酰化和酶法修飾后牦牛乳酪蛋白熱穩(wěn)定性變化

楊繼濤,楊 敏,2,*,張 媛,楊 晰

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院,甘肅蘭州 730070；2.甘肅省功能乳品工程實(shí)驗(yàn)室,甘肅蘭州 730070)

?

?；兔阜ㄐ揎椇箨笈Ｈ槔业鞍谉岱€(wěn)定性變化

楊繼濤1,楊 敏1,2,*,張 媛1,楊 晰1

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院,甘肅蘭州 730070；2.甘肅省功能乳品工程實(shí)驗(yàn)室,甘肅蘭州 730070)

采用?；噭┖娃D(zhuǎn)谷氨酰胺酶(TG)對牦牛乳中的酪蛋白進(jìn)行改性,并對改性后的酪蛋白進(jìn)行熱穩(wěn)定性研究,通過在280nm處測定吸光度值來評價(jià)酪蛋白熱穩(wěn)定性。結(jié)果表明,酪蛋白經(jīng)TG交聯(lián)后熱穩(wěn)定性提高。采用不同?；噭┬揎椇?牦牛乳酪蛋白熱穩(wěn)定性增強(qiáng),不同改性修飾的酪蛋白熱穩(wěn)定性差異較大,琥珀酸酐修飾酪蛋白熱穩(wěn)定性最強(qiáng)。結(jié)果可為牦牛乳酪蛋白修飾和產(chǎn)品開發(fā)及利用提供參考依據(jù)。

牦牛乳酪蛋白,熱穩(wěn)定性,?；揎?交聯(lián)修飾,谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶

酪蛋白是牛乳中最豐富的蛋白質(zhì),是食品及化學(xué)工業(yè)重要的蛋白質(zhì)原料。酪蛋白具有良好的功能性質(zhì),如乳化性、發(fā)泡性等,因而在食品及非食品工業(yè)中具有廣泛用途[1-2]。在蛋白質(zhì)的工業(yè)加工過程中,熱處理是最常用的操作,這要求蛋白質(zhì)原料具有較高的熱穩(wěn)定性[3]。影響酪蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的因素很多,其中外部因素主要有體系pH、溫度等,內(nèi)部因素主要為蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)[4-5]。

牦牛乳酪蛋白是青藏高原地區(qū)的特色資源,在我國干酪素產(chǎn)業(yè)中占有較高市場份額。然而,由于牦牛乳酪蛋白初加工工藝未經(jīng)嚴(yán)格控制,加工中嚴(yán)重破壞了酪蛋白的天然結(jié)構(gòu),致使其功能性質(zhì)變差[1]。

提高蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)對工業(yè)化加工具有重大意義,結(jié)構(gòu)修飾是提高蛋白質(zhì)功能性質(zhì)的有效途徑。常用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)修飾的方法可分為四類:酶法、化學(xué)法、物理法、基因工程法[6-7]。目前,蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾相關(guān)研究主要集中在酰化修飾方面等。酰化修飾是指蛋白質(zhì)分子的親核基團(tuán)(如氨基或羥基)與?；噭┲g反應(yīng),從而導(dǎo)入新的功能基團(tuán)的過程。最為常見的?；噭殓晁狒?、琥珀酸和乙酸酐[2,8-10]。

食品蛋白質(zhì)酶法修飾主要有酶法交聯(lián)和酶法水解。谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(TG)是一種能催化?；D(zhuǎn)移的酶,它可使蛋白質(zhì)(或多肽)之間發(fā)生共價(jià)鍵交聯(lián),使蛋白質(zhì)分子量變大,形成強(qiáng)有力的凝膠,從而改變各種蛋白產(chǎn)品的彈性、保水性、塑性、穩(wěn)定性等特性,并且引入的賴氨酸殘基仍然能被消化利用,不會造成營養(yǎng)價(jià)值的降低[6-8]。

本文研究了化學(xué)法?；揎椇兔阜ń宦?lián)修飾后牦牛乳酪蛋白的熱穩(wěn)定性,探討改性手段對酪蛋白熱穩(wěn)定性的影響,為牦牛乳酪蛋白結(jié)構(gòu)修飾及其產(chǎn)品開發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牦牛乳鹽酸沉淀酪蛋白 購于甘肅華羚生物有限責(zé)任公司,經(jīng)測定其中酪蛋白含量為94.20%,水分含量為3.12%;谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(100U/g) 江蘇一鳴生物制品公司；鄰苯二甲醛(OPA)、丁二酸酐、丁二酸、乙酸酐 天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司。

DF-Ⅱ集熱式磁力加熱攪拌器 金壇市順華儀器有限公司；pHS-3C實(shí)驗(yàn)室pH計(jì) 上海三信儀表廠；HWS型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科技有限公司；AL204電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；TGL-20高速離心機(jī) 長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；TDD5M低速離心機(jī) 長沙平凡儀器儀表有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酶法交聯(lián)酪蛋白的制備 配制濃度為5mg·mL-1、pH7.0的牦牛乳酪蛋白溶液,在47℃下以15U·g-1·添加TG,磁力攪拌下反應(yīng)135min。反應(yīng)結(jié)束后,在85℃下滅活5min,冷卻后用1.0mol·L-1HCl將溶液的pH調(diào)至4.6,酪蛋白沉淀,離心后真空冷凍干燥備用。

1.2.2 ?；业鞍椎闹苽?準(zhǔn)確稱取1.0000g牦牛乳酪蛋白樣品,加入100mL去離子水中,在40℃磁力攪拌直至酪蛋白完全溶解。將溶液pH調(diào)至8～9,在40℃磁力攪拌下加入0.1、0.2、0.6g琥珀酸酐并不斷加入1.0mol·L-1NaOH溶液使反應(yīng)液pH穩(wěn)定在8～9,反應(yīng)50min。用1.0mol·L-1HCl溶液將?；罄业鞍兹芤簆H調(diào)至產(chǎn)生大量沉淀,于3500r/min離心15min,棄去上清液,將沉淀置于鋼制托盤進(jìn)行冷凍干燥,得到白色粉末狀琥珀酸酐?；业鞍字破?備用。以不加?；噭┑臉悠纷鳛閷φ?處理方法同上。

琥珀酸、乙酸酐?；业鞍字苽浞椒ㄍ?乙酸酐用量為0.56mL,琥珀酸用量為1.5g。

1.2.3 ?；潭燃敖宦?lián)程度測定 牦牛乳酪蛋白酰化程度參照楊敏的方法[1],采用鄰苯二甲醛法測定。準(zhǔn)確稱取40mg OPA,溶于1mL乙醇；配制25mL濃度為0.1mol·L-1、pH為9.3的硼砂緩沖溶液；移取2.5mL 20%的SDS溶液,與上述溶液混合并用蒸餾水稀釋至50mL。準(zhǔn)確移取3mL濃度為0.2mg·mL-1的酪蛋白溶液,與3mL上述OPA溶液混合,充分震蕩并放置2min后采用紫外-可見分光光度計(jì)于340nm測定吸光度值。游離氨基含量采用亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計(jì)算。

酪蛋白酰化程度及交聯(lián)程度采用下式計(jì)算:

修飾程度(Modification degree,%)=(No-Nm)/No×100

N0和Nm分別為?；昂罄业鞍子坞x氨基含量。

1.2.4 酪蛋白樣品熱處理 將濃度為2mg/mL、pH7.0的樣品溶液30mL,分別在40～90℃下加熱20min,冷卻至室溫后,40000g條件下離心35min,稀釋后280nm下測定上清液的吸光度,根據(jù)吸光度值的大小判定溶液的熱穩(wěn)定性。

1.2.5 熱穩(wěn)定性的測定 溶解各酪蛋白樣品使其質(zhì)量濃度為0.5mg·mL-1,pH7.0,溶液分別在40～90℃下加熱20min,冷卻至室溫后,8000r/min條件下離心20min,上清液過濾,在280nm下測定上清液的吸光度,根據(jù)吸光度值的大小判定溶液的熱穩(wěn)定性[11]。上清液吸光度值越大,說明溶解的蛋白質(zhì)越多,沉淀的蛋白量越少,熱穩(wěn)定性越高。每個(gè)樣品測定重復(fù)三次,以平均值作為實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 牦牛乳酪蛋白修飾程度分析

根據(jù)圖1所示,牦牛乳酪蛋白酶法交聯(lián)程度為20.77%±0.82%,由于位阻效應(yīng)等因素,酶法交聯(lián)程度相對較低。琥珀酸酐用量為0.1、0.2、0.6g時(shí),酪蛋白的?；潭确謩e為73.33%±0.32%、85.77%±0.43%、90.00%±0.24%,乙酸酐?；潭葹?7.91%±0.32%、琥珀酸酰化程度為18.52%±0.43%,由此可見,不同?；噭﹃笈Ｈ槔业鞍椎孽；潭染哂胁町?。琥珀酸酐、乙酸酐與氨基反應(yīng)活性較高,?；潭雀?。琥珀酸酐帶有負(fù)電荷,與氨基反應(yīng)后在蛋白質(zhì)側(cè)鏈上引入了負(fù)電基團(tuán),使得蛋白質(zhì)內(nèi)部側(cè)鏈間及蛋白質(zhì)分子之間靜電斥力增大,加之琥珀酸體積較乙酸大,?；罄业鞍捉Y(jié)構(gòu)變得更加伸展,從而使內(nèi)部包埋的氨基裸露,?；潭茸罡遊2,12-13]。琥珀酸反應(yīng)活性較低。

圖1 TG修飾與不同?；瘲l件下酪蛋白的修飾程度圖Fig.1 Modification degree of yak caseins under different acylation and TG cross-link

2.2 交聯(lián)修飾對酪蛋白熱穩(wěn)定性的影響

從圖2可以看出,在相同溫度下,交聯(lián)后的酪蛋白熱穩(wěn)定性顯著提高。牦牛乳酪蛋白與交聯(lián)酪蛋白熱穩(wěn)定性均隨著熱處理溫度的升高而降低。

圖2 TG交聯(lián)對酪蛋白熱穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effect of TG cross-linking on the heat stability of yak caseins注:圖例中數(shù)字為酪蛋白?；潭?圖3同。

熱處理過程中,酪蛋白分子熱運(yùn)動(dòng)加劇,分子之間易于聚集而沉淀,酪蛋白分子熱運(yùn)動(dòng)隨著加熱溫度的升高而加劇,上清液中游離酪蛋白分子減少,沉淀量增加。由于TG交聯(lián)時(shí)蛋白質(zhì)分子內(nèi)部和分子間形成共價(jià)鍵,增強(qiáng)了酪蛋白分子內(nèi)部的作用力,從而使酪蛋白分子結(jié)構(gòu)不易隨著體系環(huán)境變化而改變,分子間不易形成相互作用力而聚集,因此穩(wěn)定性得到了提高[14-16]。許多研究表明,TG能提高乳的熱穩(wěn)定性。O’Sullivan M M報(bào)道脫脂乳經(jīng)TG處理后,在pH6.3～7.1范圍內(nèi)比未處理乳的熱穩(wěn)定性更高[14]。本實(shí)驗(yàn)與他們的研究報(bào)道是一致的。

2.3 不同程度琥珀?；揎棇﹃笈Ｈ槔业鞍谉岱€(wěn)定性的影響

從圖3可以看出,隨著溫度的升高,牦牛乳酪蛋白及不同?；潭壤业鞍谉岱€(wěn)定性逐漸降低；同一溫度下,隨著?；潭鹊脑黾?牦牛乳酪蛋白熱穩(wěn)定性逐漸升高。

圖3 琥珀酰化修飾對牦牛乳酪蛋白熱穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effect of succinylation on the heat stability of yak caseins

琥珀?；揎検估业鞍子坞x氨基連接了琥珀酰基,凈負(fù)電荷增加,結(jié)構(gòu)伸展,疏水性相互作用降低,酪蛋白分子間靜電斥力增加,在加熱過程中不易聚集而沉淀,因此上清液中溶液的游離酪蛋白分子增加,熱穩(wěn)定性增加[17-18]。

2.4 不同酰化試劑對酪蛋白熱穩(wěn)定性的影響

從圖4可以看出,乙酸酐、琥珀酸和琥珀酸酐修飾后酪蛋白熱穩(wěn)定性增強(qiáng)。不同酰化試劑修飾后酪蛋白熱穩(wěn)定性隨著熱處理溫度的升高而降低。

圖4 不同酰化試劑對酪蛋白熱穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effect of acylation with different reagents on the heat stability of yak caseins

乙酸酐修飾后,酪蛋白側(cè)鏈游離氨基連接了乙?；?由于乙?；粠щ姾?而琥珀酰基帶有負(fù)電荷,因而乙?；业鞍追肿娱g斥力小于琥珀?；业鞍追肿?所以乙酰化酪蛋白熱穩(wěn)定性低于琥珀?；业鞍?。由于琥珀酸修飾程度較低,其修飾后酪蛋白熱穩(wěn)定性低于琥珀酸酐修飾酪蛋白。

3 結(jié)論

牦牛乳酪蛋白是青藏高原地區(qū)的特色資源,利用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)修飾是改善蛋白質(zhì)功能性質(zhì)的主要手段。牦牛乳酪蛋白經(jīng)過酶法交聯(lián)和化學(xué)?；揎椇鬅岱€(wěn)定性發(fā)生變化,具體表現(xiàn)為:牦牛乳酪蛋白與修飾酪蛋白熱穩(wěn)定性隨著溫度的升高而降低；TG交聯(lián)修飾后,牦牛乳酪蛋白熱穩(wěn)定性增強(qiáng)。采用不同酰化試劑修飾后,牦牛乳酪蛋白熱穩(wěn)定性增強(qiáng)；其中,當(dāng)?；噭┠栍昧肯嗤瑫r(shí),琥珀酸酐修飾酪蛋白熱穩(wěn)定性最強(qiáng),其次為乙酸酐修飾酪蛋白,再次為琥珀酸修飾酪蛋白。琥珀酸酐修飾后,牦牛乳酪蛋白熱穩(wěn)定性隨著酰化程度的升高而增強(qiáng)。結(jié)果可為牦牛乳酪蛋白修飾和產(chǎn)品開發(fā)及利用提供參考依據(jù)。

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Heat stability of yak caseins with acylation
and TG cross-link modification

YANG Ji-tao1，YANG Min1,2，*，ZHANG Yuan1，YANG Xi1

(1.College of Science,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China;2.Functional Dairy Product Engineering Laboratory of Gansu,Lanzhou 730070,China)

Casein in yak milk was modified by acylating reagents and transglutaminase(TG),and modified casein was analyzed for their heat stability. Spectrophotometry at 280nm was uesd to determine the size of the casein heat stability. The results showed that the heat stability of casein greatly increased after modification of transglutaminase(TG)cross-linking. After using different acylating reagents modification,the heat stability of casein increased. Different modified casein heat stability showed a great difference,succinic anhydride modified casein had the strongest heat stability. The results could provide a reference basis for yak casein modification and product development.

yak casein;heat stability;acylation;cross-linking;transglutaminase

2014-07-22

楊繼濤(1981-)，男，碩士，講師，研究方向：食品科學(xué)。

*通訊作者:楊敏(1981-)，女，博士，副教授，研究方向:乳品科學(xué)與技術(shù)。

TS252.42

A

:1002-0306(2015)09-0129-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.09.019