìn)行圖像分析。用目的基因與β-actin吸光度的比值代表目的基因的相對表達(dá)含量。

1．14 IL-1βmRNA的檢測 Trizol試劑盒提取大鼠結(jié)腸組織總RNA，IL-1β引物序列如下：上游5′-CTCTGCTTGAGAGGTGCTGATGTAC-3′，下 游5′-CTGTATCCATCGACGGTGTCGAAG-3′。擴增產(chǎn)物全長519bp，β-actin序列如下：上游5′-CCTAGCACCATGAAGATCAA-3′。下游5′-AGCCATGCCAAATGTCTCAT-3′，擴增產(chǎn)物全長253bp，擴增條件為：預(yù)變性94℃4min，循環(huán)，94℃變性60s，58℃45s，72℃45s，共38個循環(huán)，72℃延伸10 min，取10μL PCR擴增產(chǎn)物，以DL2000作為分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行12g／L的瓊脂糖凝膠電泳（含0．5mg／L EB）。電泳后進(jìn)行凝膠電泳圖像掃描分析。電泳結(jié)果以IL-1βmRNA的表達(dá)相對量來表示，即IL-1βmRNA／β-actin的比值來表示。

1．15 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 11．5統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組兩兩比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），組間析因分析用LSD檢驗，相關(guān)分析采用直線相關(guān)的積差相關(guān)分析，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 電針對UC大鼠DAI、CMDI及TDI的影響正常對照組大鼠大便正常、體質(zhì)量增加、毛發(fā)有光澤、活動均正常；結(jié)腸膜黏上皮完整、連續(xù)，黏膜下無充血水腫，腺體排列整齊，未見顯著炎性細(xì)胞浸潤。模型組大鼠精神萎靡，毛發(fā)無光澤，懶動，常卷縮而臥，飲食量減少，體質(zhì)量下降，出現(xiàn)黏液稀糞，且逐漸加重。大體形態(tài)觀察可見腸道粘連，局部結(jié)腸黏膜不同程度充血、水腫、糜爛和潰瘍形成。HE染色觀察見結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)遭嚴(yán)重破壞，部分區(qū)域黏膜壞死、脫落，有些病變深達(dá)黏膜下層、肌層或漿膜層；黏膜內(nèi)腺體排列紊亂或缺如，細(xì)胞高度水腫，充血明顯，并呈局灶性出血，細(xì)胞間質(zhì)可見大量炎性細(xì)胞浸潤（P＜0．01）。各治療組大鼠毛色、精神及活動度較模型組健康，其腹瀉、便血癥狀都有不同程度的減輕，治療組在潰瘍數(shù)、糜爛點個數(shù)均較模型組明顯減少，同時炎癥細(xì)胞浸潤和杯狀細(xì)胞減少程度也減輕（P＜0．05或P＜0．01）。其中電針組和T＆L組治療效果優(yōu)于單用TLR4mAb或LY294002組（P＜0．05），電針組與 T＆L組在各項檢測指標(biāo)的比較中大體相當(dāng)（P＞0．05，表1、圖1）。

表1 各組大鼠DAI、CMDI及TDI的比較Tab．1 Comparison of DAI，CMDI and TDI among the 6groups（±s）

表1 各組大鼠DAI、CMDI及TDI的比較Tab．1 Comparison of DAI，CMDI and TDI among the 6groups（±s）

與正常組比較，＊P＜0．01；與模型組比較，▲P＜0．05，▲▲P＜0．01；與TLR4mAb組比較，△P＜0．05；與LY294002組比較，＃P＜0．05。

組 別 例數(shù)DAI CMDI TDI正常組40 0 0 0模型組 39 9．86±2．49＊ 7．65±2．．23＊ 11．35±9．04＊TLR4mAb組 40 7．54±1．27▲ 5．70±1．85▲ 8．29±1．63▲LY294002組 39 7．59±4．60▲ 5．67±3．62▲ 8．26±5．47▲T＆L組 40 5．63±2．57▲▲△＃ 3．26±0．47▲▲△＃ 5．41±3．52▲▲△＃電針組 40 5．59±1．36▲▲△＃ 3．28±0．61▲▲△＃ 5．38±2．91▲▲△＃

圖1 各組結(jié)腸組織的HE染色Fig．1 HE staining of rat colon tissues in the 6groups（×100）

2．2 電針對大鼠結(jié)腸組織TLR4mRNA、PI3KmRNA、P-AKT、活 化 NF-κB、TNF-α mRNA 及 IL-1β mRNA表達(dá)的影響 模型組結(jié)腸組織TLR4mRNA、PI3KmRNA、AKT mRNA、P-AKT、活化 NF-κB、TNF-αmRNA及IL-1βmRNA較正常對照組顯著增高 （P＜0．05 或 P＜0．01））；TLR4mAb 組TLR4mRNA表達(dá)較模型組明顯下降（P＜0．01），LY294002組PI3KmRNA、AKT mRNA、P-AKT低于模型組（P＜0．05或 P＜0．01），而在電針組和T＆L組 TLR4mRNA、PI3KmRNA、AKT mRNA及P-AKT表達(dá)均明顯低于模型組（P＜0．05或P＜0．01）；與上述變化相對應(yīng)，各治療組活化 NF-κB、TNF-αmRNA、IL-1βmRNA表達(dá)均明顯降低（P＜0．05或P＜0．01），電針組和T＆L組這3項指標(biāo)優(yōu)于TLR4mAb組和LY294002組，電針組與T＆L組在各項檢測指標(biāo)的比較中大體相當(dāng)（P＞0．05），活化NF-κB與TNF-αmRNA及IL-1βmRNA表達(dá)呈正相關(guān)（r1＝0．579，P＜0．05；r2＝0．561，P＜0．05，圖2、表2）。

3 討 論

圖2 各組結(jié)腸組織P-AKT、NF-κB、TLR4mRNA、PI3KmRNA、AKT mRNA、NF-κB mRNA、TNF-αmRNA和IL-1β mRNA的表達(dá)Fig．2 Expressions of P-AKT，NF-κB，TLR4mRNA，PI3KmRNA，AKT mRNA，NF-κB mRNA，TNF-αmRNA and IL-1βmRNA in rat colon tissues in the 6groups

TNF-α是由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的一種細(xì)胞因子，具有廣泛的生物學(xué)活性，除抗腫瘤外，對免疫反應(yīng)、機體代謝、炎癥反應(yīng)均有重要的調(diào)節(jié)介導(dǎo)作用［10］。TNF-α參于UC致病作用主要是使中性粒細(xì)胞聚集、內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子表達(dá)上調(diào)及引起凝血酶原效應(yīng)等。在腸道中介導(dǎo)黏膜損傷的作用，同時可刺激炎癥細(xì)胞分泌其他細(xì)胞因子。如誘導(dǎo)產(chǎn)生血小板激活因子、白三稀等，使結(jié)腸固有膜內(nèi)小血管在炎癥基礎(chǔ)上形成微血栓，導(dǎo)致黏膜微循環(huán)障礙。使腸黏膜組織損傷進(jìn)一步加重。TNF-α可通過上述過程參與UC發(fā)病，為UC發(fā)病機制中的啟動因子［11］。IL-1β是一種能激活多種免疫和炎癥細(xì)胞的炎性細(xì)胞因子，其中IL-1B能促進(jìn)血管內(nèi)皮-白細(xì)胞黏附分子的表達(dá)，趨化中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞進(jìn)入腸道病變部位，從而引起一系列腸道炎癥反應(yīng)和組織破壞［12］。NF-κB活化是眾多炎癥介質(zhì)作用機制的共同通道，NF-кB廣泛存在于靜止期細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中其蛋白二聚體與特異性抑制蛋白IкB結(jié)合成三聚體，以非活化形式存在于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)細(xì)胞受到如病毒或細(xì)菌感染、紫外線照射和感染前期細(xì)胞因子等作用刺激后，IкB發(fā)生磷酸化而失活，NF-кB進(jìn)而活化，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，啟動或調(diào)節(jié)早期反應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄，如細(xì)胞因子、生長因子和急性期蛋白等，產(chǎn)生大量的包括TNF-α、IL-1β等炎癥因子，另外，TNF-α等細(xì)胞因子也可以通過激活NF-κB誘導(dǎo)激酶（NIK）和絲裂原蛋白激酶的激酶1（MEKK1），從而使IKK磷酸化而激活，激活后的IKK再使IκB磷酸化，后者最后被蛋白酶降解，從而使NF-κB游離出來而活化，使信號進(jìn)一步放大［13］。大量研究表明，NF-κB在 UC中高度表達(dá)并誘導(dǎo)TNF-α、IL-1β、IL-6大量表達(dá)在UC中發(fā)揮重要的作用［14］。研究顯示，NF-κB抑制劑能顯著減少結(jié)腸黏膜炎癥細(xì)胞浸潤，降低TNF-α、IL-6等細(xì)胞因子基因表達(dá)，有效改善結(jié)腸組織炎癥反應(yīng)，說明NF-κB在UC發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮重要樞紐作用。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組NF-κB mRNA表達(dá)高于正常對照組（P＜0．05），提示NF-κB表達(dá)增高與UC發(fā)生有關(guān)，另本研究免疫印跡法測定法顯示，在模型組大鼠結(jié)腸組織細(xì)胞核活化NF-κB表達(dá)增高的程度較正常組更為顯著（P＜0．01），提示UC中不僅有NF-κB表達(dá)增強，更重要的是存在NF-κB激活。因此，本研究進(jìn)一步證實NF-κB的異常表達(dá)與激活在UC發(fā)生中起重要作用。

表2 各組大鼠結(jié)腸組織TLR4mRNA、PI3KmRNA、AKT mRNA、P-AKT、NF-κB mRNA、活化 NF-κB、TNF-αmRNA及IL-1β mRNA表達(dá)的比較Tab．2 Comparison of TLR4mRNA，PI3KmRNA，AKT mRNA，P-AKT，NF-κB mRNA，active NF-κB，TNF-αmRNA and IL-1βmRNA expressions in colon tissues among the 6groups（±s）

表2 各組大鼠結(jié)腸組織TLR4mRNA、PI3KmRNA、AKT mRNA、P-AKT、NF-κB mRNA、活化 NF-κB、TNF-αmRNA及IL-1β mRNA表達(dá)的比較Tab．2 Comparison of TLR4mRNA，PI3KmRNA，AKT mRNA，P-AKT，NF-κB mRNA，active NF-κB，TNF-αmRNA and IL-1βmRNA expressions in colon tissues among the 6groups（±s）

與正常組比較，＊P＜0．05，＊＊P＜0．01；與模型組比較，▲P＜0．05，▲▲P＜0．01；與 TLR4mAb比較，△P＜0．05，△△P＜0．01；與LY294002組比較，＃P＜0．05，＃＃P＜0．01。

組 別 n TLR4mRNA PI3KmRNA AKT mRNA P-AKT NF-κB mRNA 活化 NF-κB TNF-αmRNA IL-1βmRNA正常組 40 0．28±0．05 0．65±0．12 0．59±0．54 0．43±0．29 0．34±0．27 0．68±0．36 0．31±0．17 0．52±0．59模型組 39 1．37±0．32＊＊ 2．26±0．53＊＊ 1．16±0．47＊ 1．32±0．62＊＊ 0．59±0．24＊ 2．14±1．35＊＊ 0．97±0．32＊＊ 1．73±1．20＊＊TLR4mAb組 40 0．76±0．45▲▲ 2．25±0．62 1．15±1．06 1．35±1．07 0．51±0．28 1．42±0．93▲ 0．65±0．29▲ 1．29±0．81▲LY294002組 39 1．35±0．25 1．27±0．94▲▲ 0．78±0．68▲ 0．62±0．38▲▲ 0．52±0．20 1．40±0．85▲ 0．63±0．41▲ 1．31±0．34▲T＆L聯(lián)合組 40 0．77±0．13▲▲＃＃ 1．28±0．25▲▲△△ 0．76±0．43▲△ 0．60±0．58▲▲△△ 0．45±0．15▲ 0．82±0．46▲▲△＃ 0．45±0．18▲▲△＃ 0．85±0．48▲▲△＃電針組 40 0．76±0．04▲▲＃＃ 1．29±0．27▲▲△△ 0．77±0．53▲△ 0．61±0．58▲▲△△ 0．43±0．05▲ 0．82±0．74▲▲△＃ 0．44±0．25▲▲△＃ 0．86±0．62▲▲△＃

TLR4是第一個被發(fā)現(xiàn)的Toll樣受體，TLR4識別和攝取LPS后通過其下游MyD88依賴性及非依賴性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來激活各種炎癥因子?；罨腡oll樣受體的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域與MyD88羥基端相互作用使其活化，活化的MyD88可誘導(dǎo)IRAKs激酶磷酸化，進(jìn)而激活胞質(zhì)內(nèi)的TRAF-6?；罨蟮腡RAF-6通過TAK1與IKK信號級聯(lián)，使1κB磷酸化而降解，最終激活 NF-κB［15］?；罨蟮腘F-κB由胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，引起促炎細(xì)胞因子基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，啟動天然免疫和炎癥反應(yīng)有關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，誘發(fā)各種炎癥反應(yīng)。PI3K-Akt信號通路主要由 磷 脂 酰 肌 醇3-激 酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）和蛋白激酶B（protein kinase B，簡稱PKB或Akt）組成。PI3K是肌醇與磷脂酰肌醇的重要激酶，活化后可使肌醇環(huán)上的3位羥基磷酸化，使磷脂酰肌醇二磷酸（phosphatidylinositol 4，5-bisphosphate，PIP2）轉(zhuǎn)變?yōu)榈诙攀沽字＜〈既姿幔╬hosphatidylinosi-tol-3，4，5-trisphosphate，PIP3）。AKT是一種絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶，PIP3與 AKt N端的pH 結(jié)構(gòu)域（pleckstrin homology domain）結(jié)合，使AKT從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜上，并改變AKT的構(gòu)象使之能被3-磷脂酰肌醇依賴型激酶1／2（3-phosphoinositide-dependent protein kinase 1／2，PDK1／2）所磷酸化和激活［16］。NF-κB是AKT重要的下游效應(yīng)子之一，AKT磷酸化使I-κK活化，促使I-κB降解，從而使NF-κB從復(fù)合物中解離并定位到細(xì)胞核中，恢復(fù)NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性，啟動靶基因轉(zhuǎn)錄［17］。TLR4／NF-κB和PI3K／AKT／NF-κB信號通路是活化 NF-κB的兩條重要途徑，聯(lián)合測定TLR4／NF-κB和PI3K／AKT／NF-κB能了解上述信號通路與疾病的關(guān)系，可作為疾病的診斷、預(yù)后和信號通路阻斷治療的一個有用指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，NF-κB活性、TNF-α、IL-1β與結(jié)腸組織TLR4／NF-κB和 PI3K／AKT／NF-κB含量呈同方向變化，這驗證了 TLR4／NF-κB和PI3K／AKT／NF-κB信號通路可能是NF-κB重要活化途徑，所以可以說TLR4／NF-κB和PI3K／AKT／NF-κB信號通路可通過直接或間接方式在UC發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。提示通過阻斷 TLR4／NF-κB 和 PI3K／AKT／NF-κB 通 路、抑 制NF-κB活化進(jìn)而下調(diào)TNF-α、IL-1β表達(dá)是有效改善結(jié)腸黏膜炎癥損傷的一個重要途徑。

中醫(yī)理論認(rèn)為疾病狀態(tài)下，經(jīng)絡(luò)會出現(xiàn)血氣陰陽偏盛的虛實征候，針刺穴位可激發(fā)經(jīng)絡(luò)本身協(xié)調(diào)陰陽的功能，泄其有余，補其不足，陰陽平復(fù)，達(dá)到調(diào)整虛實防治疾病的作用?，F(xiàn)代研究表明，神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)與免疫系統(tǒng)之間有密切的雙向調(diào)節(jié)聯(lián)系。免疫細(xì)胞上有多種神經(jīng)內(nèi)分泌激素受體，多種激素會影響免疫功能，免疫細(xì)胞也可合成神經(jīng)遞質(zhì)和激素影響內(nèi)分泌系統(tǒng)，神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫系統(tǒng)紊亂參與UC發(fā)病。針刺可影響神經(jīng)內(nèi)分泌激素和細(xì)胞因子的生成和表達(dá)，雙向調(diào)節(jié)神經(jīng)一內(nèi)分泌一免疫網(wǎng)絡(luò)，使異常機能向有利于機體的方向轉(zhuǎn)化。有研究表明，針灸對提高免疫系統(tǒng)機能的調(diào)整功能是扶正的物質(zhì)基礎(chǔ)，又是除邪的物質(zhì)條件，表明針灸“補虛瀉實 扶正祛邪”的理論是科學(xué)的，其調(diào)整功能是可靠的。足三里穴是足陽明經(jīng)合穴，為土中之土穴，回陽針穴之一，是強壯要穴和肚腹疾患之常用穴，針刺足三里穴所產(chǎn)生的信號是通過腓深神經(jīng)和脛前動脈壁上的神經(jīng)叢上傳的，其傳入沖動在脊神經(jīng)節(jié)、脊髓背角、延髓等不同中樞水平與胃腸等內(nèi)臟器官的感覺傳入?yún)R聚，使足三里穴、胃腸經(jīng)穴、臟腑之間建立特異的相互聯(lián)系?，F(xiàn)代研究證實，足三里可調(diào)節(jié)機體免疫功能、調(diào)整胃腸功能、調(diào)整腸道內(nèi)環(huán)境而達(dá)到治療目的。本研究結(jié)果顯示，模型組結(jié)腸組織中 TLR4mRNA、PI3KmRNA、P-AKT、活化 NF-κB、TNF-αmRNA、IL-1βmRNA 表達(dá)及大鼠DAI、CMDI及 TDI顯著增加（P＜0．01）。這提示UC發(fā)生時機體 TLR4／NF-κB 和 PI3K／AKT／NF-κB信號通路表達(dá)增強，能激活NF-κB，活化的 NF-κB可通過上調(diào)TNF-α、IL-1β的表達(dá)參與參與UC的發(fā)生、發(fā)展。與模型組比較，各治療組大鼠結(jié)腸組織活化 NF-κB、TNF-αmRNA、IL-1βmRNA 表達(dá)及大鼠DAI、CMDI及 TDI顯著降低（P＜0．01或P＜0．05），以T-L聯(lián)合組和電針組更為顯著（P＜0．01），同時在TLR4mAb組大鼠結(jié)腸組織TLR4mRNA明顯下降（P＜0．01），在LY294002組大鼠結(jié)腸組織PI3KmRNA、P-AKT明顯下降（P＜0．01），T-L聯(lián)合組TLR4mRNA和PI3KmRNA、P-AKT均明顯下降。這說明TLR4mAb和LY294002可分別以阻斷TLR4／NF-κB和PI3K／AKT／NF-κB信號通路來抑 制 NF-κB 的 活 化，下 調(diào) TNF-αmRNA、IL-1βmRNA促炎細(xì)胞因子的表達(dá)、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，減少炎癥遞質(zhì)的釋放，從而有效阻斷免疫反應(yīng)性對機體造成的損傷，達(dá)到預(yù)防UC的目的。兩者聯(lián)用時有協(xié)同作用。另本研究結(jié)果顯示，電針對UC大鼠上述各指標(biāo)的抑制程度與T-L聯(lián)合組相當(dāng)，這提示阻斷TLR4／NF-κB和 PI3K／AKT／NF-κB 兩 通 路、抑 制NF-κB活化、下調(diào)炎癥因子是電針治療UC的重要機制，為臨床電針治療UC提供了理論和實驗依據(jù)。

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