微波輔助提取菱紅菇多糖及抗氧化活性研究

王婭玲,李維峰,郭 芬,張傳利,吳榮書

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)熱帶作物學(xué)院,云南普洱 665000)

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微波輔助提取菱紅菇多糖及抗氧化活性研究

王婭玲,李維峰,郭 芬,張傳利,吳榮書*

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)熱帶作物學(xué)院,云南普洱 665000)

探討菱紅菇多糖微波輔助提取工藝,并研究其抗氧化活性?？疾炝弦罕?、微波功率、微波時(shí)間對(duì)菱紅菇多糖提取得率的影響,在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,利用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,并對(duì)菱紅菇多糖還原力和對(duì)羥自由基、亞硝酸根、超氧自由基的清除作用進(jìn)行研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,菱紅菇多糖微波輔助提取最佳提取條件為水料比1∶40(g/mL),微波功率500W,微波時(shí)間7min,,在此條件下多糖平均得率為7.82%。菱紅菇多糖具有較強(qiáng)的還原能力和清除羥自由基、亞硝酸根、超氧自由基的能力。盡管菱紅菇多糖抗氧化性低于VC,但可作為潛在的天然抗氧化劑應(yīng)用于食品工業(yè)中。

菱紅菇,多糖,微波,提取,抗氧化活性

多糖是由多個(gè)單糖聚合而成的大分子化合物,作為生命活動(dòng)的四大基本物質(zhì)之一,對(duì)生命有機(jī)體具有重要的意義。自Brander研究發(fā)現(xiàn)酵母細(xì)胞壁多糖具有抗腫瘤活性之后,人們做了大量關(guān)于真菌多糖生物活性的研究。研究發(fā)現(xiàn),真菌多糖具有抗腫瘤、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、降血脂、降血糖等生理功能[1]。

菱紅菇(Russulavescafr.),別名細(xì)弱紅菇,屬擔(dān)子菌門、擔(dān)子菌綱、紅菇目、紅菇科、紅菇屬[2],廣泛分布于江蘇、福建、云南、廣西等地,可食用,質(zhì)地脆嫩,味道鮮美,亦可入藥,具有和胃氣、祛風(fēng)、破血、緩沖等藥效[3]。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)紅菇屬真菌開展了一定的研究[4-7],但是對(duì)菱紅菇多糖的提取分離及其抗氧化活性的研究卻還未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以野生菱紅菇為實(shí)驗(yàn)材料,研究了菱紅菇多糖的微波輔助提取技術(shù),通過正交實(shí)驗(yàn)[8]優(yōu)化提取工藝,并對(duì)菱紅菇多糖的抗氧化活性進(jìn)行了測(cè)定,為進(jìn)一步開發(fā)菱紅菇的藥用保健功能提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菱紅菇 野生菱紅菇采集于云南省普洱市山地栗木雜生林下;濃硫酸、無水乙醇、丙酮、苯酚、乙醚、氯仿、三氯乙酸、磷酸等試劑 均為分析純。

電子天平 梅特勒AL204;冷凍離心機(jī) 中科中佳HC-3618R;分光光度計(jì) 上海精科UV759;微波爐美的EG823MF4-NA;真空干燥箱 上海一恒DZF-6053;萬能粉碎機(jī) 北京中興偉業(yè)FW-200;電熱鼓風(fēng)箱 上海一恒DHG-9620A;水浴鍋 上海一恒HWS-24。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原料的處理 將野生菱紅菇洗凈泥沙及粘附的雜物后65℃烘干,高速中藥粉碎機(jī)粉成粉末,過70目篩,按照1∶3(g/mL)比例加入無水乙醚連續(xù)回流萃取2h,抽取脂肪,于烘箱中60℃烘干后再按照1∶3(g/mL)比例加入85%乙醇連續(xù)回流萃取2h,去除單糖、低聚糖等雜質(zhì),再于烘箱中60℃烘干備用。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn) 預(yù)處理后的菱紅菇粉末通過基本實(shí)驗(yàn)條件:微波功率400W,加水按料液比1∶40(g/mL),微波處理時(shí)間50min,分別研究不同料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60)、不同微波功率(200、300、400、500、600、700W)、不同微波時(shí)間(2、3、4、5、6、7min)對(duì)菱紅菇多糖得率的影響。

1.2.3 菱紅菇多糖微波正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在上述單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,選擇浸提料液比、微波功率和微波時(shí)間3個(gè)因素按照L9(34)設(shè)計(jì)三因素三水平實(shí)驗(yàn)(如表1)。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.4 菱紅菇多糖提取方法 菱紅菇→洗凈60℃烘干→粉碎→過70目篩→去除脂質(zhì)及單糖等雜質(zhì)→微波浸提→抽濾→濾液測(cè)定多糖含量→Sevage法去蛋白→水相加入乙醇,4℃沉淀過夜→4℃冷凍離心→沉淀→依次用95%乙醇、無水乙醇、乙醚、丙酮洗滌兩次→60℃真空干燥至恒重→菱紅菇多糖。

1.2.5 菱紅菇多糖得率的計(jì)算及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 采用苯酚-硫酸法[9]。準(zhǔn)確稱取干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品0.1000g,蒸餾水溶解后轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶定容,搖勻,配成1mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取2、4、6、8、10mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液定容到50mL,分別吸取定容后葡萄糖溶液0.8mL于25mL具塞比色管中,以蒸餾水為空白對(duì)照,各加新鮮配制5%苯酚0.8mL,搖勻,再加入98%濃硫酸5mL,震蕩搖勻,40℃水浴加熱30min,冷卻至室溫,490nm處測(cè)定吸光度,以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得線性回歸方程y=7.1713x+0.0043(R2=0.9991)。

精確吸取抽濾得到的定容好的菱紅菇多糖溶液0.8mL,按照上述方法測(cè)定吸光度值,代入回歸曲線計(jì)算多糖含量,并按照下面公式計(jì)算多糖得率:

菱紅菇多糖得率(%)=(提取液中多糖質(zhì)量/原料質(zhì)量)×100

1.2.6 抗氧化活性測(cè)定 將提取得到的菱紅菇多糖配成50、100、200、400、600、800、1000μg/mL不同濃度的溶液進(jìn)行如下抗氧化活性實(shí)驗(yàn):還原能力測(cè)定采用鐵氰化鉀還原法[10],羥基自由基清除能力測(cè)定采用Fenton反應(yīng)—分光光度法[11],亞硝酸根清除能力測(cè)定采用鹽酸萘乙二胺法[12],超氧陰離子的清除作用采用鄰苯三酚自氧化法[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 料液比對(duì)多糖得率的影響 由圖1可以看出,菱紅菇多糖的得率隨著料液比的增加而增加,提取液比例越高,則多糖溶出平衡越向水相中移動(dòng),多糖得率越高,當(dāng)料液比達(dá)到1∶40(g/mL)后,菱紅菇多糖達(dá)到提取得率最大值,之后再增加提取液比例,得率會(huì)略有降低,原因可能是溶劑增加會(huì)引起能量的額外損耗,導(dǎo)致在固定微波功率下溶劑溫度上升較慢,同等提取時(shí)間下得率下降。因此確定最佳料液比為1∶40(g/mL)。

圖1 料液比對(duì)多糖得率的影響Fig.1 Effect of the ratio between material and solvent on polysaccharides extraction rate

2.1.2 微波功率對(duì)多糖得率的影響 由圖2可以看出,在200～500W范圍內(nèi),隨著微波功率的增加,菱紅菇多糖的得率不斷升高,但當(dāng)微波功率超過500W后,多糖得率反而開始下降,原因可能是微波功率過高,導(dǎo)致原料細(xì)胞內(nèi)過快的微波熱效應(yīng)會(huì)破壞多糖的結(jié)構(gòu),從而導(dǎo)致多糖降解,從而使得多糖得率下降,因此選擇500W為最佳微波提取功率。

圖2 微波功率對(duì)多糖得率的影響Fig.2 Effect of microwave power on polysaccharides extraction rate

2.1.3 微波時(shí)間對(duì)多糖得率的影響 從圖3可以看出,微波作用時(shí)間2～6min范圍內(nèi)多糖得率隨微波時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,在微波時(shí)間達(dá)到6min時(shí)達(dá)到最大值,之后繼續(xù)微波提取得率會(huì)有所降低,其原因是微波長(zhǎng)時(shí)間作用于多糖分子而使其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,產(chǎn)生降解,從而導(dǎo)致多糖得率下降,所以選定6min為最佳微波時(shí)間。

圖3 微波時(shí)間對(duì)多糖得率的影響Fig.3 Effect of microwave times on polysaccharides extraction rate

2.2 菱紅菇多糖微波提取工藝的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

以菱紅菇多糖得率為評(píng)價(jià)指標(biāo),使用正交設(shè)計(jì)助手Ⅱ進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 微波提取正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table2 The results and analysis of orthogonal test

通過極差R值的比較可以看出,影響菱紅菇多糖得率因素的主次順序?yàn)?料液比>微波時(shí)間>微波功率,菱紅菇多糖的微波提取最佳條件是A2B2C3,即料液比為1∶40(g/mL),微波功率為500W,微波時(shí)間為7min。在此條件下對(duì)菱紅菇多糖進(jìn)行3次平行提取實(shí)驗(yàn),多糖得率分別為7.76%、7.83%、7.88%,平均值為7.82%,高于正交實(shí)驗(yàn)中所有多糖得率且重現(xiàn)性好,表明該條件穩(wěn)定可行。

2.3 菱紅菇多糖抗氧化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

2.3.1 還原力的測(cè)定 抗氧化劑的還原能力與其抗氧化活性之間有著明顯的相關(guān)性,抗氧化劑還原力越大,抗氧化能力越強(qiáng),因此可以根據(jù)還原力的大小判斷抗氧化劑的抗氧化能力強(qiáng)弱。由圖4可以看出,在0～1000μg/mL范圍內(nèi),菱紅菇多糖還原能力隨著濃度的增大而升高,但是其還原能力與VC相比則顯得較弱,在600μg/mL的濃度下其還原力與100μg/mL的VC還原力相當(dāng)。

圖4 多糖的還原力Fig.4 Reducing power of polysaccharides

2.3.2 羥基自由基清除能力測(cè)定 在生物體內(nèi),羥自由基反應(yīng)活性很強(qiáng),它可以導(dǎo)致細(xì)胞膜系統(tǒng)氧化,并與生物大分子反應(yīng),造成細(xì)胞損傷乃至死亡[14]。由圖5可以看出菱紅菇多糖對(duì)·OH的清除能力隨濃度的增加而升高,在多糖濃度1000μg/mL時(shí),清除率達(dá)到56.25%,表現(xiàn)出較強(qiáng)的羥自由基清除能力。

圖5 多糖對(duì)·OH的清除作用Fig.5 ·OH scavenging capability of polysaccharides

圖6 多糖對(duì)亞硝酸根離子的清除作用Fig.6 The scavenging capability of

2.2.3 亞硝酸根清除能力測(cè)定 亞硝酸鹽廣泛存在于腌制品中,其進(jìn)入人體后會(huì)轉(zhuǎn)化為強(qiáng)致癌物亞硝胺[15],由圖6可知,菱紅菇多糖對(duì)亞硝酸鹽具有一定的清除作用,在1000μg/mL濃度下菱紅菇多糖亞硝酸鹽清除率為45.61%,但同等濃度的VC清除率為98.15%,因此菱紅菇多糖的清除亞硝酸鉻能力明顯弱于VC。

2.2.4 超氧陰離子清除能力測(cè)定 由圖7可以看出,菱紅菇多糖對(duì)超氧陰離子具有較好的抗氧化活性,其對(duì)超氧陰離子的清除率隨著濃度的增大而增加,在菱紅菇多糖濃度為1000μg/mL時(shí),清除率達(dá)到56.01%。

圖7 多糖對(duì)超氧陰離子的清除作用Fig.7 The scavenging capability of

3 結(jié)論

本研究通過單因素實(shí)驗(yàn)考察了浸提料液比、微波功率和微波時(shí)間對(duì)菱紅菇多糖提取得率的影響,通過正交實(shí)驗(yàn)確定了影響得率的主次順序?yàn)榱弦罕?微波時(shí)間>微波功率,最佳提取條件為料液比為1∶40(g/mL),微波時(shí)間為7min,微波功率為500W，多糖得率為7.82%。菱紅菇多糖對(duì)亞硝酸鹽、羥自由基和超氧自由基都有一定的清除作用,而且具有量效關(guān)系,其中對(duì)羥自由基和超氧自由基的清除能力較強(qiáng),說明菱紅菇多糖具有一定的抗氧化活性。

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Study on microwave-assisted extraction and the antioxidant activities of polysaccharide fromRussulavesca

WANG Ya-ling,LI Wei-feng,GUO Fen,ZHANG Chuan-li,WU Rong-shu*

(Faculty of Tropical Crops,Yunnan Agricultural University,Pu’er 665000,China)

Russulavesca;polysaccharide;microwave;extraction;antioxidant activity

2014-08-11

王婭玲(1985-)，女，本科，助教，主要從事環(huán)境化學(xué)和食品化學(xué)方面的研究。

*通訊作者:吳榮書(1960-)，女，學(xué)士，教授，主要從食品安全與質(zhì)量控制方面研究。

云南農(nóng)業(yè)大學(xué)熱帶作物學(xué)院科研基金資助項(xiàng)目(019RY2014001)。

TS201.2

B

:1002-0306(2015)09-0251-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.09.046