一種新的聯(lián)合檢測法在水泡狀胎塊診斷及鑒別中的作用

楊周亮 王波 徐元成 周杏元

1.浙江省永康市第一人民醫(yī)院病理科，浙江永康321300；2.浙江大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科，浙江杭州310000

一種新的聯(lián)合檢測法在水泡狀胎塊診斷及鑒別中的作用

楊周亮1王波2徐元成1周杏元1

1.浙江省永康市第一人民醫(yī)院病理科，浙江永康321300；2.浙江大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科，浙江杭州310000

目的探討一種新的聯(lián)合檢測方法在水泡狀胎塊及相關(guān)疾病的診斷及鑒別上的作用。方法回顧性分析42例HM及相關(guān)疾病經(jīng)行HER2 FISH倍體分析及P57、KI67免疫組化檢測。結(jié)果42例病例最初的形態(tài)學(xué)診斷為CHM 11例,PHM 17例和HA 14例，3名富有經(jīng)驗(yàn)病理醫(yī)師先從形態(tài)學(xué)進(jìn)行復(fù)診，后結(jié)合P57,KI67蛋白表達(dá)情況及FISH倍體分析結(jié)果，最終診斷為CHM 12例，PHM 14例，HA 16例。初診、復(fù)診與最終綜合診斷有26%（11/42）的誤診率。其中初診誤診率為14%（6/42），復(fù)診的誤診率為12%（5/42）。結(jié)論這種新的聯(lián)合方法可以對HM診斷過程中的疑難或易誤診的病例提供較好的診斷依據(jù),是一種新的診斷思路。

水泡狀胎塊；水腫性流產(chǎn)；HER2 FISH倍體分析；P57；KI67

水泡狀胎塊（hydatidiform moles，HM）是較常見的異常妊娠，根據(jù)臨床病理學(xué)特點(diǎn)可分為完全性水泡狀胎塊complete HM（CHM）和部分性水泡狀胎塊partial HM（PHM）。在病理科的日常工作中經(jīng)常要與水腫性流產(chǎn)（hydropic abortion，HA）等疾病相鑒別。目前大多數(shù)典型的病變根據(jù)組織病理學(xué)改變以及臨床特點(diǎn)可以準(zhǔn)確診斷，但隨著超聲技術(shù)的發(fā)展，使妊娠第8~12周早期異常病變被提早發(fā)現(xiàn)，然而此時的組織學(xué)改變不顯著或者相互重疊，給準(zhǔn)確的病理學(xué)診斷帶來了困難。傳統(tǒng)的細(xì)胞遺傳學(xué)核型分析和流式細(xì)胞DNA倍體分析一直是HM診斷及分類的重要輔助技術(shù)，但由于取材需要新鮮的組織，很多情況下難以提供，有時因帶有母體成分而導(dǎo)致信息錯誤，近年來更加敏感特異的熒光原位雜交技術(shù)（fluorescent in situ hybridization，F(xiàn)ISH）開始用于核型分析，HER2作為一種位于17q21.1癌基因，其FISH檢測在乳腺癌中已在國內(nèi)外廣泛應(yīng)用，其材料來源可以取自于各個醫(yī)院更為容易得到的蠟塊組織，操作技術(shù)簡便[1]。為此我們回顧性研究42例水泡狀胎塊及相關(guān)疾病的病理形態(tài)學(xué)特征，并進(jìn)行HER2 FISH倍體分析及免疫組化P57、KI67蛋白檢測，以探討新方法對上述相關(guān)疾病鑒別及診斷的價值和意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集永康市第一人民醫(yī)院2012年2月～2013年6月存檔的臨床懷疑HM的病例組織標(biāo)本42例，均經(jīng)10%中性福爾馬林固定,石蠟包埋，HE染色。最初的形態(tài)學(xué)診斷為11例CHM,17例PHM和14例HA。

1.2 方法

1.2.1 病例診斷全部病例由3名經(jīng)驗(yàn)豐富病理醫(yī)師根據(jù)WHO（2003年）組織學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，僅從形態(tài)學(xué)上對上述病例復(fù)診，達(dá)成一致的診斷,診斷前對原病理診斷均不知情。

1.2.2 HER2 FISH檢測石蠟切片3 μm厚，HER2基因擴(kuò)增試劑盒購自北京金菩嘉公司，石蠟切片經(jīng)脫蠟水化后，按照FISH操作流程進(jìn)行檢測。選取乳腺癌基因擴(kuò)增病例作為陽性對照，在熒光顯微鏡下主要觀察細(xì)胞滋養(yǎng)葉細(xì)胞核中紅/綠色熒光信號的分布特點(diǎn)，信號偏弱或缺失的病例重新再做。結(jié)果判定[2]：計(jì)數(shù)50個細(xì)胞，紅或綠熒光信號顯示3或4個的細(xì)胞數(shù)超過10%，則被定義為三倍體或四倍體。

1.2.3 免疫組織化學(xué)染色P57、KI67試劑盒購自上海太陽生物制劑公司，所有標(biāo)本均經(jīng)過10%福爾馬林固定、常規(guī)脫水、石蠟包埋、4 μm切片，采用免疫組化（EnVision兩步法），結(jié)果判定：P57蛋白陽性定位于細(xì)胞核，呈棕色顆粒，觀察細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞和絨毛間質(zhì)細(xì)胞核表達(dá)情況。陽性細(xì)胞數(shù)<10%，為陰性；陽性細(xì)胞數(shù)在10%～30%之間為陽性；陽性細(xì)胞數(shù)>30%，為強(qiáng)陽性[3]。以蛻膜及絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞核P57蛋白陽性表達(dá)作為陽性內(nèi)對照。僅有絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)，則不能認(rèn)定為陽性。國外有研究發(fā)現(xiàn)P57表達(dá)很有特點(diǎn)，對于大多數(shù)病例P57表達(dá)在細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞和絨毛間質(zhì)細(xì)胞中呈彌漫陽性，或陰性，所以可以不用計(jì)數(shù)評估陽性率，顯微鏡下觀察就可快速評估[4]。KI67陽性定位于細(xì)胞核，呈棕色顆粒，主要表達(dá)在細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞和部分絨毛間質(zhì)細(xì)胞，合體滋養(yǎng)葉細(xì)胞幾乎不表達(dá)。平均每張切片計(jì)數(shù)100個細(xì)胞，陰性：陽性細(xì)胞數(shù)為0；+陽性細(xì)胞數(shù)≤25%；++陽性細(xì)胞數(shù)26%～50%；+++陽性細(xì)胞數(shù)＞50%[5]。

1.2.4 綜合分析結(jié)合P57及KI67免疫組化以及HER2 FISH分析結(jié)果重新評估對所有病例做出綜合診斷。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS18.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料采用Fisher精確檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE切片形態(tài)學(xué)復(fù)診結(jié)果

12例CHM，15例PHM，15例HA。與初診相比，有11例診斷不同。

2.2 FISH檢測

共42例，有3例信號無法獲取。39例成功病例中12例三倍體，其余全是二倍體，沒有發(fā)現(xiàn)四倍體。

2.3 42例病例P57檢測結(jié)果

（圖1、2、3）10例陰性，32例陽性病例中2例陽性范圍在10%～30%，其余均呈彌漫陽性>30%，KI67結(jié)果強(qiáng)陽性（+++）8例，陽性（++）15例，弱陽性（+）19例。

圖1 PHM中P57染色細(xì)胞滋養(yǎng)葉細(xì)胞及絨毛間質(zhì)細(xì)胞（+）

圖2 HA中P57染色細(xì)胞滋養(yǎng)葉細(xì)胞及絨毛間質(zhì)細(xì)胞（+），對照游離滋養(yǎng)葉細(xì)胞團(tuán)（+）

圖3 CHM中P57染色細(xì)胞滋養(yǎng)葉細(xì)胞及絨毛間質(zhì)細(xì)胞（-），對照蛻膜細(xì)胞（+）

表142 例患者KI67、P57蛋白表達(dá)情況及FISH檢測結(jié)果

2.4 綜合分析

結(jié)合P57、KI67免疫組化及HER2 FISH分析結(jié)果重新評估對所有病例做出綜合診斷（見表1）。42例病例最終診斷為12例CHM，14例PHM和16例HA。初診、復(fù)診與最終綜合診斷仍有26%（11/42）的誤診率。其中初診誤診率為14%（6/42），復(fù)診的誤診率為12%（5/42）。這些差異中除1例初診時診斷為HA，最終修正為CHM外，其余10例的差異主要是PHM和HA兩組之間。

3 討論

水泡狀胎塊和水腫性流產(chǎn)鑒別與診斷在實(shí)際工作中對臨床治療以及預(yù)后有重要的實(shí)際意義，在病理科的日常工作中也是一個難點(diǎn)[4]。目前HM診斷和分型主要以臨床表現(xiàn)與組織學(xué)特點(diǎn)為判斷標(biāo)準(zhǔn)，組織病理學(xué)診斷在很多情況下帶有一定的個人主觀性，不同醫(yī)師的診斷水平以及經(jīng)驗(yàn)都有差別，可重復(fù)性差。國外Benjamin R等[6]的一組66例病變的資料報道，初診與復(fù)診有19例不同，誤診率為29%。我們的實(shí)驗(yàn)中初診和復(fù)診都是形態(tài)學(xué)診斷，兩次診斷之間有26%的差錯率，與最終綜合診斷的誤差率分別為14%和12%。這種錯誤和延遲診斷可能會對婦女造成嚴(yán)重的后果，而過度診斷也會導(dǎo)致患者焦慮擔(dān)心和不必要的花費(fèi)，所以有必要尋求一些新的技術(shù)來提高對早期妊娠期HM以及相關(guān)病變的診斷和分類的認(rèn)識，減少誤診。

FISH方法應(yīng)用于HM是基于這幾年學(xué)術(shù)界普遍認(rèn)可的HM發(fā)生的遺傳學(xué)基礎(chǔ)[7]，CHM是與母系無關(guān)的二倍體核型，而PHM是三倍體，其中一倍體源于母系，一般的HA則擁有屬于父系和母系的二倍體核型。FISH方法目前在乳腺癌HER2基因擴(kuò)增上應(yīng)用較廣泛，操作簡便嫻熟，實(shí)驗(yàn)環(huán)境也相對穩(wěn)定。HER2基因擴(kuò)增試劑有HER2位點(diǎn)和17號染色體著絲粒探針信號，熒光免疫標(biāo)記出現(xiàn)兩個紅/綠色信號，就可以判定為二倍體，相應(yīng)的三、四個信號就可以判定為四倍體。

本次研究發(fā)現(xiàn)有2例最終診斷結(jié)果為PHM的病例FISH檢測結(jié)果顯示為二倍體，分析原因可能是收集信號時收集的是蛻膜組織而不是絨毛組織，應(yīng)該在雜交試驗(yàn)前將富于絨毛的區(qū)域圈起來，但是在很多情況下我們?nèi)〔乃玫降慕M織是蛻膜和絨毛混在一起。當(dāng)組織切片上的信號不一致的時候，應(yīng)該收集信號比較多且比較強(qiáng)的區(qū)域。還有一種解釋[8]就是切片僅僅只是細(xì)胞一個平面，而細(xì)胞本身是一立體結(jié)構(gòu)，細(xì)胞核染色體未完全暴露。

P57基因?yàn)楦冈葱曰蛴≯E，母源性基因表達(dá)，是細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子（cyclin-dependent kinases inhibitors，CDK I）的一員，參與細(xì)胞周期調(diào)控、促進(jìn)凋亡、誘導(dǎo)分化[9]。CHM為空卵受精，只有父系基因而無母系基因，故不表達(dá)P57。PHM是由一個母系和兩個父系單體基因構(gòu)成的三倍體，可表達(dá)P57。HA是正常二倍體核型，亦可表達(dá)P57。目前國內(nèi)外報道[2，9，10]的文獻(xiàn)來看，P57在HM相關(guān)疾病的鑒別上有一定的價值，我們的實(shí)驗(yàn)也支持這一觀點(diǎn)。本次實(shí)驗(yàn)中一病例在初診時被診斷為HA，這例患者停經(jīng)49 d來院就診，HCG水平不高，大體取材時顯示片狀蛻膜上有7 mm范圍的孕囊泡，HE特點(diǎn)顯示只有數(shù)個部分絨毛組織，個別有水腫中央池可見，灶性區(qū)滋養(yǎng)葉細(xì)胞略有增生，絨毛間質(zhì)黏液變性明顯。形態(tài)學(xué)上確實(shí)很難區(qū)分到底是HM還是HA，這時P57蛋白染色可以輔助診斷。然而還是有個別病例P57染色結(jié)果與最終診斷結(jié)果有出入，CHM中P57蛋白有表達(dá)，可能的解釋有兩種：一是P57基因?qū)儆诓煌耆≯E基因，主要表達(dá)在母系等位基因，但父系等位基因也會有少量表達(dá)[11]。另一種解釋有些病例可能是一種家族性的常染色體隱性遺傳疾病[12，13]。

從目前的研究來看，PHM和HA的鑒別還是有難度的，因?yàn)榇蟛糠值淖罱K診斷差異集中在這二者中，這時KI67[14]抗原作為一種判斷細(xì)胞增值活性的標(biāo)記物就具有鑒別提示意義，因?yàn)镠A是屬于退行性改變，滋養(yǎng)葉細(xì)胞增生一般不明顯，而PHM通常伴有滋養(yǎng)葉細(xì)胞增生的表現(xiàn)。本次研究表明KI67抗原在PHM表達(dá)水平比HA中高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

因此一般情況下對于多數(shù)病例倍體分析結(jié)果可以幫助我們鑒別出PHM，但不能夠鑒別CHM和HA，P57免疫組化檢測結(jié)果在很大程度上解決了這個問題，二者聯(lián)合診斷可以使一些妊娠第一個三月內(nèi)的異常病變，尤其是形態(tài)學(xué)上很難做出鑒別的病變得到確診。然而還是存在少數(shù)病例診斷有困難，這時可以加上輔助標(biāo)記物KI67、P53[15]等。由此看來今后在HM及相關(guān)疾病的臨床病理診斷上我們可以嘗試按照如圖4所示的診斷思路來進(jìn)行。

圖4 HM及相關(guān)疾病臨床病理診斷步驟

[1]楊月紅，袁靜萍，文登虎.乳腺癌石蠟組織FISH檢測預(yù)處理方法[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2013，29（1）：105-106

[2]LeGallo RD，Stelow EB，Ramirez NC，et al.Diagnosis of hydatidiform moles using p57 immunohistochemistry and HER2 fluorescent in situhybridization[J].Am J Clin Pathol，2008，129（5）：749-755.

[3]Kuang-Hua Chen，Sheng-Chi Hsu，Hou-Yu Chen.Utility of fluorescence in situ hybridization for ploidy and p57 immunostaining in discriminating hydatidiform moles[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications，2014，446（2）：555-560

[4]Thomas G，McConnell MD，Kathleen M，et al.Diagnosis and subclassification of hydatidiform moles using p57 immunohistochemistry and molecular genotyping[J].Am J Surg Pathol，2009，33（6）：805-817.

[5]Fatemeh Atabaki Pasdar，Alireza Fazel.Ki-67 expression in hydatidiform moles and hydropic abortions[J].Iranian Red Crescent Medical Journal，2013，15（7）：590-594.

[6]Benjamin R，Ketterling MD，Oberg TN，et al.Comparison of fluorescence in situ hybridization，p57 immunostaining，flow cytometry，and digital image analysis for diagnosing molar and nonmolar products of conception[J].Am J Clin Pathol，2010，133（2）：196-204.

[7]回允中主譯.婦產(chǎn)科診斷病理學(xué)[M].北京：北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社，2007：1023-1026.

[8]Joseph M，Letizia S，Berger E，et al.Assessment of Her-2/ neu expression in hydatidiform moles for prediction of subsequent gestational trophoblastic neoplasia[J].Gynecologic Oncology，2007，104（3）：675-679.

[9]陳云新，沈丹華，顧以群，等.P57和P53蛋白在水腫性流產(chǎn)及葡萄胎鑒別診斷中的作用[J].中華病理學(xué)雜志，2011，40（10）：694-697.

[10]張燕，王一，王建華.幾種蛋白檢測在水泡狀胎塊病理診斷與分型中的價值[J].中國婦幼保健，2014，（29）：2446-2449.

[11]Russell V，MD Mamta G.Diagnostic reproducibility of hydatidiform moles：Ancillary techniques（p57 Immunohistochemistry and molecular genotyping）improve morphologic diagnosis[J].Surg Pathol，2012，36（3）：443-453.

[12]Natalia B，Pei Hui.New diagnostic modalities in the histopathological diagnosis of hydatidiform moles[J].Diagnostic Histopathology，2012：201-209.

[13]Dixon Ph，Tronqwongsa P，Abu-Hawah S，et al.Mutations in NLRP7 are associated with diploid biparental hydatidiform moles，but not androgenetic complete moles[J].J Med Genet，2012，49（3）：206-211.

[14]鐘萍萍，顧以群，孫云飛，等.p57、p53和ki67蛋白在葡萄胎診斷中的價值[J].診斷病理學(xué)雜志，2014，21（6）：391-394.

[15]陳昊斌，孫昆昆，戴琳，等.水泡狀胎塊中p57、p53及KI67的表達(dá)及意義[J].中國性科學(xué)，2014，23（4）：26-30.

A new kind of combined method appling in hydatidiform moles disease diagnosis and identification

YANG Zhouliang1WANG Bo2XU Yuancheng1ZHOU Xingyuan1
1.Department of Pathology,the First People's Hospital of Yongkang City in Zhejiang Province,Yongkang321300, China;2.Department of Pathology,the First Affiliated Hospital of Zhejiang University,Hangzhou310000,China

Objective To attempt a new combined method applying in hydatidiform moles(HM)and related disease diagnosis and identification.Methods A diagnosis and differentiate of 42 cases of HM and related disease through immunohistochemical test of P57 and KI67 and HER2 FISH ploidy were retrospectively analyzed.Results The original morphologic diagnosis of the 42 cases included 11 complete HMs(CHM),17 partial HMs(PHM),and 14 hydropic abortion(HA).Three experienced pathologists did secondary diagnosis from morphology.After combining P57,KI67 protein expression and FISH ploidy analysis results,the pathologists determined the final diagnosis including 12 CHM cases,14 PHM cases and 16 HA cases.There was disagreement between the original,secondary and final diagnosis,the misdiagnosis rate was 26%(11/42).The original and final diagnosis had 6 different cases,the misdiagnosis rate was 14%(6/42), the second misdiagnosis rate was 12%(5/42).Conclusion The new combined method may be useful ancillary studies to aid in the diagnosis and classification of HMs,especially to the difficult or easy to be misdiagnosed cases.The method is a new thought of diagnosis.

Hydatidiform moles（HM）；Hydropic abortion(HA)；HER2 FISH ploidy analysis；P57；KI67

R737.33

B

1673-9701（2015）24-0080-04

2015-03-26）

浙江省永康市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012-35）