銀杏愈傷組織黃酮提取條件的正交實驗優(yōu)化

梁文惠,黃 翔,林麗春,夏年益,張 珣,彭春林,丘 添,施曉宇,鄧祥宜

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)楚天學(xué)院食品與生物科技學(xué)院,湖北武漢 430205)

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銀杏愈傷組織黃酮提取條件的正交實驗優(yōu)化

梁文惠,黃 翔,林麗春,夏年益,張 珣,彭春林,丘 添,施曉宇,鄧祥宜*

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)楚天學(xué)院食品與生物科技學(xué)院,湖北武漢 430205)

以銀杏愈傷組織為材料,對銀杏黃酮的提取條件進行優(yōu)化。通過單因素實驗研究乙醇濃度、液料比、微波功率、微波時間、水浴溫度、水浴時間等對黃酮得率的影響,并進行了正交實驗優(yōu)化。正交實驗的結(jié)果表明:以40%乙醇為提取溶劑,液料比25∶1,在中火檔(528W)微波60s,不進行水浴處理,黃酮得率達到20.92mg/g。

銀杏愈傷組織,黃酮,提取條件優(yōu)化,正交實驗,微波處理

銀杏黃酮具有抗衰老、提高免疫機能、防治心血管病的作用[1-2]。國際市場上的天然藥物中銀杏黃酮制劑是用量最大的種類之一,銀杏保健食品也很受人們青睞。隨著我國人口老齡化的快速發(fā)展,心血管疾病發(fā)病率的增加,銀杏黃酮相關(guān)的藥品和保健品產(chǎn)業(yè)將會持續(xù)發(fā)展。目前銀杏黃酮主要從葉片中提取,近年來,銀杏葉中黃酮提取方法的研究也較多[3-7]。但大面積栽培銀杏占用大量耕地,給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成一定影響;同時葉片中的藥用成分含量比較低,提取工藝復(fù)雜,易受季節(jié)限制[8]。利用組織培養(yǎng)大規(guī)模生產(chǎn)黃酮、銀杏內(nèi)酯等藥用成分,不但可以節(jié)省土地資源,而且可以提高生產(chǎn)效益。人們對銀杏愈傷組織的誘導(dǎo)、繼代進行了研究[8-9],但對愈傷組織中黃酮提取條件的研究較少。本文通過單因素實驗和正交實驗優(yōu)化了微波法提取銀杏愈傷組織中黃酮的相關(guān)條件,以期為組織培養(yǎng)法生產(chǎn)銀杏黃酮的研究和生產(chǎn)實踐作鋪墊。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

銀杏愈傷組織 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)楚天學(xué)院實驗教學(xué)中心;蘆丁標準品 國藥集團化學(xué)試劑有限公司;其它試劑均為分析純。

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱DH6-914385-Ⅲ 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;電子天平FA2104B 上海越平科學(xué)儀器有限公司;高速離心機TDL-5-A 上海安亭科學(xué)儀器廠;微波爐P80D23N1P-B5(B0) 佛山市順德區(qū)格蘭仕微波爐電器有限公司;數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-6 國華電器有限公司;分光光度計722 上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 材料培養(yǎng)及處理 愈傷組織培養(yǎng)以MS培養(yǎng)基外加0.5mg/L NAA,0.25mg/L 6-BA、1%瓊脂和3%的蔗糖為繼代培養(yǎng)基,培養(yǎng)溫度25±1℃,避光培養(yǎng)75d后收獲。120℃滅酶10min,60℃烘干至恒重,研磨后過60目篩得到銀杏愈傷組織粉末,干燥器中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 黃酮提取工藝流程 銀杏愈傷組織粉末→加入乙醇水溶液→搖勻后微波處理→(水浴浸提)→4000r/min離心15min→取上清液測定黃酮含量,計算得率。

1.2.3 黃酮測定方法 黃酮含量測定方法采用Al(NO3)3顯色法,參照文獻[4,10],略有改動,具體操作如下:

蘆丁標準曲線的繪制:準確稱取25mg蘆丁標準品,用80%(v/v)乙醇溶液溶解,定容到250mL,得0.1mg/mL的蘆丁標準液。取6支(編號0、1、2、3、4、5)25 mL的比色管,依次加入0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL蘆丁標準液,再分別加80%(v/v)的乙醇溶液至5mL,搖勻;各加入5%的NaNO2溶液0.3mL,搖勻,靜置5min;各加入10%的Al(NO3)3溶液0.3mL,搖勻,靜置6min;再各加入1mol/L的NaOH溶液4mL,定容至10mL,充分搖勻,以0號比色管為參比,在510nm下測定1-5號比色管的吸光度,以蘆丁含量(mg)為橫坐標,以吸光度(A510)為縱坐標作蘆丁標準曲線。

提取液中黃酮含量測定:取適量體積(V1)的提取液加入25mL的比色管中,按上述標準曲線中的方法進行定容、顯色、測定吸光值,參照標準曲線計算黃酮含量(x1),進而計算黃酮得率:

V1:分光光度法測定黃酮含量所用提取液體積;x1:所用提取液中的黃酮含量(參照標準曲線計算);V總:提取液總體積。

1.2.4 單因素實驗方法

1.2.4.1 乙醇濃度的優(yōu)化 稱取7份0.2g干燥銀杏愈傷組織粉末置于7個10mL離心管中,然后向每支離心管中分別加入30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%(v/v)的乙醇水溶液5mL,搖勻,將離心管(每次4支,不足時用裝等體積水的離心管補齊)放入微波爐中,解凍檔微波60s(每5s取出水浴冷卻1次,搖勻后繼續(xù)進行微波)。再放入80℃水浴鍋中水浴2h(每15min搖勻1次)。水浴結(jié)束后,4000r/min離心15min,吸取上清液按照1.2.3中方法測定黃酮含量,計算黃酮得率。每個梯度做兩組平行實驗,結(jié)果以平均值±標準差表示。繪圖分析乙醇濃度對黃酮得率的影響。

1.2.4.2 液料比的優(yōu)化 保持提取劑(40%乙醇)體積為5mL不變,改變粉末重量,研究不同液料比(10∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1、100∶1)對黃酮得率的影響。其他條件參數(shù)參見1.2.4.1。

1.2.4.3 微波功率的優(yōu)化 研究不同微波功率(低火、解凍、中火、中高火、高火檔,對應(yīng)的功率值分別為136、296、528、680、800W)對黃酮得率的影響。提取劑為40%乙醇,液料比為25∶1,其他條件參數(shù)參見1.2.4.1。

1.2.4.4 微波時間的優(yōu)化 研究不同微波時間(0、10、20、40、60、80、100、120、140s)對黃酮得率的影響。提取劑為40%乙醇,液料比為25∶1,微波功率為解凍檔(296W),其他條件參數(shù)參見1.2.4.1。

1.2.4.5 水浴溫度的優(yōu)化 研究不同水浴溫度(50、60、70、80、90℃)對黃酮得率的影響。提取劑為40%乙醇,液料比為25∶1,微波功率為解凍檔(296W),微波時間為60s,其他條件參數(shù)參見1.2.4.1。

1.2.4.6 水浴時間的優(yōu)化 研究不同水浴時間(0、1、2、3、4、5h)對黃酮得率的影響。提取劑為40%乙醇,液料比為25∶1,微波功率為解凍檔(296W),微波時間為60s,水浴溫度80℃,其他條件參數(shù)參見1.2.4.1。

1.2.4.7 提取次數(shù)的選擇 研究提取次數(shù)(1、2、3次)對黃酮得率的影響。提取劑為40%乙醇,液料比為25∶1,微波功率為解凍檔(296W),微波時間為60s,水浴溫度80℃,水浴時間2h,其他條件參數(shù)參見1.2.4.1。

1.2.5 正交實驗方法 在單因素實驗基礎(chǔ)上,按照正交表L9(33)安排實驗(見表1),通過極差分析找出最優(yōu)組合,3因素外的其它條件為單因素實驗最優(yōu)條件。并在正交實驗獲得的最優(yōu)條件下進行4次平行實驗,以驗證結(jié)果的可靠性。

表1 正交實驗因素水平表Table1 Factors and levels of orthogonal test

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線的繪制

以蘆丁含量(mg)為橫坐標,吸光度為縱坐標,繪制蘆丁標準曲線,見圖1。所得回歸方程為y=1.233x-0.0029,R2=0.9995,方程線性關(guān)系很好。

圖1 蘆丁標準曲線Fig.1 The rutin calibration curve

2.2 單因素實驗結(jié)果及分析

2.2.1 不同乙醇濃度對黃酮得率的影響 不同乙醇濃度對黃酮得率影響的實驗結(jié)果(圖2)表明:乙醇濃度為30%時,黃酮的得率為18.89mg/g,隨著乙醇濃度的升高,黃酮得率逐漸升高,在乙醇濃度為40%時得率達到最大,為21.01mg/g,當(dāng)乙醇濃度超過40%時,黃酮得率反而隨著乙醇濃度的升高而降低。這可能是因為在銀杏愈傷組織中黃酮以黃酮糖苷的形式存在,有一定的親水性,乙醇濃度過大反而不利于其溶解。因此,40%乙醇為本實驗的最佳濃度。

圖2 乙醇濃度對黃酮得率的影響Fig.2 The effect of ethanol concentration on the extraction rate

2.2.2 不同液料比對黃酮得率的影響 不同液料比對黃酮得率影響的實驗結(jié)果(圖3)表明:液料比為10∶1時,黃酮得率為7.97mg/g;隨著液料比的增大,黃酮得率迅速上升,當(dāng)液料比為25∶1時,黃酮得率為21.28mg/g;之后,黃酮得率仍隨著液料比的增大而上升,但上升趨勢逐漸減小。由此可知,液料比的提高有利于總黃酮的提取,這可能是因為隨著溶劑的增加,黃酮擴散出來的傳質(zhì)動力也加大。工業(yè)生產(chǎn)中,由于液料比的增大而使得容器利用效率降低和后續(xù)濃縮困難。從節(jié)省提取劑、提高容器利用效率以及便于后續(xù)濃縮、純化處理等角度考慮,本實驗選擇液料比25∶1為最佳液料比。

圖3 液料比對黃酮得率的影響Fig.3 The effect of liquid-powder ratio on the extraction rate

2.2.3 不同微波功率對黃酮得率的影響 不同微波功率對黃酮得率影響的實驗結(jié)果(圖4)表明:低火檔(136W)時黃酮得率較低,隨著火力增強黃酮得率有所增加,在中高火檔(680W)時達到最高,為22.15mg/g,而高火(800W)時黃酮得率出現(xiàn)下降。這可能是由于過高的微波功率對黃酮類物質(zhì)有破壞作用,導(dǎo)致得率下降。因此,選擇中高火檔(680W)為本實驗最佳提取功率。

圖4 微波功率對黃酮得率的影響Fig.4 The effect of microwave power on the extraction rate

2.2.4 不同微波時間對黃酮得率的影響 不同微波時間對黃酮得率影響的實驗結(jié)果(圖5)表明:微波時間為0s時,黃酮得率為17.19mg/g,隨著時間的延長,黃酮得率迅速增加,當(dāng)微波時間為40s時,黃酮得率達20.86mg/g,超過40s后,黃酮得率隨著處理時間的延長呈現(xiàn)震蕩并緩慢上升的趨勢。因此,可認為最佳微波時間為40s。

圖5 微波時間對黃酮得率的影響Fig.5 The effect of microwave processing time on the extraction rate

2.2.5 不同水浴溫度對黃酮得率的影響 不同水浴溫度對黃酮得率影響的實驗結(jié)果(圖6)表明:水浴溫度為50℃時,黃酮得率為21.28mg/g,隨著水浴溫度的升高,黃酮得率在整體上呈現(xiàn)先上升后下降趨勢,在70℃時黃酮得率達到最大,為22.09mg/g。70℃之后得率隨溫度升高有下降趨勢。這可能是因為溫度升高有利于黃酮類物質(zhì)溶出,但溫度過高又可能對黃酮類物質(zhì)有一定破壞作用。因此選用70℃為最佳水浴溫度。

圖6 水浴溫度對黃酮得率的影響Fig.6 The effect of water bath temperature on the extraction rate

2.2.6 不同水浴時間對黃酮得率的影響 不同水浴時間對黃酮得率影響的實驗結(jié)果(圖7)表明:當(dāng)水浴時間為0h時,黃酮得率為19.58mg/g;水浴2h時,黃酮得率出現(xiàn)峰值,為20.66mg/g;2h以后,得率則隨著時間的延長呈現(xiàn)下降趨勢。這是因為:在2h內(nèi)黃酮化合物不斷溶出,從而浸提時間越長黃酮得率越高;2h后,黃酮化合物溶出不再明顯,而且由于長時間處于高溫狀態(tài),可能導(dǎo)致黃酮化合物結(jié)構(gòu)發(fā)生變化而失活,從而隨著浸提時間的延長,黃酮得率呈現(xiàn)下降趨勢。

水浴2h時的黃酮得率最大,為20.66mg/g,但與水浴0h的黃酮得率19.58mg/g相比,僅提高了1.08mg/g(約5.5%),從簡化提取工序、降低能耗等角度出發(fā),水浴0h(即不進行水浴處理)為最佳選擇。

圖7 水浴時間對黃酮得率的影響Fig.7 The effect of water bath processing time on the extraction rate

2.2.7 不同提取次數(shù)對黃酮得率的影響 不同提取次數(shù)對黃酮得率影響的實驗結(jié)果(圖8)表明:第1次的黃酮得率達到了21.17mg/g,占前3次總得率的77.95%;第2次的黃酮得率為4.40 mg/g,占前3次總得率的16.20%;第3次的黃酮得率為1.59mg/g,只占前3次總得率的5.85%。提取次數(shù)增多可以提高累計得率,但增加提取次數(shù)會成倍地增加乙醇用量、操作時間等成本,而黃酮產(chǎn)量增加卻很少。因此生產(chǎn)中選擇1次提取為最優(yōu)。如果是實驗中為了考察愈傷組織中的真實含量,可提取兩次,此時累計得率占總得率的94.15%,基本可以代替材料中的總黃酮含量。

圖8 提取次數(shù)對黃酮得率的影響Fig.8 The effect of extraction times on the extraction rate

2.3 正交實驗結(jié)果及分析

根據(jù)單因素實驗結(jié)果,從提取工藝中去掉水浴處理過程,選取微波功率、乙醇濃度、微波時間進行3因素3水平的正交實驗設(shè)計,其余條件為單因素實驗的最優(yōu)條件。正交實驗結(jié)果(表2)表明:各因素對黃酮得率影響的大小次序依次為:乙醇濃度>微波時間>微波功率。黃酮得率最高的優(yōu)水平組合是A1B2C3,即微波功率為中火檔(528W),提取溶劑為40%乙醇,微波時間為60s,其余條件為單因素最優(yōu)條件。

驗證性實驗結(jié)果(表3)表明:在正交實驗最優(yōu)條件下,黃酮得率達到20.92±0.28mg/g,考慮到實驗誤差,高于正交實驗中其他梯度,因此正交實驗結(jié)果可信。

表2 L9(33)正交實驗結(jié)果Table2 The result of the L9(33)orthogonal experiment

表3 驗證性實驗結(jié)果Table3 The result of verification experiment

3 結(jié)論與討論

本研究通過單因素實驗和正交實驗,得到了銀杏愈傷組織黃酮提取的最佳條件:以40%乙醇為提取溶劑,液料比25∶1,在中火檔(528W)微波60s,黃酮得率最高,單次提取的黃酮得率達到20.92mg/g。這比很多文獻中銀杏葉片黃酮的得率明顯高一些,因為葉片中黃酮化合物總含量才20mg/g左右,單次提取的黃酮得率更低,如:18.38mg/g[4]、8.28mg/g[5]、12.91mg/g[6]。同時銀杏愈傷黃酮得率也高于銀杏外種皮,因為銀杏外種皮中總黃酮含量才12.15mg/g[11]。故利用銀杏愈傷組織生產(chǎn)黃酮具有一定的市場潛力。

本研究中,微波處理能顯著提高黃酮得率,這是因為微波處理能破壞細胞結(jié)構(gòu),同時微波處理附帶的熱效應(yīng)也能增加黃酮溶出速率[12]。但是處理時間過長,往往會導(dǎo)致黃酮得率降低[5,13],這是因為微波長時間作用后產(chǎn)生高溫,導(dǎo)致以槲皮素為甙元的黃酮甙發(fā)生了分解[14]。本實驗中,微波處理采取每處理5s水浴冷卻一次的方法進行,避免了由微波處理導(dǎo)致溫度過高而破壞黃酮,所以微波處理時間增加有利于黃酮的提取,而且沒有出現(xiàn)時間過長導(dǎo)致黃酮被破壞。

實驗中,微波處理后的水浴浸提過程效果不明顯,從簡化工藝、降低能耗的角度出發(fā),將水浴處理步驟從最終工藝中舍去。短暫的微波處理能代替長時間的水浴過程,這說明了微波提取法在銀杏愈傷組織黃酮提取中的高效性。

實驗中發(fā)現(xiàn)40%乙醇做提取劑時銀杏愈傷組織黃酮得率最高，而文獻中銀杏葉片黃酮提取需要較高的乙醇濃度,如:83%[4],63%[5]、72.95%[6]。這可能是因為愈傷組織中的黃酮糖苷親水性比葉片中的強,具體原因還有待于進一步的研究。

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Optimization of extracting conditions of flavonoids fromGingkoCallus by orthogonal experiment

LIANG Wen-hui,HUANG Xiang,LIN Li-chun,XIA Nian-yi,ZHANG Xun,PENG Chun-lin,QIU Tian,SHI Xiao-yu,DENG Xiang-yi*

(College of Food & Life Science and Technology,Chutian College Huazhong Agricultural University,Wuhan 430205,China)

UsingGinkgocallus as material,the optimization of the extraction conditions ofGinkgoflavonoids was done. Through single-factor tests,the influences of several factors on extraction rate ofGinkgoflavonoids were investigated,such as ethanol concentration,liquid-powder ratio,microwave power,microwave processing time,water bath temperature,water bath processing time,etc. Then,orthogonal test was carried out. The results of orthogonal experiment indicated that:using 40% ethanol as the extraction solvent,liquid-powder ratio 25∶1,microwave processing 60s under middle power level(528W),no water bath treatment,the extraction rate of flavonoids reached 20.92mg/g.

GingkoCallus;flavonoids;optimization of extraction conditions;orthogonal experiment;microwave process

2014-08-07

梁文惠(1987-)，女，在讀本科生，研究方向：植物細胞工程與天然活性產(chǎn)物提取。

*通訊作者:鄧祥宜(1984-)，男，碩士，講師，研究方向：植物細胞工程與天然活性產(chǎn)物提取。

國家級大學(xué)生科技創(chuàng)新項目(201314035001)；校級大學(xué)生科技創(chuàng)新項目(201201)。

TS205

B

:1002-0306(2015)09-0209-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.09.037