不同產(chǎn)地絨柄牛肝菌紫外指紋圖譜鑒別分析

楊天偉,李 濤,張 霽,李杰慶,劉鴻高,王元忠,*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院,云南昆明 650201;2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所,云南昆明 650200;3.玉溪師范學(xué)院資源環(huán)境學(xué)院,云南玉溪 653100)

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不同產(chǎn)地絨柄牛肝菌紫外指紋圖譜鑒別分析

楊天偉1,2,李 濤3,張 霽2,李杰慶1,劉鴻高1,王元忠2,*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院,云南昆明 650201;2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所,云南昆明 650200;3.玉溪師范學(xué)院資源環(huán)境學(xué)院,云南玉溪 653100)

應(yīng)用紫外光譜技術(shù)建立了云南9個(gè)不同地區(qū)絨柄牛肝菌的紫外指紋圖譜,采用歐氏距離和主成分分析法對230～450nm的紫外光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。結(jié)果顯示該方法的精密度、重現(xiàn)性及10h內(nèi)穩(wěn)定性的RSD分別在0～2.87%、0.03%～0.63%、0.04%～1.73%之間;不同產(chǎn)地樣品間的歐氏距離值在0.26～6.52之間,樣品間的歐氏距離明顯;主成分分析的前三個(gè)主成分累積貢獻(xiàn)率達(dá)到86.848%,能夠表達(dá)樣品主要信息,前兩個(gè)主成分的二維投影圖能夠較好地區(qū)分不同產(chǎn)地絨柄牛肝菌樣品。紫外光譜結(jié)合歐氏距離、主成分分析法能夠快速鑒別不同產(chǎn)地絨柄牛肝菌。

紫外光譜,歐氏距離,主成分分析,絨柄牛肝菌,鑒別

絨柄牛肝菌(BoletustomentipesEarle)又名黑牛肝、大巴菌、毛腳牛肝菌,是牛肝菌科(Boletaceae)的一種野生食用菌[1],其子實(shí)體富含蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖、甘露醇、脂肪及多種礦質(zhì)元素[2-3],其中多糖等有增強(qiáng)免疫、抗癌、抗病毒等功能,具有極大的食藥用價(jià)值[4-6],在我國主要分布于云南[6]。云南特殊的生境資源,孕育了豐富的大型真菌資源;野生牛肝菌種類繁多,分布廣泛,受地理因素影響,不同產(chǎn)地野生食用菌,化學(xué)成分、營養(yǎng)物質(zhì)積累、藥效等不盡相同[7-8];對其進(jìn)行產(chǎn)地鑒別是食用菌開發(fā)利用和深入研究的基礎(chǔ),同時(shí)有助于野生食用菌質(zhì)量控制。傳統(tǒng)的野生食用菌的分類主要根據(jù)食用菌子實(shí)體的外觀形貌、顯微結(jié)構(gòu)、生長特性等進(jìn)行鑒別[9],但這種方法難以鑒別出產(chǎn)地來源。目前,對食用菌鑒別分類的研究主要用紅外光譜法;周在進(jìn)等[10]用傅里葉變換紅外光譜(FTIR)技術(shù)鑒別了不同產(chǎn)地雙色牛肝菌;孫素琴等[11]用傅里葉變換紅外光譜鑒別了不同廠家生產(chǎn)的36種靈芝產(chǎn)品;劉剛等[9]根據(jù)青頭菌、大紅菇等不同食用菌紅外吸收光譜的峰形、峰高對其進(jìn)行鑒別,但這種方法需要豐富的經(jīng)驗(yàn),難以建立完整的鑒別體系。

紫外光譜法具有簡便快速、靈敏可靠的特點(diǎn),根據(jù)不同物質(zhì)體系的紫外吸收圖譜峰形、峰高、峰面積等差異,可以鑒別不同物質(zhì)體系[12-13]。紫外指紋圖譜技術(shù)已被廣泛用于中藥材鑒別及含量測定[14-15],食品摻假鑒別及檢測[16-17]等多個(gè)領(lǐng)域。本研究采用紫外光譜技術(shù)結(jié)合歐氏距離和主成分分析法對9個(gè)采自云南不同產(chǎn)地的絨柄牛肝菌進(jìn)行鑒別分析,該方法能夠快速鑒別出不同產(chǎn)地絨柄牛肝菌,為野生食用菌產(chǎn)地鑒別和質(zhì)量控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

絨柄牛肝菌樣品均采自2011年,并由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)劉鴻高教授鑒定為絨柄牛肝菌BoletustomentipesEarle,來源見表1。

表1 絨柄牛肝菌樣品來源Table1 Sources of Boletus tomentipes samples

氯仿(分析純) 西隴化工股份有限公司;石油醚(分析純) 天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司;氫氧化鈉(分析純) 西隴化工股份有限公司;無水乙醇(分析純) 云南汕滇藥業(yè)有限公司;蒸餾水。

UV-2550雙通道紫外可見分光光度計(jì)配有UV probe工作站 日本島津公司;KQ5200型超聲波清洗機(jī) 昆明市超聲儀器有限公司;FW-100型高速粉碎機(jī) 天津市華鑫儀器廠;100目標(biāo)準(zhǔn)篩盤 浙江上虞市道墟五四儀器廠。

1.2 樣品處理及紫外光譜測定

樣品采集后,清洗干凈,50℃烘干,取同一產(chǎn)地的10個(gè)絨柄牛肝菌子實(shí)體混合粉碎,過100目篩,備用;準(zhǔn)確稱取0.10g絨柄牛肝菌樣品于25mL比色管中,加入10mL氯仿,超聲提取30min,過濾得氯仿提取液。以氯仿作為參比液和測試液進(jìn)行基線校正及空白測定,以消除基線漂移;以氯仿為參比液測定牛肝菌樣品提取液的紫外指紋圖譜,設(shè)定掃描波長為190～450nm,重復(fù)掃描3次,狹縫1.0nm,采樣間隔0.2nm。對氯仿提取液所測得的原始光譜進(jìn)行3組總平均,減去空白,以消除溶劑干擾,提高光譜測定的準(zhǔn)確度[18]。

1.3 牛肝菌樣品的提取條件

1.3.1 最佳提取溶劑 以樣品B4為考察對象,準(zhǔn)確稱取0.10g樣品于25mL比色管中,分別加入10mL蒸餾水、無水乙醇、氯仿、石油醚和0.5mol/L氫氧化鈉,分別平行3次;超聲提取30min,過濾,以對應(yīng)溶劑為參比液測定紫外光譜,根據(jù)圖譜吸收峰數(shù)考察不同溶劑對絨柄牛肝菌提取率的影響。

1.3.2 最佳提取時(shí)間 以樣品B4為考察對象,準(zhǔn)確稱取0.10g樣品,加入10mL氯仿,分別超聲提取20、30、40、50、60min,過濾,提取液進(jìn)行紫外光譜測定,根據(jù)吸收峰數(shù)確定最佳提取時(shí)間。

1.4 方法學(xué)實(shí)驗(yàn)

以樣品B4為考察對象,稱取0.10g樣品5份,分別加入10mL氯仿,超聲提取30min過濾,經(jīng)190～450nm紫外光譜測定,所得光譜數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)置后計(jì)算共有峰吸收波長的平均相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD%),考察重現(xiàn)性;其中共有峰的確定參照鄒華彬的共有峰識(shí)別方法[19]。

樣品B4的氯仿提取液在190～450nm重復(fù)測定6次,計(jì)算吸收波長的RSD%,考察精密度。

樣品B4的氯仿提取液分別在2、4、6、8、10h時(shí)進(jìn)行紫外光譜測定,計(jì)算吸收波長的RSD%,考察穩(wěn)定性。

1.5 數(shù)據(jù)處理

由于190～230nm紫外光譜的干擾嚴(yán)重,而絨柄牛肝菌紫外光譜的特征吸收峰在230～450nm波長范圍內(nèi),因此將230～450nm波長范圍內(nèi)的絨柄牛肝菌紫外光譜數(shù)據(jù)(波長、吸光度)轉(zhuǎn)置后,用SPSS17.0軟件計(jì)算絨柄牛肝菌樣品間的歐氏距離及進(jìn)行主成分分析,以直觀表征不同產(chǎn)地絨柄牛肝菌樣品間的相似性。

2 結(jié)果與分析

2.1 絨柄牛肝菌提取條件

2.1.1 最佳提取溶劑 不同溶劑提取絨柄牛肝菌的紫外光譜見圖1,由圖1可以看出,蒸餾水、乙醇和0.5mol/L氫氧化鈉提取液幾乎沒有紫外吸收峰;石油醚提取液吸收峰數(shù)少且吸收峰不明顯;用氯仿提取的絨柄牛肝菌在260～300nm波長范圍有明顯的吸收峰,吸收峰數(shù)多于其它溶劑提取的吸收峰數(shù),因此用氯仿作為提取溶劑。

圖1 不同溶劑提取絨柄牛肝菌的紫外指紋圖譜Fig. 1 UV fingerprint spectra of Boletus tomentipes extracted by different solvents

表2 實(shí)驗(yàn)方法的精密度Table2 The precision of the method

注:表中的同一列為一組共有峰的吸收波長,下同。

表3 實(shí)驗(yàn)方法的重現(xiàn)性Table3 The repeatability of experimental methods

表4 實(shí)驗(yàn)方法的穩(wěn)定性Table4 The stability of the experimental method

2.1.2 最佳提取時(shí)間 樣品B4不同提取時(shí)間的紫外光譜見圖2,由圖2可看出提取時(shí)間為20min時(shí)絨柄牛肝菌提取液的紫外吸收峰不明顯;當(dāng)超聲提取時(shí)間為30min時(shí)出現(xiàn)了明顯的紫外吸收峰,此后延長提取時(shí)間對絨柄牛肝菌的紫外指紋圖譜影響不明顯,故選30min為提取時(shí)間。

圖2 絨柄牛肝菌不同提取時(shí)間的紫外指紋圖譜Fig. 2 UV fingerprint spectra of Boletus tomentipes with different extraction times

2.1.3 方法學(xué)考察 以樣品B4為方法學(xué)考察對象,其結(jié)果見表2～表4。由表2可知樣品B4提取液重復(fù)測定6次,用6次測定的共有峰的波長數(shù)據(jù)計(jì)算平均相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在0～2.87%之間,表明該方法精密度好。稱取5份樣品,分別提取、測定紫外光譜,以共有峰波長數(shù)據(jù)計(jì)算的RSD介于0.03%～0.63%之間,表明該方法重現(xiàn)性好。將樣品B4提取液在不同時(shí)間段測定后,以共有峰吸收波長計(jì)算的RSD在0.04%～1.73%之間,表明樣品制備液在10h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2 不同產(chǎn)地絨柄牛肝菌紫外指紋圖譜

圖3為9個(gè)不同產(chǎn)地絨柄牛肝菌紫外指紋圖譜,由圖可以看出不同產(chǎn)地絨柄牛肝菌紫外指紋圖譜較為相似,276、281、295nm等是樣品的共有峰,表明不同產(chǎn)地絨柄牛肝菌主要的化學(xué)組分相似;但不同產(chǎn)地樣品的紫外指紋圖譜的吸收峰數(shù)目、峰高、峰位等存在一定的差異,具有明顯的指紋特性,如采自南華天申堂的絨柄牛肝菌(圖中B5)紫外吸收強(qiáng)度明顯高于其他產(chǎn)地樣品的紫外吸光度,而采自曲靖澤州桂花樹的樣品(圖中B9)是所有樣品中吸光度最小的。

圖3 不同產(chǎn)地絨柄牛肝菌紫外指紋圖譜Fig. 3 UV fingerprint spectra of Boletus tomentipes from different regions

2.3 不同產(chǎn)地絨柄牛肝菌歐氏距離

歐氏距離能用來描述樣品間的相似或不相似程度,距離越小,說明兩樣品越相似,距離越大兩樣品的差別越大[20]。根據(jù)不同產(chǎn)地絨柄牛肝菌在230～450nm的紫外吸光度計(jì)算樣品間的歐氏距離,結(jié)果見表5。由表5可知,不同產(chǎn)地絨柄牛肝菌樣品間距離最大的是B5∶B9(B5∶B9為樣品B5與樣品B9之間的歐氏距離),為6.52,表明兩樣品間相似度最小;采自楚雄南華天申堂的樣品B5及采自曲靖澤州桂花樹的樣品B9與其他產(chǎn)地樣品間的歐氏距離比較明顯,表明這兩個(gè)產(chǎn)地的絨柄牛肝菌與其他產(chǎn)地絨柄牛肝菌最易于區(qū)分;9個(gè)不同產(chǎn)地絨柄牛肝菌間的歐氏距離介于0.26～6.52之間,表明同一種牛肝菌在不同的生長環(huán)境下營養(yǎng)成分及含量的積累具有差別,這與絨柄牛肝菌紫外指紋圖譜反映的信息一致。歐氏距離能夠直觀地反映出不同產(chǎn)地樣品間的差異性,可用于不同產(chǎn)地絨柄牛肝菌鑒別。

表5 不同產(chǎn)地絨柄牛肝菌樣品間的歐氏距離Table5 The euclidean distance among differentBoletus tomentipes samples

2.4 不同產(chǎn)地絨柄牛肝菌主成分分析

主成分分析(PCA)是以降維的思想將多個(gè)指標(biāo)綜合為少數(shù)幾個(gè)指標(biāo),用幾個(gè)綜合因子替代多個(gè)原始變量,使綜合因子盡可能的反映原始變量的信息,以簡化分析過程[20]。對9個(gè)不同產(chǎn)地絨柄牛肝菌進(jìn)行主成分分析,前三個(gè)主成分的特征值和累積貢獻(xiàn)率見表6,由表6可知主成分1占總方差貢獻(xiàn)率的65.120%,是絨柄牛肝菌最重要的成分,主成分2、主成分3分別占總方差貢獻(xiàn)率的11.741%和9.987%。前三個(gè)主成分的累積貢獻(xiàn)率達(dá)到86.848%,能夠反映絨柄牛肝菌紫外指紋圖譜全部信息的86.848%(大于85%),僅有13.152%的信息丟失,能用于樣品間的相似性分析。圖4為前三個(gè)主成分的三維投影圖,由圖4可以看出不同產(chǎn)地絨柄牛肝菌樣品間的相似程度,其中樣品B9與其他樣品的相似度最小;樣品B1、B6、B7、B8之間的相似度較高,從三維圖中不易區(qū)分所有樣品。比較發(fā)現(xiàn)用PC1、PC2構(gòu)成的二維圖(圖5)能更好的區(qū)分不同產(chǎn)地絨柄牛肝菌,從圖5可以看出不同產(chǎn)地絨柄牛肝菌樣品的主成分圖產(chǎn)生明顯的離散現(xiàn)象,反映出不同產(chǎn)地樣品的化學(xué)成分積累不相同。

表6 主成分特征值及貢獻(xiàn)率Table6 Characteristic value and contributing ratios of principal components

圖4 不同產(chǎn)地絨柄牛肝菌主成分分析的三維圖Fig.4 Three-dimensional diagram of Boletus tomentipes from different regions by PCA

圖5 不同產(chǎn)地絨柄牛肝菌樣品主成分分析的二維圖Fig.5 Two-dimensional diagram of Boletus tomentipes from different regions by PCA

3 討論

絨柄牛肝菌在不同生長環(huán)境或不同生長階段會(huì)出現(xiàn)大量的表形變異,如其菌蓋有暗褐色和棕褐色;幼嫩時(shí)邊緣內(nèi)卷,老后邊緣一般變平[1];此外,受生長環(huán)境影響,不同產(chǎn)地野生食用菌的化學(xué)成分、營養(yǎng)價(jià)值等不盡相同[21],傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法難以鑒別產(chǎn)地來源[9]。

本文采用紫外光譜結(jié)合歐氏距離和主成分分析法對不同產(chǎn)地絨柄牛肝菌進(jìn)行鑒別研究,結(jié)果顯示不同產(chǎn)地絨柄牛肝菌紫外指紋圖譜的峰形比較相似,表明絨柄牛肝菌的氯仿提取液中主要化學(xué)成分比較相似,即絨柄牛肝菌積累的化學(xué)組分基本相同;而絨柄牛肝菌氯仿提取液在同一波長處紫外吸光度差異較明顯,表明不同生長環(huán)境下絨柄牛肝菌對營養(yǎng)物質(zhì)的積累量不同,這與Svoboda和Chrastny[22],Falandysz[21]等研究的不同生態(tài)環(huán)境下食用菌中富集的微量元素有差異的結(jié)論相符。

Chojnacka等測定了12個(gè)地區(qū)絨蓋牛肝菌屬(Xerocomus subtomentosus)及相應(yīng)土壤中Hg元素含量,發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)絨蓋牛肝菌屬對Hg元素的積累不同,采自礦產(chǎn)周圍的樣品Hg元素含量最高,同時(shí)發(fā)現(xiàn)絨蓋牛肝菌屬中Hg的含量與土壤中Hg的含量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系[23]。本實(shí)驗(yàn)將不同產(chǎn)地絨柄牛肝菌紫外光譜數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)置后進(jìn)行歐氏距離和主成分分析,結(jié)果顯示,樣品間的歐氏距離較明顯,其中楚雄南華天申堂的樣品B5及采自曲靖澤州桂花樹的樣品B9間的歐氏距離最大,這與圖3反映的結(jié)果一致,表明這兩個(gè)產(chǎn)地的樣品對化學(xué)成分的積累差異較大。主成分分析結(jié)果顯示,前三個(gè)主成分能夠反映絨柄牛肝菌樣品的主要信息,9個(gè)產(chǎn)地樣品在主成分分析的二維圖中產(chǎn)生離散分布,表明每個(gè)產(chǎn)地絨柄牛肝菌對化學(xué)成分的積累具有差異。這可能是由于不同產(chǎn)地氣候條件、土壤環(huán)境、及地質(zhì)地貌等的差異,導(dǎo)致絨柄牛肝菌對營養(yǎng)物質(zhì)的積累具有差異性和特殊性。

4 結(jié)論

應(yīng)用紫外光譜結(jié)合歐氏距離和主成分分析法分析了9個(gè)不同產(chǎn)地絨柄牛肝菌樣品。首先通過單因素實(shí)驗(yàn)考察不同溶劑,不同提取時(shí)間對絨柄牛肝菌提取效果的影響,確定提取絨柄牛肝菌特征成分的溶劑為氯仿,超聲提取時(shí)間為30min;然后建立不同產(chǎn)地絨柄牛肝菌紫外指紋圖譜。不同產(chǎn)地絨柄牛肝菌紫外指紋圖譜較為相似,而紫外圖譜的峰強(qiáng)、峰位等存在一定的差異,表明絨柄牛肝菌的主要化學(xué)組分相似,但含量不同。將230～450nm的紫外光譜數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)置后,分別用歐氏距離和主成分分析法分析不同產(chǎn)地絨柄牛肝菌樣品的相似度,結(jié)果顯示兩種分析方法均能反映絨柄牛肝菌樣品間的差異性;其中,樣品間的歐氏距離在0.26～6.52之間,根據(jù)歐氏距離大小,可以反映樣品間相似度的從而鑒別不同產(chǎn)地絨柄牛肝菌;主成分分析的前三個(gè)主成分能夠反映樣品的主要信息,前兩個(gè)主成分的二維投影圖產(chǎn)生離散現(xiàn)象。紫外光譜技術(shù)結(jié)合歐氏距離和主成分分析法能夠鑒別不同產(chǎn)地絨柄牛肝菌,為野生食用菌的產(chǎn)地鑒別和質(zhì)量控制提供參考。

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Ultraviolet spectrum identification ofBoletustomentipesfrom different regions

YANG Tian-wei1,2,LI Tao3,ZHANG Ji2,LI Jie-qing1,LIU Hong-gao1,WANG Yuan-zhong2,*

(1. College of Agronomy and Biotechnology,Yunnan Agricultural University,Kunming 650201,China;2. Institute of Medicinal Plants,Yunnan Academy of Agricultural Sciences,Kunming 650200,China 3. College of Resources and Environment,Yuxi Normal University,Yuxi 653100,China)

The ultraviolet fingerprints ofBoletustomentipesfrom nine different areas in Yunnan were established. UV spectral data in the range of 230～450nm were analyzed by Euclidean distance and principal component analysis(PCA). The results showed that,the RSDs of stability within 10h,accuracy and repeatability of the method,were 0.04%～1.73%,0～2.87% and 0.03%～0.63%,respectively. The Euclidean distance value of samples among different origins differed significantly from 0.26 to 6.52. PCA showed that the cumulative contribution rate of the first three factors was 86.848%,which could reflect the most information of the samples,and the two-dimensional projection of the first two principal components could distinguishBoletustomentipessamples from different regions. Ultraviolet spectrum combined with Euclidean distance and principal component analysis(PCA)can rapidly identify different origin ofBoletustomentipes.

ultraviolet spectrum;euclidean distance;principal component analysis(PCA);Boletustomentipes;identification

2014-07-23

楊天偉(1989-)，男，碩士研究生，研究方向：食用真菌資源研究。

*通訊作者:王元忠(1981-)，男，碩士，助理研究員，研究方向：藥用植物與藥用真菌資源研究。

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31260496,31160409)；云南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2011FB053,2011FZ195)；云南省教育廳科學(xué)研究基金項(xiàng)目(2013Z074)。

TS201.2

A

:1002-0306(2015)09-0301-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.09.057