秋水仙素對刺果甘草染色體倍性誘變的影響

楊萍，郭曄紅，史軍周

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，甘肅 蘭州　730070)

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秋水仙素對刺果甘草染色體倍性誘變的影響

楊萍，郭曄紅，史軍周

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，甘肅 蘭州730070)

摘要：以刺果甘草種子為試驗材料，分別用0.05%、0.1%和0.2%的秋水仙素處理甘草種子16、20、24 h，進行刺果甘草多倍體的誘導(dǎo)研究.結(jié)果表明：以0.05%秋水仙素處理16 h刺果甘草染色體的誘變率最低為7.5%，0.2%秋水仙素處理24 h時刺果甘草染色體誘變率最高,為88.64%；在0.1%秋水仙素處理種子24 h得到刺果甘草四倍體(4n=4x=32)，此時刺果甘草染色體誘變率可達42%.

關(guān)鍵詞：刺果甘草；秋水仙素；染色體；誘變率

刺果甘草(GlycyrrhizapallidifloraMax.)，別名野甘草、胡蒼耳、狗甘草等，為豆科蝶形花亞科甘草屬多年生半灌木.以根及種子入藥，具有催乳、殺蟲、止瀉、抗癌等功效.主要分布在黑龍江、遼寧、內(nèi)蒙古等地[1]，因其具有抗寒、抗旱、耐熱、耐鹽堿等優(yōu)良特性，且植株高大，枝葉繁茂，適生性強，生命力旺盛，成為干旱、半干旱地區(qū)園林綠化及水土保持的重要植物資源之一[2].植物的多倍體(polyploid)現(xiàn)象自二十世紀初被發(fā)現(xiàn)以來，以其根、莖、葉等營養(yǎng)器官的巨型性及優(yōu)良的抗性成為各界專業(yè)人士研究的焦點.

為大幅度提高甘草產(chǎn)量、得到具有較強抗性的甘草植株，國內(nèi)外許多學(xué)者都對甘草進行了多倍體的誘導(dǎo)研究.如葛淑俊等[3]研究了烏拉爾甘草同源四倍體誘導(dǎo)技術(shù)，武曉陽[4]研究了脹果甘草體細胞染色體加倍技術(shù)等.但對于刺果甘草染色體加倍的研究卻少有報道，吳玉香等[5]雖采用改良瓊脂涂抹法和直接滴滲法處理刺果甘草幼苗頂芽進行多倍體誘變，但方法較麻煩，且時間較長，也未對染色體進行鑒定.鑒于此，本研究采用秋水仙素處理刺果甘草種子的方法，進行刺果甘草多倍體的誘導(dǎo)研究，以期為培植多倍體刺果甘草提供科學(xué)依據(jù).

1材料與方法

1.1試驗材料

試驗使用的刺果甘草種子采自吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院中草藥實驗圃.

1.2試驗方法

1.2.1刺果甘草染色體加倍選取成熟飽滿、健康無病蟲害的刺果甘草種子經(jīng)沙磨處理后用98%濃H2SO4浸泡40 min，1%升汞消毒10 min，之后以0.05%、0.1%、0.2%的秋水仙素溶液分別浸泡刺果甘草種子16、20、24 h，用不加秋水仙素的種子作對照，每個處理設(shè)3次重復(fù).

將處理過的種子接種到以MS培養(yǎng)基為基質(zhì)的錐形瓶中，25 ℃下暗培養(yǎng).待種子完全發(fā)芽后，每天以2 000 lx強度光照10 h，26 ℃下培養(yǎng).待植株長到5 cm左右時剪取下胚軸(約0.5 cm)接入MS+0.5 mg/L NAA+0.8 mg/L 6-BA的培養(yǎng)基，每處理接30個，重復(fù)3次.于23 ℃、2 000 lx強度下光照16 h誘導(dǎo)愈傷組織.20 d后愈傷組織進行兩次繼代培養(yǎng)，之后進行染色體觀察分析.

1.2.2染色體倍性分析剪取新生的愈傷組織于0.01%秋水仙素和0.002 mol/L 8-羥基喹啉混合液中預(yù)處理2.5 h左右，水洗后用乙醇—冰醋酸(3∶1)固定液固定2 h；再用混合酶液(纖維素酶和果膠酶各占2.5%)在25 ℃恒溫箱內(nèi)處理3 h；倒去酶液，用蒸餾水泡30 min，去除蒸餾水后，加入固定液固定0.5 h后制備細胞懸液.用懸滴法制片，干燥后用改良苯酚品紅染色2～3 min，常規(guī)壓片，冰凍后揭去蓋玻片，自然干燥，中性樹膠封片，用Olympum Bx61觀察并采集圖像.

2結(jié)果與分析

2.1秋水仙素對刺果甘草種子發(fā)芽的影響

秋水仙素質(zhì)量分數(shù)和處理時間對刺果甘草種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢有明顯影響.隨著秋水仙素質(zhì)量分數(shù)的增加和處理時間的延長，刺果甘草種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢明顯降低，以0.2%的秋水仙素處理24 h的刺果甘草種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢最低，分別較對照降低了77.5%和88.6%；以0.05%秋水仙素處理20 h，發(fā)芽率和發(fā)芽勢降低幅度最小，分別為19%和46.8%.由表1可見，秋水仙素質(zhì)量分數(shù)和浸泡時間對刺果甘草種子的萌發(fā)有顯著性的抑制作用.

表1　不同秋水仙素質(zhì)量分數(shù)和處理時間對刺果

2.2秋水仙素處理對刺果甘草染色體誘變率的影響

秋水仙素處理對刺果甘草染色體誘導(dǎo)試驗表明，不同質(zhì)量分數(shù)的秋水仙素處理對刺果甘草染色體誘導(dǎo)率和誘變率均有明顯影響(表2)，隨著秋水仙素質(zhì)量分數(shù)的增加和浸泡時間延長，刺果甘草染色體愈傷組織誘導(dǎo)率呈下降趨勢，當秋水仙素質(zhì)量分數(shù)達到0.2%處理24 h時，刺果甘草染色體的誘導(dǎo)率最低，為10%，而且使用秋水仙素處理后刺果甘草染色體愈傷組織誘導(dǎo)率均有下降，說明秋水仙素對刺果甘草染色體愈傷組織誘導(dǎo)率具有抑制作用.而且隨著秋水仙素質(zhì)量分數(shù)的增加和浸泡時間延長，刺果甘草染色體誘變率呈上升趨勢，以0.05%秋水仙素處理16 h時誘變率最低，為7.5%；0.2%秋水仙素處理24 h的刺果甘草染色體誘變率最高，為88.64%.由此可見，一定質(zhì)量分數(shù)的秋水仙素和處理時間能夠促使刺果甘草產(chǎn)生變異，并且誘變率隨秋水仙素質(zhì)量分數(shù)和處理時間的增加而增大(表2).

表2　秋水仙素處理對刺果甘草愈傷組織誘導(dǎo)率和誘變率的影響

2.3刺果甘草染色體計數(shù)與鑒定

從表2和圖1中誘導(dǎo)的多倍體染色體數(shù)目可知，染色體數(shù)目隨著秋水仙素質(zhì)量分數(shù)和處理時間的增加而增加，但并不呈倍性增加.僅以0.1%秋水仙素處理24 h時得到刺果甘草的四倍體，4n=4x=32.用0.05%秋水仙素處理16 h得到22條染色體， 0.05%秋水仙素處理24 h、0.1%處理16 h、0.1%處理20 h、0.1%處理24 h和0.2%處理16 h所得染色體數(shù)目變化范圍不大，為28～32.用0.2%秋水仙素處理20 h、24 h誘導(dǎo)的染色體數(shù)目明顯多于其他處理.周樸華等[6]用秋水仙素誘導(dǎo)黃花菜的愈傷組織，得到了四倍體植株；王俐等[7]取得了蘆薈和庫拉索蘆薈的四倍體植株；另有丹參、菘藍、黨參、枸杞、福錄考、牛膝、黃芪、杜仲、百合、菊花腦、君子蘭等試驗也支持本試驗結(jié)果[8-15].

而本試驗秋水仙素作用于刺果甘草誘導(dǎo)多倍體發(fā)生率較低，推測可能原因是刺果甘草種子硬實現(xiàn)象影響秋水仙素浸入種子.另外，秋水仙素有毒害作用，其致死率也隨著秋水仙素質(zhì)量分數(shù)的增大和處理時間的延長而增大.

A:0;B1:0.05%,16 h;B2:0.05%,20 h;B3:0.05%,24 h;C1:0.1%,16 h;C2:0.1%,20 h;C3:0.1%,24 h;D1:0.2%,16 h;D2:0.2%,20h;D3:0.2%,24 h.

圖1不同質(zhì)量分數(shù)、不同時間秋水仙素處理對刺果甘草染色體的誘導(dǎo)

Fig.1Induction of different concentration and duration of colchicine treatment on

GlycyrrhizapallidifloraMax.chromosome

3討論與結(jié)論

秋水仙素質(zhì)量分數(shù)和浸泡時間都對刺果甘草種子的萌發(fā)有顯著性抑制作用.說明秋水仙素能夠抑制刺果甘草的正常萌發(fā).

使用秋水仙素處理種子后刺果甘草染色體愈傷組織誘導(dǎo)率均有下降，說明秋水仙素對刺果甘草染色體愈傷組織誘導(dǎo)率具有抑制作用.一定質(zhì)量分數(shù)的秋水仙素和處理時間能夠促使刺果甘草產(chǎn)生誘變，并且誘變率與秋水仙素質(zhì)量分數(shù)和處理時間呈顯著正相關(guān)，0.2%秋水仙素處理24 h刺果甘草染色體誘變率最高，為88.64%.在0.05%～0.2%內(nèi)刺果甘草染色體誘變率隨著秋水仙素質(zhì)量分數(shù)和處理時間的升高而增大.

秋水仙素處理刺果甘草種子能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生多倍體，以0.1%秋水仙素處理24 h得到四倍體(4n=4x=32).

陳榮等[16]用秋水仙誘導(dǎo)觀音蓮四倍體，發(fā)現(xiàn)20 mg/L秋水仙素處理8 d誘導(dǎo)率最高.田丹青等[17]采用秋水仙素進行紅掌四倍體離體誘導(dǎo)， 證明0.20 g/L秋水仙素液體培養(yǎng)15 d 的四倍體誘導(dǎo)率最高.這說明因物種的不同，秋水仙素誘導(dǎo)多倍體的質(zhì)量濃度和時間差異較大.而本試驗使用的方法簡單并易于操作，誘導(dǎo)時間較短，僅需24 h，并對刺果甘草進行了染色體鑒定.

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(責(zé)任編輯趙曉倩)

Effects of colchicine on chromosome mutation of

Glycyrrhizapallidiflora

YANG Ping,GUO Ye-hong,SHI Jun-zhou

(College of Agronomy,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China)

Abstract：The seeds of Glycyrrhiza pallidiflora were used as the material to induce the polyploidy plant with different colchicine concentration and duration treatments.The results showed that the mutation rate were the lowest (7.50%) under the treatment with colchicine at 0.05% for 16 h,the mutation rate was the highest (88.64%) under the treatment at 0.2% for 24 h.The tetraploid (4n=4x=32) appeared under treated with colchicine at 0.1% for 24 h.

Key words：Glycyrrhiza pallidiflora；colchicine；chromosome；mutation rate

收稿日期：2014-04-02；修回日期：2014-04-15

基金項目：甘肅省高等學(xué)?；究蒲袠I(yè)務(wù)費項目.

通信作者：郭曄紅，女，副教授，博士，主要從事野生中藥材引種馴化與鑒定方面的教學(xué)和科研工作.E-mail:guoyh@gsau.edu.cn

中圖分類號：S 567.1

文獻標志碼：A

文章編號：1003-4315(2015)01-0089-04

第一作者：楊萍(1988-)，女，碩士研究生,研究方向為中藥材引種馴化與鑒定.E-mail:15117190782@163.com