高壓脈沖電場(chǎng)輔助提取牛脊髓中的糖脂類物質(zhì)

鮑妮娜，高貴珍，單玲玲，于蓓蓓，王曉慧

1.宿州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，安徽宿州，234000；2.即墨市食品藥品監(jiān)督管理局，山東青島，266200；3.東方海洋科技股份有限公司，山東煙臺(tái)，264003

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高壓脈沖電場(chǎng)輔助提取牛脊髓中的糖脂類物質(zhì)

鮑妮娜1，高貴珍1，單玲玲1，于蓓蓓2，王曉慧3

1.宿州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，安徽宿州，234000；2.即墨市食品藥品監(jiān)督管理局，山東青島，266200；3.東方海洋科技股份有限公司，山東煙臺(tái)，264003

采用響應(yīng)面法，對(duì)牛脊髓中糖脂類物質(zhì)的提取進(jìn)行優(yōu)化。對(duì)電場(chǎng)強(qiáng)度、脈沖數(shù)和液料比進(jìn)行了單因素考察，建立了一個(gè)3水平的優(yōu)化設(shè)計(jì)。根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化和二次回歸方程分析得到糖脂類物質(zhì)提取的優(yōu)化條件為：電場(chǎng)強(qiáng)度19.7kV/cm，脈沖數(shù)為9.1，液料比為11。在此優(yōu)化條件下，得到的糖脂類物質(zhì)的質(zhì)量為0.318g/5g牛脊髓，與預(yù)測(cè)值0.319g/5g牛脊髓相符，說(shuō)明所建立的模型的模擬值可以采納。同時(shí)，比較了高壓脈沖電場(chǎng)輔助溶劑提取技術(shù)與傳統(tǒng)的提取方法(加熱提取、超聲波提取)在提取牛脊髓中糖脂類物質(zhì)的作用效果。結(jié)果表明，高壓脈沖電場(chǎng)輔助溶劑法提取糖脂類物質(zhì)的效果更佳，它不僅能耗少且作用時(shí)間短。

糖脂類；高壓脈沖電場(chǎng)；牛脊髓；響應(yīng)面

目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)牛脊髓的研究有以下幾個(gè)方面，如牛脊髓中的可溶性酸性蛋白[1]、牛髓鞘堿性蛋白[2]、牛脊髓前角勻漿的作用機(jī)制[3]、致腦炎病毒[4]、內(nèi)源性腦啡肽降解酶抑制劑[5]等，卻鮮見(jiàn)對(duì)牛脊髓中糖脂類物質(zhì)的報(bào)道。

糖脂類物質(zhì)屬于脂類物質(zhì)，傳統(tǒng)的提取脂類物質(zhì)的方法一般采用有機(jī)溶劑進(jìn)行提取，如氯仿-甲醇法等，但有機(jī)溶劑提取法對(duì)環(huán)境污染嚴(yán)重，產(chǎn)品毒性大。也有采用超聲波輔助溶劑提取法和超臨界流體萃取[6-10]等方法，鮮有利用高壓脈沖電場(chǎng)輔助提取脂類物質(zhì)的報(bào)道[11-14]，利用高壓脈沖電場(chǎng)提取牛脊髓中的糖脂類物質(zhì)，國(guó)內(nèi)外沒(méi)有相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道。

本文的主要內(nèi)容是考察不同的提取方法(常溫提取、超聲波輔助溶劑提取法、高壓脈沖電場(chǎng)輔助提取法)對(duì)牛脊髓中的糖脂類物質(zhì)提取的影響，分析比較三種提取方法在提取牛脊髓糖脂類物質(zhì)中的不同的作用效果。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 材料與儀器

牛脊髓(長(zhǎng)春市皓月集團(tuán))，石油醚、丙酮、氯仿、甲醇、硫酸、乙醇、間苯二酚、鹽酸等試劑均為分析純。薄層層析板(浙江省臺(tái)州市路橋四甲生化塑料廠)、高效薄層層析板(青島化工公司)。

高壓脈沖電場(chǎng)提取裝置LDT-200，專利產(chǎn)品[15]；超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(昆山市超聲儀器有限公司)；高速冷凍離心機(jī)(D-37520O型，sterodeKendroLaboratoryProducts)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(RE-52AA型，上海雅榮生化儀器設(shè)備有限公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 傳統(tǒng)的提取方法

牛脊髓切塊稱重，取5g左右，加入一定量的4℃的90%的乙醇溶液，于粉碎機(jī)中粉碎1min。分別采用超聲波輔助溶劑提取和常溫提取的方法提取糖脂類物質(zhì)。

1.2.2 高壓脈沖電場(chǎng)輔助有機(jī)溶劑提取

處理同1.2.1，將粉碎后得到的混合液攪拌均勻，在室溫條件下，立即將溶液通入高壓脈沖電場(chǎng)處理裝置，在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下以不同的脈沖數(shù)處理。

1.2.3 響應(yīng)面(Box-Behnken)試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以液料比、電場(chǎng)強(qiáng)度、脈沖數(shù)作為影響牛脊髓中糖脂類物質(zhì)的主要因素。將這3個(gè)因素作為自變量X1、X2、X3，每個(gè)因素設(shè)置3個(gè)水平，以-1、0、+1進(jìn)行水平編碼。牛脊髓中糖脂類物質(zhì)的響應(yīng)值如式(1)所示。

(1)

式中，Yi為牛脊髓中糖脂類物質(zhì)對(duì)應(yīng)的峰面積；β0，βi，βii及βij分別為方程的一次項(xiàng)，二次項(xiàng)及交互項(xiàng)系數(shù)；Xi、Xj為因素自變量。

經(jīng)過(guò)單因素試驗(yàn)選取自變量取值范圍，因素水平編碼如表1所示。據(jù)此進(jìn)行中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，每組試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值，并采用Design-Expert軟件進(jìn)行回歸模型分析。

1.2.4 腦苷脂類和神經(jīng)節(jié)苷脂類物質(zhì)的初步鑒定

提取得到的牛脊髓濃縮物加入一定量的石油醚，離心，得到的沉淀物即為粗腦苷脂，上清液減壓真空濃縮，濃縮液中加入一定量的丙酮，離心，得到的沉淀物即為粗神經(jīng)節(jié)苷脂。粗腦苷脂點(diǎn)樣到薄層層析板上，用三氯甲烷/甲醇/水為10∶1∶0.2展開(kāi)劑展開(kāi)后，用5%的乙醇硫酸溶液噴射，在110℃下加熱5min，出現(xiàn)黃褐色的印跡。粗神經(jīng)節(jié)苷脂點(diǎn)樣并經(jīng)展開(kāi)劑氯仿/甲醇/0.2%氯化鈣展開(kāi)后噴射間苯二酚-鹽酸溶液，然后置于110℃的環(huán)境中加熱5min，出現(xiàn)紫紅色的印跡。

表1 因素水平編碼表

2 結(jié)果與討論

2.1 電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)牛脊髓中糖脂類物質(zhì)的影響

糖脂類物質(zhì)的量隨著電場(chǎng)強(qiáng)度的增加而增加，當(dāng)其電場(chǎng)強(qiáng)度達(dá)到20 kV/cm后，提取得到的糖脂類的量基本平穩(wěn)，此時(shí)的糖脂類物質(zhì)的提取量為0.14 g/5g牛脊髓。由圖1可以看出，糖脂類物質(zhì)所占濃縮物的比例隨著電場(chǎng)強(qiáng)度的增加先增加后減少，當(dāng)電場(chǎng)強(qiáng)度為20 kV/cm時(shí)，糖脂類物質(zhì)所占的比例達(dá)到最高值為93.33%，在20～25 kV/cm之間，所占比例基本保持了平衡，后又隨之減少。因此選擇電場(chǎng)強(qiáng)度為20 kV/cm，作為最佳的試驗(yàn)條件。

圖1 電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)牛脊髓中糖脂類物質(zhì)的影響

2.2 脈沖數(shù)對(duì)牛脊髓中糖脂類物質(zhì)的影響

牛脊髓中糖脂類物質(zhì)的質(zhì)量隨著脈沖數(shù)的增加而增加，當(dāng)脈沖數(shù)為10時(shí)，達(dá)到最大量為0.16 g/5g牛脊髓，這表示可以繼續(xù)加大脈沖數(shù)，也即可以延長(zhǎng)作用時(shí)間。由圖2可以看出，牛脊髓中糖脂類物質(zhì)占濃縮物的比例隨著脈沖數(shù)的增加而增加，當(dāng)脈沖數(shù)為8時(shí)，其所占比例明顯增大；當(dāng)脈沖數(shù)為10時(shí)，其所占比例較之脈沖數(shù)為8時(shí)略有增加，但幅度較少。因此，選擇脈沖數(shù)為10時(shí)作為提取牛脊髓中糖脂類物質(zhì)的條件。

圖2 脈沖數(shù)對(duì)牛脊髓中糖脂類物質(zhì)的影響

2.3 液料比對(duì)牛脊髓中糖脂類物質(zhì)的影響

牛脊髓中的糖脂類物質(zhì)隨著液料比的增加而增加，當(dāng)液料比為7時(shí)，糖脂類物質(zhì)的質(zhì)量為0.26 g/5g牛脊髓，繼續(xù)加入溶劑，得到的糖脂類物質(zhì)的質(zhì)量變化不大。由圖3可以看出，隨著液料比的增加，牛脊髓中糖脂類物質(zhì)所占濃縮物的比例先增加后減少，當(dāng)液料比為7時(shí)，所占的比例最大。因此選擇料液比為7時(shí)作為提取牛脊髓中糖脂類物質(zhì)的條件。

圖3 液料比對(duì)牛脊髓中糖脂類物質(zhì)的影響

2.4 Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)與結(jié)果

響應(yīng)面優(yōu)化比傳統(tǒng)的優(yōu)化有很多的優(yōu)點(diǎn)，如節(jié)省時(shí)間、空間和原材料等。本試驗(yàn)設(shè)計(jì)了17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，其中12個(gè)析因點(diǎn)，包含5個(gè)零點(diǎn)試驗(yàn)。試驗(yàn)方案與結(jié)果如表2所示。

表2 牛脊髓中糖脂類物質(zhì)重量的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值

(續(xù)表)

2.5 二次回歸模型建立與方差分析

對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)式回歸分析，建立二次響應(yīng)回歸模型，擬合得到二次回歸方程，如式(2)所示，并對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析，如表3所示。

R1=+0.22+6.250×10-3X1+0.015X2+0.019X3-7.500×10-3X1X3+0.030X2X3-0.037X12-0.025X22+0.058X32

(2)

上述二次回歸模型方程的回歸系數(shù)R2=0.990 0，模型的F值為76.74，說(shuō)明此分析是顯著的。從回歸模型的方差分析結(jié)果可以看出(表3)，所建立的模型能很好地反映試驗(yàn)數(shù)據(jù)，回歸方程的擬合度較好，試驗(yàn)誤差小?；诨貧w方程的因素顯著性分析，在顯著水平為P<0.01條件下，模型中的一次項(xiàng)脈沖數(shù)X2(P=0.0004)、液料比X3(P<0.0001)，二次項(xiàng)X12、X22和X32，交互項(xiàng)行X2X3均表現(xiàn)極顯著；在顯著水平為P<0.05條件下，一次項(xiàng)X1，表現(xiàn)顯著；其他則表現(xiàn)不顯著。模型的失擬項(xiàng)P=0.9442>0.05，表明失擬不顯著，即該模型是穩(wěn)定的，能較好地預(yù)測(cè)不同因素組合處理后牛脊髓中糖脂類物質(zhì)質(zhì)量的變化情況。因此，可以采用此模型對(duì)牛脊髓中糖脂類物質(zhì)質(zhì)量進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

表3 回歸模型的方差分析

2.6 響應(yīng)面和等高線圖

圖4 電場(chǎng)強(qiáng)度和脈沖數(shù)的交互作用對(duì)牛脊髓中糖脂類物質(zhì)提取的影響

利用Design-Expert 7.0軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，研究參數(shù)及其交互作用對(duì)牛脊髓中糖脂類物質(zhì)提取的影響。三維響應(yīng)面和二維等高線圖顯示反應(yīng)和每個(gè)變量的實(shí)驗(yàn)水平之間的交互作用。如圖4所示，當(dāng)液料比保持在零水平時(shí)，電場(chǎng)強(qiáng)度和脈沖數(shù)對(duì)牛脊髓中糖脂類物質(zhì)提取的交互作用。如圖5所示，當(dāng)電場(chǎng)強(qiáng)度保持在零水平，脈沖數(shù)和液料比對(duì)牛脊髓中糖脂類物質(zhì)提取的交互作用。圖6表明，當(dāng)脈沖數(shù)保持在零水平時(shí)，電場(chǎng)強(qiáng)度和液料比對(duì)牛脊髓中糖脂類物質(zhì)提取的交互作用。通過(guò)分析，牛脊髓中糖脂類物質(zhì)最大的提取條件為：電場(chǎng)強(qiáng)度為19.7 kV/cm，脈沖數(shù)為9.1，液料比為11。依照此優(yōu)化條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，重復(fù)3次，平均值為0.318g/5g牛脊髓。試驗(yàn)結(jié)果與模型優(yōu)化模擬結(jié)果基本一致，說(shuō)明模型可靠性較高，能較好地預(yù)測(cè)實(shí)際情況。因此可以得出結(jié)論，模型是可用的，并且其優(yōu)化了提取條件。

圖5 脈沖數(shù)和料液比的交互作用對(duì)牛脊髓中糖脂類物質(zhì)提取的影響

圖6 電場(chǎng)強(qiáng)度和液料比交互作用對(duì)牛脊髓中糖脂類物質(zhì)提取的影響

圖4為電場(chǎng)強(qiáng)度和脈沖數(shù)的交互作用圖，由圖可以看出，隨著電場(chǎng)強(qiáng)度和脈沖數(shù)的增加，牛脊髓中糖脂類物質(zhì)的質(zhì)量快速增加，但在場(chǎng)強(qiáng)達(dá)到20 kV/cm以后，所提取的物質(zhì)的量呈現(xiàn)快速下降的趨勢(shì)，這極有可能是因?yàn)閳?chǎng)強(qiáng)的增加影響了其中物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，因此導(dǎo)致其提取率下降[16-17]。此外，牛脊髓中糖脂類物質(zhì)隨脈沖數(shù)的增加也先出現(xiàn)了快速的上升，后又呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，脈沖數(shù)的大小反映了高壓脈沖電場(chǎng)的作用長(zhǎng)短[18-19]，這可能是由于作用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致其中物質(zhì)的變化，從而影響了牛脊髓中糖脂類物質(zhì)的提取。圖5為脈沖數(shù)和液料比的交互作用圖，由圖可以看出，牛脊髓中糖脂類物質(zhì)的質(zhì)量隨著脈沖數(shù)的增加先增加后又減少，可以看出電場(chǎng)作用時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)將影響糖脂類物質(zhì)的提取。同樣的，牛脊髓中糖脂類物質(zhì)的質(zhì)量隨著液料比的增加先減少后迅速上升，說(shuō)明液料比的增加，增加了電場(chǎng)的導(dǎo)電性，從而使提取的糖脂類物質(zhì)的質(zhì)量明顯增加。圖6為場(chǎng)強(qiáng)度和液料比的交互作用圖，由圖可以看出，二者之間的交互作用比較明顯，所提取的牛脊髓糖脂類物質(zhì)先隨著強(qiáng)度的增加而增加，后又表現(xiàn)出減少的趨勢(shì)；牛脊髓中糖脂類物質(zhì)的質(zhì)量先隨著液料比的增加而減少，后又快速的上升，說(shuō)明隨料液比的增加使電場(chǎng)的導(dǎo)電性能增加，從而加強(qiáng)對(duì)牛脊髓的作用效果，糖脂類物質(zhì)增多。

2.7 高壓脈沖電場(chǎng)和傳統(tǒng)提取方法的比較

為了更好地比較高壓脈沖電場(chǎng)和傳統(tǒng)的提取方法在提取牛脊髓中糖脂類物質(zhì)中的作用，所有的實(shí)驗(yàn)用牛脊髓材料均購(gòu)于皓月集團(tuán)。表4所示為高壓脈沖電場(chǎng)與傳統(tǒng)提取方法在牛脊髓糖脂類物質(zhì)提取中的比較，由表可以看出，雖然高壓脈沖電場(chǎng)的作用時(shí)間只有6 μs，但是提取所得到的牛脊髓糖脂類物質(zhì)的質(zhì)量明顯多于加熱3 h和超聲波作用1 h的提取量。高壓脈沖電場(chǎng)輔助溶劑法得到的糖脂類物質(zhì)的量比加熱提取和超聲波提取的分別高1.74和1.25倍，效果明顯。此外，高壓脈沖電場(chǎng)與傳統(tǒng)的提取方法比還具有非加熱的性能，可以避免加熱帶來(lái)的不良的影響，同時(shí)還可以節(jié)省能源[20]。

表4 高壓脈沖電場(chǎng)和傳統(tǒng)提取方法的比較

3 結(jié) 論

本文采用響應(yīng)面法，對(duì)牛脊髓中糖脂類物質(zhì)的提取進(jìn)行了優(yōu)化。對(duì)電場(chǎng)強(qiáng)度、脈沖數(shù)和液料比進(jìn)行了單因素考察，建立了一個(gè)3水平的優(yōu)化設(shè)計(jì)。結(jié)果表明，響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)對(duì)牛脊髓中糖脂類物質(zhì)的提取是可行的。根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化和二次回歸方程分析得到糖脂類物質(zhì)提取的優(yōu)化條件為：電場(chǎng)強(qiáng)度19.7 kV/cm，脈沖數(shù)為9.1，液料比為11。在此優(yōu)化條件下，得到的糖脂類物質(zhì)的質(zhì)量為0.318 g/5g牛脊髓，與預(yù)測(cè)值0.319 g/5g牛脊髓相符，這足以說(shuō)明所建立的模型的模擬值是可以采納的。同時(shí)，比較了高壓脈沖電場(chǎng)輔助溶劑提取技術(shù)與傳統(tǒng)的提取方法(加熱提取、超聲波提取)在提取牛脊髓中糖脂類物質(zhì)的作用效果，結(jié)果表明，高壓脈沖電場(chǎng)輔助溶劑法提取糖脂類物質(zhì)的效果更佳，它不僅能耗少且作用時(shí)間短。

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(責(zé)任編輯：汪材印)

Extracting glycolipids in bovine spinal cord using PEF-assisted organic solvent

BAO Nina1，GAO Guizhen1，SHAN Lingling1，YU Beibei2，WANG Xiaohui3

1.School of Biological and Food Engineering,Suzhou University,Suzhou 234000,China 2.Jimo food and drug administration,Qingdao,266200；3.East ocean science and technology co.,Yantai,264003

In this paper the extraction of glycolipids (cerebroside and ganglioside) in bovine spinal cord was investigated using response surface methodology (RSM).The quantitative effects of field strength,pulse numbers,ratio of liquid to raw material,and a three-level Box-Behnken design which was based on the results of a single-factor test was employed to optimize the parameters for extraction of glycolipid.By solving the regression equation and also by analyzing the response surface contour plots,the optimal glycolipid extraction conditions were determined: field strength 19.7kV/cm,pulse numbers 9.1 and ratio of liquid to raw material 11,and the weight of glycopilid extraction was 0.318g per 5g bovine spinal cord.And the extraction of glycolipid by HIPEF is better than other traditional technologies.

Glycolipids; HIPEF; Bovine spinal cord; RSM

2015-10-19

鮑妮娜(1984-)，女，山東煙臺(tái)人，博士，講師，主要研究方向：天然產(chǎn)物提取與開(kāi)發(fā)。

R284.2

：A

：1673-2006(2015)12-0115-05

10.3969/j.issn.1673-2006.2015.12.031