不同品種皺皮木瓜過氧化物酶特性的比較研究

宋雙雙,王 曉,杜金華,劉 峰,Dan Staerk,耿巖玲,崔 莉,*

(1.山東省分析測試中心,山東濟南 250014;2.山東農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院,山東泰安 271018)

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不同品種皺皮木瓜過氧化物酶特性的比較研究

宋雙雙1,2,王 曉1,杜金華2,劉 峰1,Dan Staerk1,耿巖玲1,崔 莉1,*

(1.山東省分析測試中心,山東濟南 250014;2.山東農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院,山東泰安 271018)

以不同品種的皺皮木瓜為原料,用Tris-HCl緩沖液提取過氧化物酶(POD),以愈創(chuàng)木酚-H2O2為底物,采用比色法對3個品種的皺皮木瓜POD酶學性質(zhì)進行了比較研究。結(jié)果顯示,品種YATS 066(A)、YATS153(B)、YATS251(C)的POD最適溫度分別為20、25、30℃,都在20℃以內(nèi)能較好的保持活性。三個品種的POD都有兩個最適pH,pH穩(wěn)定性范圍分別在7.5～9、3～6、3.5～7。金屬離子對A、B的影響基本相同。對三個品種的抑制能力最強的抑制劑是SDS,其次為抗壞血酸。

皺皮木瓜,過氧化物酶,酶學特性

皺皮木瓜又名湯木瓜、宣木瓜等,是薔薇科貼梗海棠[Chaenomelesspiciosa(Sweet)Nakai]的近成熟果實,主要產(chǎn)于安徽、浙江、湖北、四川等地[1],具有舒筋活絡,和胃化濕的功效[2]。由于含有多種氧化相關(guān)酶類,木瓜在生產(chǎn)加工過程中易發(fā)生褐變,嚴重的影響產(chǎn)品的感官品質(zhì)和食用價值。目前,皺皮木瓜的研究主要集中在化學成分、功能活性成分[3-5]以及揮發(fā)性成分[6]等方面,抗氧化相關(guān)酶類方面,相關(guān)報道主要有SOD酶的分離純化[7]、多酚氧化酶(PPO)的性質(zhì)研究[8]等,對于過氧化物酶(POD),僅見番木瓜中POD的純化及性質(zhì)研究[9],關(guān)于皺皮木瓜中POD的酶學特性的研究尚未見報道。

POD廣泛存在于動植物和微生物體內(nèi),是一種以血紅素為輔基的氧化酶[10],可催化由過氧化氫參與氧化各種還原劑的反應[11],是果實成熟和衰老的生理指標,催化酚類物質(zhì)、谷胱甘肽、抗壞血酸的氧化,從而參與果實酶促褐變,對果實的色澤及成分含量等造成不良影響,降低產(chǎn)品品質(zhì),因而在果實加工中需要對過氧化物酶進行防治,抑制或降低其酶活[12]。目前,對POD的純化及酶學性質(zhì)研究較廣泛,但是對于大部分原料,其不同品種間的POD酶學性質(zhì)的比較研究還較少。

本文通過研究不同品種的皺皮木瓜中POD的酶學性質(zhì),比較不同品種皺皮木瓜的POD的酶學特性差異,為進一步深入的研究POD的分子結(jié)構(gòu),進而指導生產(chǎn),提高皺皮木瓜加工產(chǎn)品的品質(zhì)等提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

不同品種皺皮木瓜由山東亞特生態(tài)技術(shù)有限公司提供,-20℃貯藏,品種及編號見表1。

表1 不同品種皺皮木瓜的編號Table1 The serial number of different cultivars of Chaenomeles

Tris、谷胱甘肽(還原型) Klontech公司,分析純;濃鹽酸、愈創(chuàng)木酚、30% H2O2、聚乙烯吡咯烷酮、Triton X-100、磷酸一氫鈉、磷酸二氫鈉、硫酸鈉、氯化鈣、六水氯化鎂、七水硫酸鋅、四水氯化錳、氯化鉀、抗壞血酸、亞硫酸鈉、DTT、Kojic acid、吐溫-80、SDS、EDTA-2Na、Tropolone 國藥集團化學試劑有限公司,分析純;石英砂、偏重亞硫酸鈉 天津市科密歐化學試劑有限公司,分析純;檸檬酸、檸檬酸鈉 天津市光復科技發(fā)展有限公司,分析純。

GENESYS 10S UV-VIS紫外可見分光光度計 Thermo公司;HH-S2數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市醫(yī)療儀器廠;Thermo Multifuge X1R離心機 Thermo公司;人工氣候箱 寧波萊?？萍加邢薰尽?/p>

1.2 實驗方法

1.2.1 粗酶液的提取 取不同品種的皺皮木瓜果肉各10.00g,以1∶1.5料液比(20mmol/L Tris-HCl緩沖液 pH7.5)低溫下研磨,研磨液4℃ 10000r/min離心20min,上清液即為所需粗酶液,于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 POD活性的測定 測定溶液體系為pH7.5、20mmol/L Tris-HCl緩沖液3mL,其中2.95mL底物含有10mmol/L愈創(chuàng)木酚和10mmol/L H2O2,0.05mL酶液。于25℃條件下測定反應20min在470nm的吸光度變化值。以每分鐘每毫升反應體系OD值改變0.01為一個酶活力單位(U)[13]。

1.2.3 酶學性質(zhì)的測定

1.2.3.1 最適溫度和溫度穩(wěn)定性 將底物分別置于4、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55℃的水浴鍋中保溫5min,加入不同品種皺皮木瓜的粗酶液,反應20min,于470nm下測定吸光度。以最適溫度的酶活性為100%,其余溫度下測定的酶活性與之的比值即為相對酶活性[5]。

不同品種皺皮木瓜的粗酶液分別保存于10、20、30、40℃,待20、40、60min取出于25℃反應20min,470nm測定酶活性[14]。以每個溫度下的初始酶活性為100%,不同時間測定的酶活性與之相比即為相對酶活性。

1.2.3.2 最適pH和pH穩(wěn)定性 測定不同品種皺皮木瓜的粗酶液在不同pH(pH3～5,檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液;pH5.5～7.5,磷酸一氫鈉-磷酸二氫鈉緩沖液;pH8～9,Tris-Hcl緩沖液)時的酶活性[15],每間隔0.5測酶活性。以最適條件下的酶活性為100%,其余pH條件下測定的酶活性與之的比值即為相對酶活性。

將不同品種皺皮木瓜的粗酶液分別在不同pH的緩沖液中4℃保存6h,于25℃反應20min,470nm測定酶活性。以最適條件下的酶活性為100%。

1.2.3.3 金屬離子的影響 分別配成終濃度為含有1、5、10mmol/L金屬離子的底物溶液,25℃條件下反應20min,測定酶活力,以不含金屬離子時的酶活力為100%,分析不同的金屬離子對POD酶活性的影響。

圖1 不同品種皺皮木瓜POD的最適溫度Fig.1 The optimum temperature of Chaenomeles peroxidase

1.2.3.4 底物濃度的影響 在25℃的條件下,分別改變愈創(chuàng)木酚和H2O2的濃度,470nm測定酶活性,采用雙倒數(shù)作圖法(Lineweaver-Burk法)[16],分別求出POD對于底物愈創(chuàng)木酚和H2O2的米氏常數(shù)。

1.2.3.5 抑制劑和表面活性劑的影響 將各種金屬離子及表面活性劑與底物混合成終濃度分別為1、5、10mmol/L的溶液,于25℃條件下反應20min,470nm測定酶活性。以不含金屬離子時的酶活性為100%。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理方法 實驗數(shù)據(jù)用DPS v3.01專業(yè)版和Excel 2003處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 POD最適溫度

溫度對酶促反應的影響很大,在最適溫度下,POD活性可以達到最大。POD活性與溫度的關(guān)系見圖1,溫度對品種B、C的影響相似,隨著溫度升高,POD活性均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,35℃以后下降較大,B的POD最適反應溫度為30℃,C的最適作用溫度為40℃,而品種A的溫度影響趨勢則不同,在低于35℃條件下酶活性均較高,之后迅速降低,最適反應溫度為25℃。

2.2 溫度穩(wěn)定性

如圖2所示,三個品種的POD在10、20℃保存60min,都能較好的保持活性,而在30℃保存60min后,品種A損失大約70%的酶活性,品種B和C損失約60%酶活性。在40℃保存20min之后,三個品種的POD均失活。可見三個品種皺皮木瓜的POD受溫度的影響均較大,穩(wěn)定性較差。

圖2 不同品種皺皮木瓜POD的溫度穩(wěn)定性Fig.2 Temperature stability of Chaenomeles peroxidase

2.3 最適pH

由圖3可以看出,每個品種的POD都有兩個最適pH,其中一個最適pH在三個品種中均為5,品種A的另一個最適pH大約在7左右,品種B的另一個最適pH為6,品種C的另一個最適pH為6.5,該性質(zhì)與番木瓜中POD的性質(zhì)相似,其最適pH也有兩個,分別為5.5和6.0[17]。

圖3 不同品種皺皮木瓜POD的最適pHFig.3 The optimum pH of Chaenomeles peroxidase

2.4 pH穩(wěn)定性

由圖4可以看出,三個品種的POD的pH穩(wěn)定性差別很大。品種A的POD的活性隨著pH的增大而逐漸增強;而B的POD活性隨pH的增大呈現(xiàn)降低趨勢,在pH9時保存6h之后,酶活性可損失60%。品種C的POD活性受pH影響不大,在酸性條件下較穩(wěn)定,略高于堿性條件下,但堿性條件下的穩(wěn)定性也高于B。

圖4 不同品種皺皮木瓜POD的pH穩(wěn)定性Fig.4 pH stability of Chaenomeles peroxidase

2.5 不同金屬離子的影響

不同金屬離子對三個品種皺皮木瓜中POD活性的影響如表2所示。金屬離子對三個品種POD活性的影響不盡相同。Ca2+對A、C的POD活性都有明顯的激活作用,在低濃度時激活作用對A顯著于C,而在1、10mmol/L時,對B起抑制作用;Mn2+則對三個品種的POD活性有較強的抑制作用,并且在10mmol/L時,三個品種間C

表2 不同金屬離子對POD活性的影響Table2 Influence of metal ions on Chaenomeles peroxidase activity

注:三個品種A、B、C之間的多重比較,a,b,c:p<0.05,字母不同表示在0.05水平上有顯著差異;A,B,C:p<0.01,字母不同表示在0.01水平上有極顯著差異。

表3 不同品種皺皮木瓜POD的米氏常數(shù)方程Table3 The Km for different cultivars of Chaenomeles peroxidase

2.6 底物濃度的影響

在同樣的反應條件下,固定愈創(chuàng)木酚的濃度,研究不同品種的POD作用于不同濃度H2O2時的反應動力學,固定H2O2濃度不變,研究不同品種的POD作用于不同濃度愈創(chuàng)木酚時的反應動力學。分別以1/[S]為橫坐標,1/V為縱坐標,采用雙倒數(shù)作圖法,所得線性方程如表3所示,擬合得到的直線相關(guān)系數(shù)均大于0.99,說明三個品種木瓜中 PPO 催化的酶褐變反應均符合米氏方程。

通過線性方程分別求得POD的Km值,Km值的大小可近似地表示酶與底物的親和力,Km值越大表示酶與底物的親和力越小,反之,Km值越小表示親和力越大。如表3所示,品種B中POD與H2O2的結(jié)合能力最強,A中的POD與愈創(chuàng)木酚的結(jié)合能力最強。

2.7 抑制劑和表面活性劑的影響

表4結(jié)果顯示抑制劑和表面活性劑均能在一定程度上抑制POD的活性,其中,SDS的抑制能力最強,在質(zhì)量體積比為0.1% 時可以完全抑制A、C中POD的活性,在0.2%時能完全抑制B的POD的活性。其余化合物的抑制能力均隨濃度的增大而增強,在濃度為10mmol/L時,大部分的化合物可以完全抑制POD的活性。

比較各種化合物對A、B、C的抑制能力,可以看出,各化合物對A的POD的抑制能力最強,而對B、C的抑制能力則相對較弱,Na2SO3、DTT、Triton X-100、吐溫-80對品種B、C的抑制力差異不顯著。其中,在三個濃度范圍內(nèi),EDTA-2Na對三個品種的POD活性的抑制能力差異顯著,在高濃度時,抑制能力依次為C

表4 抑制劑和表面活性劑對POD活性的影響Table4 Influence of inhibition dose and surfactant on peroxidase activity

注:三個品種A、B、C之間的多重比較,a,b,c:p<0.05,字母不同表示在0.05水平上有顯著差異;A,B,C:p<0.01,字母不同表示在0.01水平上有極顯著差異。3 結(jié)論與討論

品種A、B、C中POD的最適溫度分別為20、25、30℃,三個品種都在20℃以內(nèi)能較好的保持活性。三個品種的POD都有兩個最適pH,分別為5和7,5和6,5和6.5,pH穩(wěn)定性范圍分別在7.5～9,3～6,3.5～7。金屬離子對A、B的影響基本相同,而大部分的離子對C的影響不同于A和B。抑制劑對三個品種的抑制能力最強的是SDS,其次為抗壞血酸。

由不同的性質(zhì)可以看出,雖然同為皺皮木瓜,不同品種的POD酶學性質(zhì)差別還是很大,品種間差異明顯。溫度穩(wěn)定性沒有差異,都在20℃以內(nèi)能較好的保持活性。三個品種的POD都有兩個最適pH,說明皺皮木瓜中的POD可能存在兩個亞基或者存在同工酶,此問題有待于進一步研究。而A和B的POD的pH穩(wěn)定性則出現(xiàn)完全相反的趨勢,A在堿性條件下穩(wěn)定,B則在酸性條件下相對穩(wěn)定。抑制劑和表面活性劑對A、B、C的POD的影響規(guī)律基本相同,只是抑制能力不同,對B、C的抑制能力最弱。金屬離子對三個品種的皺皮木瓜POD活性均有不同的影響,鈣離子會顯著增強A、C的POD的活性,在加工和貯藏過程中應注意排除此離子,以防止木瓜品質(zhì)變化。

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Study on the characterization of POD from different cultivars ofChaenomelesspiciosa(Sweet)Nakai

SONG Shuang-shuang1,2,WANG Xiao1,DU Jin-hua2,LIU Feng1,DAN Staerk1,GENG Yan-ling1,CUI Li1,*

(1.Shandong Analysis and Test Center,Shandong Academy of Sciences,Jinan 250014,China;2.College of Food Science and Engineering,Shandong Agricultural University,Taian 271018,China)

The peroxidase was isolated fromChaenomelesspiciosa(Sweet)Nakaiby Tris-HCl buffer. With guaiacol-H2O2as substrate,the enzyme characterization of threeChaenomelesspiciosa(Sweet)Nakaicultivars was monitored by measuring the absorbance. In YATS 066(A),YATS153(B),YATS251(C),the results showed that the optimum temperature for POD activity were respectively 20,25,30℃. The POD of all cultivars could keep stabilized under 20℃. The peroxidases of three cultivars all had two optimum pH. And the pH stability range was at pH7.5～9,pH3～6,pH3.5～7. Metal ions had the same effects on the POD activity of A,B and C. The optimum inhibitor of POD activity in all threeChaenomelesspiciosa(Sweet)Nakaicultivars was SDS,and then followed by ascorbic acid.

Chaenomelesspiciosa(Sweet)Nakai;peroxidase;enzyme characterization

2014-06-30

宋雙雙(1989)，女，碩士研究生，研究方向：食品科學。

*通訊作者:崔莉(1983-)，女，博士，助理研究員，研究方向：天然產(chǎn)物資源開發(fā)。

山東省海外高層次人才資助專項資金；山東省分析測試中心科技發(fā)展基金。

TS201.2

A

:1002-0306(2015)09-0152-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.09.025