迎春花總黃酮的生物活性研究

侯 蓓,趙成愛(ài),*,韓 璐,馬炳陽(yáng),徐偉強(qiáng),盧 澤

(1. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境學(xué)院,吉林長(zhǎng)春 130118 2. 延邊大學(xué) 理學(xué)院,吉林延吉 133002)

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迎春花總黃酮的生物活性研究

侯 蓓1,趙成愛(ài)1,*,韓 璐1,馬炳陽(yáng)1,徐偉強(qiáng)1,盧 澤2

(1. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境學(xué)院,吉林長(zhǎng)春 130118 2. 延邊大學(xué) 理學(xué)院,吉林延吉 133002)

目的:對(duì)迎春花粗分離各萃取相中總黃酮抗氧化活性進(jìn)行研究。方法:通過(guò)各萃取相中總黃酮對(duì)DPPH自由基、羥基自由基和超氧陰離子自由基的清除作用以及總還原力的測(cè)定來(lái)研究其抗氧化活性。選出抗氧化性最好的萃取相對(duì)D-半乳糖誘導(dǎo)的小鼠進(jìn)行抗衰老實(shí)驗(yàn),對(duì)MDA、SOD、CAT、POD、GSH、Hyp指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果:迎春花各萃取相對(duì)DPPH自由基、羥基自由基和超氧陰離子自由基的清除以及總還原力均有較強(qiáng)的作用,其中乙酸乙酯相在清除DPPH自由基達(dá)到98%,并在小鼠抗衰老實(shí)驗(yàn)中,乙酸乙酯相能有效提高衰老小鼠的SOD、CAT、POD以及GSH活性,MDA、Hyp含量降低。結(jié)論:通過(guò)體外抗氧化實(shí)驗(yàn)確定了迎春花乙酸乙酯相抗氧化能力最強(qiáng),并在小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中確定了乙酸乙酯相具有較強(qiáng)的抗衰老能力。

迎春花,總黃酮,抗氧化,抗衰老

迎春花(JasminumnudoiflorumLindl.)為木樨科茉莉?qū)俾淙~灌木,原產(chǎn)于我國(guó)中部和北部各省,現(xiàn)各地均有栽培。迎春花具有解熱發(fā)汗、利尿、活血散毒、消腫止痛等功效[1]。現(xiàn)代研究證明迎春花中含有豐富的黃酮類化合物[2],它具有諸多生物活性,如抗氧化、降血脂、降血壓、抑制血小板聚集及血栓的形成、抗肝臟病毒、抗炎抗菌等[3],尤其是抗氧化性。張志信等[4-5]研究了迎春花的花、葉、莖中黃酮類化合物及其不同季節(jié)含量,3至4月間花中含量最高;鄭敏燕等[6-7]研究了迎春花葉總黃酮提取物對(duì)豬油的抗氧化性能,發(fā)現(xiàn)迎春花葉總黃酮提取物有較強(qiáng)的抗氧化性;回瑞華等[8]采用了化學(xué)發(fā)光法研究了迎春花黃酮類化合物的抗氧化性。目前,還未發(fā)現(xiàn)對(duì)迎春花總黃酮體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的文獻(xiàn)記載,本實(shí)驗(yàn)不僅對(duì)迎春花各萃取相的總黃酮進(jìn)行測(cè)定,并對(duì)各萃取相進(jìn)行了體外抗氧化實(shí)驗(yàn),還對(duì)乙酸乙酯相進(jìn)行了小鼠的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。

本實(shí)驗(yàn)首先通過(guò)各萃取相及總提取物對(duì)DPPH自由基、羥基自由基和超氧陰離子自由基清除以及總還原力這四個(gè)指標(biāo)進(jìn)行抗氧化活性分析,并選出抗氧化性最強(qiáng)的萃取相對(duì)D-半乳糖誘導(dǎo)小鼠衰老進(jìn)行抗衰老實(shí)驗(yàn),旨在為迎春花的抗氧化生物活性研究及開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

迎春花 購(gòu)買于安徽亳州中藥材市場(chǎng),由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院楊利民教授鑒定,粉碎機(jī)粉碎,備用;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(含量≥95%) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、乙醇等,均為分析純。D-半乳糖(M&C Gene Technology)、超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、過(guò)氧化物酶(POD)、丙二醛(MDA)ELISA試劑盒 R&D Systems產(chǎn)品。

JFSD-100粉碎機(jī) 上海淀久中藥機(jī)械制造有限公司;KQ5200B型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;RE-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、SHZ-III型循環(huán)水真空泵 上海亞榮生化儀器廠;紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;TDL-5A低速大容量離心機(jī) 上海悅豐儀器儀表有限公司;Infinite M200 PRO酶聯(lián)免疫檢測(cè)分析儀 NanoQuant。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 迎春花總黃酮的提取及測(cè)定 通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)可知,采用超聲波法輔助提取迎春花總黃酮,提取條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)68%、液料比20∶1、提取時(shí)間40min、提取溫度50℃。

總黃酮含量的測(cè)定采用NaNO2-Al(NO3)3的比色法。以蘆丁作為標(biāo)準(zhǔn)品,510nm處測(cè)其吸光度,以吸光度(A)為縱坐標(biāo),質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得線性回歸方程:A=11.779C+0.0072,R2=0.9996。

式中:C為比色皿中測(cè)量液的總黃酮濃度,mg/mL;V1為測(cè)量液的定容體積,10.00mL;V2為測(cè)量時(shí)量取的體積,1.00mL;V3為提取液的定容體積,50.00mL;m為迎春花干粉的質(zhì)量,1000.00mg。

1.2.2 迎春花粗分離 取100.00g迎春花提取物浸膏,加200.00mL蒸餾水溶解,得到懸浮液,分別用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇各萃取五次,得到萃取液,濃縮至浸膏。

1.2.3 迎春花各萃取相體外抗氧化能力的測(cè)定 迎春花各萃取相對(duì)DPPH自由基清除能力的測(cè)定:精確稱取0.0100g DPPH,用無(wú)水乙醇溶解,移至250.00mL棕色容量瓶,定容至刻度,配制濃度為0.04mg/mL的DPPH溶液。分別取2.00mL不同濃度各萃取相的溶液,加入2.00mL DPPH溶液,混合均勻,室溫避光放置30min,無(wú)水乙醇做參比液于517nm處測(cè)吸光度值,用VC作為陽(yáng)性對(duì)照。以上方法重復(fù)3次取平均值[9-11]。樣品對(duì)DPPH自由基的清除率用以下公式計(jì)算:

式中:A0-2.00mL無(wú)水乙醇+2.00mL DPPH溶液的吸光度值;A1-2.00mL樣品溶液+2.00mL DPPH溶液的吸光度值;A2-2.00mL樣品溶液+2.00mL無(wú)水乙醇的吸光度值。

迎春花各萃取相對(duì)羥基自由基清除能力的測(cè)定:反應(yīng)體系中含8.80mmol/L H2O21.00mL、9.00mmol/L FeSO41.00mL、9.00mmol/L水楊酸-乙醇溶液1.00mL,不同濃度的樣品溶液1.00mL。最后加H2O2啟動(dòng)反應(yīng),37℃反應(yīng)15min,蒸餾水作參比,在510nm下測(cè)定各濃度的吸光度。以9.00mmol/L FeSO4、9.00mmol/L 水楊酸-乙醇溶液、不同濃度的樣品溶液和蒸餾水各1.00mL作為樣品的本底吸收值,VC作為陽(yáng)性對(duì)照[12]。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次取平均值。

按下式計(jì)算·OH清除率:

式中:A0-1.00mL蒸餾水+1.00mL H2O2溶液+1.00mL FeSO4溶液+1.00mL水楊酸-乙醇溶液的吸光度值;Ax-1.00mL樣液+1.00mL H2O2溶液+1.00mL FeSO4溶液+1.00mL水楊酸-乙醇溶液的吸光度值;Ax0-1.00mL蒸餾水+1.00mL樣液+1.00mL FeSO4溶液+1.00mL水楊酸-乙醇溶液的吸光度值。

迎春花各萃取相對(duì)超氧陰離子自由基清除能力的測(cè)定:取5.00mL 50.00mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH=8.2),于25℃水浴中保溫20min,分別加入2.00mL樣品溶液和1.00mL 25.00mmol/L鄰苯三酚溶液,混勻后于25℃水浴中反應(yīng)5min,加入1.00mL 10.00mmol/L HCl終止反應(yīng),于420nm處測(cè)定吸光度(Ax),以Tris-HCl緩沖液做參比,空白對(duì)照組以相同體積蒸餾水代替樣品,VC作為陽(yáng)性對(duì)照[13-14]。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次取平均值。

式中:A0-空白對(duì)照液吸光度;Ax-樣品溶液吸光度。

迎春花各萃取相對(duì)總還原力測(cè)定:于13.00mL離心管中分別加入0.20mol/L pH6.6的磷酸緩沖液2.00mL和不同濃度的樣液2.00mL,加入2.00mL 1%鐵氰化鉀,混合均勻后于50℃反應(yīng)20min。取出后加入2.00mL10%三氯乙酸終止反應(yīng),4000r/min離心10min。取上清液5.00mL,加入5.00mL蒸餾水和1.00mL0.1%的 FeCl3,混勻后靜置10min,以蒸餾水為參比溶液,在700nm處檢測(cè)吸光值,VC作為陽(yáng)性對(duì)照[15]。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次取平均值。

1.2.4 迎春花乙酸乙酯相體內(nèi)抗衰老實(shí)驗(yàn) 迎春花乙酸乙酯相對(duì)D-半乳糖誘導(dǎo)小鼠衰老模型的分組、建立和標(biāo)本處理:

動(dòng)物分組:取體重22～25g健康雄性ICR小鼠,實(shí)驗(yàn)條件下飼養(yǎng)一周,采用隨機(jī)數(shù)字表取60只ICR小鼠隨機(jī)分為6組:空白對(duì)照組(A組)、模型對(duì)照組(B組)、給藥組100mg/kg(C組)、給藥組200mg/kg(D組)、給藥組300mg/kg(E組),每組10 只小鼠。

造模:實(shí)驗(yàn)開始每天對(duì)B、C、D、E組小鼠背部皮下進(jìn)行D-半乳糖(500mg/kg)注射,A組用注射等劑量的生理鹽水。連續(xù)造模60d。

給藥:15d后,C、D、E組灌胃給予迎春花乙酸乙酯相化合物(體重的0.1%),A、B組使用0.4%生理鹽水給以灌胃(體重的0.1%)。每日1次,連續(xù)45d。每3d稱一次體重,記錄體重。

小鼠的處理:實(shí)驗(yàn)60d,眼眶靜脈取血,將取得血液于3500r/min的4℃冷凍離心機(jī)中,分離出血清,-20℃保存待用。取小鼠背部皮膚,用 8%硫化鈉溶液去除毛發(fā),稱重后,放于錫紙上,包裹封袋,-20℃冰柜保存待用。取上清液用于MDA、超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、過(guò)氧化物酶(POD)、谷胱甘肽(GSH)、羥脯氨酸(Hyp)檢測(cè)。

MDA、SOD、CAT、POD、GSH以及Hyp含量的測(cè)定:將取得血液于3500r/min的4℃冷凍離心機(jī)中,分離出血清,用于MDA、SOD、CAT、POD、GSH含量的測(cè)定。將4℃的生理鹽水與皮膚組織1∶9研磨成組織勻漿,于3500r/min的4℃冷凍離心機(jī)中分離,取上清液,用于MDA、SOD、CAT、POD、GSH、Hyp的測(cè)定。

MDA、SOD、CAT、POD、GSH、Hyp檢測(cè)按照ELISA試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 各萃取相總黃酮含量的測(cè)定

由表1可知,各萃取相中總黃酮含量為:乙酸乙酯相>正丁醇相>總提取物>氯仿>石油醚,各萃取相中均含有黃酮類化合物,但乙酸乙酯相總黃酮含量最高,達(dá)到0.0615mg/mL。

表1 迎春花各萃取相中總黃酮含量Table1 The total flavonoids of different extractions from Jasminum nudoiflorum Lindl

2.2 體外抗氧化活性

2.2.1 各萃取相對(duì)DPPH自由基的清除能力 由圖1可以看出,在樣品濃度為0.1mg/mL時(shí),總提取物、氯仿相、乙酸乙酯相清除DPPH自由基的能力比陽(yáng)性對(duì)照VC略高;當(dāng)濃度達(dá)到0.3mg/mL時(shí),總提取物、氯仿相、乙酸乙酯相清除DPPH自由基的能力與陽(yáng)性對(duì)照VC相同,達(dá)到98%;當(dāng)濃度大于0.3mg/mL時(shí),其清除率一直保持在98%不變。石油醚相和正丁醇相比總提取物、氯仿相、乙酸乙酯相清除略低,但在濃度增大時(shí),清除自由基的能力也隨之增大;當(dāng)濃度小于0.5mg/mL時(shí),石油醚相的清除率比正丁醇相要低,但石油醚相清除率的增長(zhǎng)速率最快;當(dāng)濃度達(dá)到0.5mg/mL時(shí),石油醚相和正丁醇相清除力相同,當(dāng)濃度大于0.5mg/mL時(shí),均趨于平緩。該圖說(shuō)明迎春花各萃取相均對(duì)DPPH自由基具有較強(qiáng)的清除能力。

圖1 迎春花各萃取相對(duì)DPPH自由基的清除能力Fig.1 DPPH free radical scavenging rates of different extractions from Jasminum nudoiflorum Lindl

2.2.2 各萃取相對(duì)總還原力的測(cè)定 由圖2可知,總還原力能力是VC>乙酸乙酯相>總提取物>正丁醇相>氯仿相>石油醚相,當(dāng)濃度為0.1mg/mL時(shí),乙酸乙酯相的吸光度略高于VC,當(dāng)濃度達(dá)到0.3mg/mL時(shí),VC吸光度值達(dá)到最大,之后基本保持不變;乙酸乙酯相的吸光度值隨著濃度的增大而增大。

圖2 迎春花各相還原能力測(cè)定Fig.2 Reducing power of different extractions from Jasminum nudoiflorum Lindl

2.2.3 各萃取相對(duì)羥基自由基的清除能力 由圖3可知,隨著樣品濃度的增大,各萃取相清除羥基自由基的能力也隨之增大,樣品的濃度與清除率成線性關(guān)系,VC的清除率最高,各萃取相清除羥基自由基的能力為乙酸乙酯相>正丁醇相>總提取物>氯仿相>石油醚相,乙酸乙酯相清除率最高達(dá)到75%以上,由此可以看出,迎春花的各萃取相對(duì)羥基自由基有較強(qiáng)清除能力。

圖3 迎春花各相對(duì)羥基自由基的清除作用Fig.3 Hydroxyl free radicals scavenging activity of different extractions from Jasminum nudoiflorum Lindl

2.2.4 各萃取相對(duì)超氧陰離子自由基清除能力 由圖4可知,VC的清除率最高,達(dá)到80%以上,其他各萃取相均隨著樣品濃度的增加,清除率越來(lái)越高,各萃取相清除超氧陰離子的能力為乙酸乙酯相>正丁醇相>總提取物>氯仿相>石油醚相,由此表明,各萃取相對(duì)超氧陰離子也具有較強(qiáng)的清除能力。

表2 乙酸乙酯相對(duì)D-半乳糖誘導(dǎo)小鼠衰老的體重影響Table2 Effect of ethyl acetate phase on aging mice induced by

注:*p<0.05,**p<0.01,與模型對(duì)照組作比較。表3～表5同。

表3 乙酸乙酯相對(duì)小鼠血清指標(biāo)的影響Table3 Effect of ethyl acetate phase on serum index in mice

表4 乙酸乙酯相對(duì)小鼠皮膚組織指標(biāo)的影響Table4 Effect of ethyl acetate phase on skin tissue parameters in mice

圖4 迎春花各相對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用Fig.4 Superoxide anion free radicals scavenging activity of different extractions from Jasminum nudoiflorum Lindl

2.3 體內(nèi)抗衰老實(shí)驗(yàn)

2.3.1 小鼠的體重增長(zhǎng)率的測(cè)定 由表2可知,與空白對(duì)照組(A組)比較,模型對(duì)照組(B組)的小鼠體征為毛發(fā)枯黃無(wú)光、呆滯嗜睡,飲食量較少,體形消瘦,體重增長(zhǎng)的緩慢,給藥組隨濃度的增大,小鼠體重的增長(zhǎng)率逐漸增大。這些現(xiàn)象都與衰老小鼠特征相符[16]。

2.3.2 MDA、SOD、CAT、POD以及GSH含量的測(cè)定結(jié)果 超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、過(guò)氧化物酶(POD)、谷胱甘肽(GSH)是抗氧化系統(tǒng)中重要的抗氧化酶,是生物體產(chǎn)生的天然抗氧化酶,它能清除體內(nèi)超氧化物自由基,防止氧自由基對(duì)機(jī)體直接或間接的損傷,阻斷脂質(zhì)過(guò)氧化連鎖反應(yīng),從而起到保護(hù)機(jī)體勉受氧自由基損傷的作用[17]。MDA 為脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的產(chǎn)物,能引起細(xì)胞的損傷,MDA 含量升高說(shuō)明機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)較多,因而氧自由基損傷就多[18-19]。

由表3可知,連續(xù)注射D-半乳糖60d后,模型對(duì)照組血清SOD、CAT、POD以及GSH活性均有所降低,均顯著低于正常對(duì)照組(p<0.05),而MDA含量高于正常對(duì)照組。隨著給藥濃度的增大,小鼠血清SOD、CAT、POD及GSH含量逐漸升高,且與模型對(duì)照組差異性顯著(p<0.05,p<0.01);MDA的含量逐漸降低,但與模型對(duì)照組差異性不顯著(p>0.05)。表明迎春花乙酸乙酯相可提高小鼠血清SOD、CAT、POD以及GSH活性,能抑制小鼠血清MDA含量的上升。

由表4、表5可知,連續(xù)注射D-半乳糖60d后,模型對(duì)照組皮膚組織中SOD、CAT、POD以及GSH活性均有所降低,均顯著低于正常對(duì)照組(p<0.05),而MDA、Hyp含量高于正常對(duì)照組。隨著給藥濃度的增大,小鼠血清SOD、CAT、POD及GSH含量逐漸升高,且與模型對(duì)照組差異性顯著(p<0.05,p<0.01);MDA的含量逐漸降低,但差異不顯著(p>0.05),Hyp含量也逐漸降低并且高劑量組效果顯著(p<0.05)。表明乙酸乙酯相可提高小鼠皮膚組織SOD、CAT、POD以及GSH活性,能抑制小鼠皮膚組織MDA、Hyp含量的上升。

表5 乙酸乙酯相對(duì)小鼠皮膚組織指標(biāo)的影響Table5 Effect of ethyl acetate phase on skin tissue parameters in mice

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)各萃取相對(duì)DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基、總還原力的四種抗氧化實(shí)驗(yàn)說(shuō)明了迎春花各萃取相均有較好的抗氧化能力,并對(duì)其各萃取相進(jìn)行了總黃酮含量的測(cè)定,發(fā)現(xiàn)黃酮含量越高,抗氧化能力越強(qiáng),其中乙酸乙酯相總黃酮含量最高,達(dá)到6%,其抗氧化能力也最好。在抗氧化實(shí)驗(yàn)中,乙酸乙酯相抗氧化能力最強(qiáng),乙酸乙酯相、氯仿相和總提取物在清除DPPH自由基時(shí)清除率均達(dá)到98%以上,達(dá)到抗氧化劑水平,在羥基自由基、超氧陰離子自由基、總還原力實(shí)驗(yàn)中乙酸乙酯相也是各萃取相中抗氧化能力最好的,氯仿相和正丁醇相也對(duì)其具有較強(qiáng)的抗氧化能力,并隨著濃度的增長(zhǎng),抗氧化能力逐漸增強(qiáng)。因此選擇乙酸乙酯相進(jìn)行小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。

超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、過(guò)氧化物酶(POD)、谷胱甘肽(GSH)是人體內(nèi)重要的抗氧化酶,提高它的活性可以增強(qiáng)機(jī)體免疫功能,丙二醛(MDA)是脂質(zhì)過(guò)氧化的終產(chǎn)物,MDA含量的高低間接反映細(xì)胞衰老程度。在小鼠體內(nèi)抗衰老實(shí)驗(yàn)中,乙酸乙酯相可提高小鼠血清和皮膚組織中SOD、CAT、POD和GSH活性,并且隨著給藥濃度的增加,效果逐漸增強(qiáng),與模型對(duì)照組差異性顯著(p<0.05,p<0.01);而在小鼠血清中MDA和小鼠皮膚組織MDA、Hyp含量,隨著給藥濃度的增加,其值逐漸降低,實(shí)驗(yàn)表明,乙酸乙酯相具有較好的抗氧化作用。本實(shí)驗(yàn)研究為開發(fā)迎春花抗氧化保健品的研究提供了理論依據(jù)。

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Biological activity of total flavonoid fromJasminumnudoiflorumLindl

HOU Bei1,ZHAO Cheng-ai1,*,HAN Lu1,MA Bing-yang1,XU Wei-qiang1,LU Ze2

(1.College of Resources and Environment,Jilin Agricultural University,Changchun 130118,China；2.College of Science,Yanbian University,Yanji 133002,China)

Objective:The antioxidant activity of total flavonoid of each extraction phase separated fromJasminumnudoiflorumLindlwas studied. Methods:The antioxidant activity was investigated through testing the scavenging activity and reducing power of total flavonoid to DPPH radicals,hydroxyl radicals and superoxide anion radical. The extraction phase with the best antioxidant activity was selected to do the anti-aging experiments to the mice induced byD-galactose,including testing the value of MDA,SOD,CAT,POD,GSH,Hyp. Results:Each of the extraction phase separated formJasminumnudoiflorumLindlhad a high scavenging activity and total reducing power to the DPPH radicals,hydroxyl radicals and superoxide anion radical. The scavenging activity of ethyl acetate phase could reach to 98%. In the anti-aging experiments to the mice,ethyl acetate phase could greatly enhance the activity of SOD,CAT,POD and GSH to the ageing mice and reduce the quantity of MDA,Hyp. Conclusion:Throughinvitroantioxidant experiments,ethyl acetate phase separated fromJasminumnudoiflorumLindlhad the strongest oxidative capacity. Theinvivoexperiment to the ageing mice further determined the strong anti-aging ability of ethyl acetate phase.

JasminumnudoiflorumLindl;flavonoids;antioxidant activity;anti-aging

2014-07-22

侯蓓(1989-)，女，在讀碩士，研究方向：天然產(chǎn)物化學(xué)。

*通訊作者:趙成愛(ài)(1964-)，女，碩士，教授，主要從事天然產(chǎn)物化學(xué)研究。

吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(20120907)。

TS201.1

A

:1002-0306(2015)09-0353-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.09.069