畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)發(fā)展概況及趨勢(shì)

朱泰承，李寅

畢赤酵母Pichia pastoris目前已是僅次于大腸桿菌的最常用蛋白表達(dá)系統(tǒng)，廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的蛋白質(zhì)制備、表征以及結(jié)構(gòu)解析等方面，已有上千種蛋白在畢赤酵母系統(tǒng)中得到成功地表達(dá)。近些年，畢赤酵母被美國(guó)FDA認(rèn)定為GRAS (Generally recognized as safe) 微生物，為其在食品和醫(yī)藥上的應(yīng)用鋪平了道路。在醫(yī)藥蛋白領(lǐng)域，已有胰島素、乙肝表面抗原、人血清白蛋白、表皮生長(zhǎng)因子等多種蛋白使用畢赤酵母表達(dá)實(shí)現(xiàn)商品化制備[1]。在工業(yè)酶制劑領(lǐng)域，也有許多酶制劑包括植酸酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶等利用畢赤酵母實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化規(guī)模的生產(chǎn)[2]。關(guān)于畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的基本元素、優(yōu)勢(shì)特點(diǎn)以及生理特性等，之前已有很多綜述進(jìn)行過系統(tǒng)的闡述[3-6]，本文不再贅述。本文旨在從工業(yè)技術(shù)應(yīng)用的角度綜述畢赤酵母近些年取得的進(jìn)展，同時(shí)就畢赤酵母系統(tǒng)存在的問題以及未來的研究方向進(jìn)行分析和展望。

1 畢赤酵母系統(tǒng)的進(jìn)展

1.1 蛋白質(zhì)表達(dá)方面的進(jìn)展

回顧畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)20多年的發(fā)展，從總體上決定畢赤酵母蛋白表達(dá)水平的因素主要有兩個(gè)：1) 基因劑量，即外源基因的拷貝數(shù)；2) 蛋白質(zhì)的分泌。畢赤酵母系統(tǒng)開發(fā)前期，集中解決的是基因劑量的問題，近10年研究的熱點(diǎn)是蛋白分泌的問題。以下將就這兩方面進(jìn)行簡(jiǎn)要的闡述。

1.1.1 基因劑量

與大腸桿菌和釀酒酵母等宿主不同，畢赤酵母自身沒有穩(wěn)定存在的游離型載體，所有的表達(dá)載體都要整合到酵母的基因組上。雖然有PAOX1、PGAP等強(qiáng)啟動(dòng)子，但由于整體上拷貝數(shù)較低，外源表達(dá)量不足。因此，早期的研究為了提高蛋白表達(dá)水平，主要是通過構(gòu)建和篩選載體發(fā)生多次整合的多拷貝菌株來提高外源蛋白的產(chǎn)量。為了得到多拷貝菌株，人們?cè)O(shè)計(jì)了體外法和體內(nèi)法兩種策略[7]。體外法是在體外構(gòu)建多拷貝載體，再將其轉(zhuǎn)化至酵母宿主中。該方法優(yōu)點(diǎn)是多拷貝轉(zhuǎn)化子篩選到的幾率較高，但缺點(diǎn)是分子克隆工作量大，由于載體大小的限制，一般最多可獲得 6–8個(gè)拷貝的載體。體內(nèi)法是通過在載體上加入抗生素標(biāo)記，如Zeocin、G418抗性基因等，將載體轉(zhuǎn)化入宿主之后，可以通過提高培養(yǎng)基中抗生素濃度篩選多次整合的多拷貝轉(zhuǎn)化子。該方法的優(yōu)點(diǎn)是構(gòu)建較為簡(jiǎn)單，缺點(diǎn)是篩選工作量較大、假陽性比率較高、拷貝數(shù)鑒定較為麻煩。

近些年，篩選多拷貝數(shù)轉(zhuǎn)化子的方法不斷得到改進(jìn)。例如，Sunga等報(bào)道了 PTVA(Post-transformational vector amplification) 的方法[8]，發(fā)現(xiàn)可以通過將低拷貝菌株不斷在抗性平板上反復(fù)傳代促使載體在體內(nèi)的多次重組，從而顯著降低了篩選的工作量，提高了篩選到多拷貝轉(zhuǎn)化子的幾率。在此基礎(chǔ)上，Marx等[9]使用rDNA作為載體整合位點(diǎn) (替代常用的HIS4、AOX1、GAPDH基因位點(diǎn))，由于rDNA在畢赤酵母基因組中高度重復(fù) (150個(gè)拷貝左右)，因此大幅提高了表達(dá)載體的整合效率。Zhu等[10]報(bào)道了將體內(nèi)法和體外法相結(jié)合的策略，從而顯著增加了篩選到多拷貝菌株的效率，并建立了基于熒光定量 PCR的準(zhǔn)確鑒定拷貝數(shù)的方法。由此篩選到了高達(dá)52拷貝的轉(zhuǎn)化子?？傊?，由于近些年拷貝數(shù)構(gòu)建策略的進(jìn)步和熒光定量PCR方法的普及，基因劑量已基本不再是畢赤酵母蛋白表達(dá)的限制性的瓶頸。

但與此同時(shí)應(yīng)當(dāng)注意到，外源基因劑量過高也會(huì)引起一系列的生理問題。首先，外源基因不穩(wěn)定性增加。過去一般認(rèn)為與游離狀態(tài)相比載體整合到染色體中是很穩(wěn)定的。但無論是體內(nèi)法還是體外法，所有的載體都是整合在相鄰近的位點(diǎn)，研究表明這種方式是不穩(wěn)定的，在一定條件下可能通過同源重組而丟失[11]。其次，折疊脅迫對(duì)于生理造成不利影響。前人研究發(fā)現(xiàn)高拷貝重組菌株的生長(zhǎng)速率、存活率都有降低的現(xiàn)象[10,12]。通常認(rèn)為蛋白質(zhì)過量表達(dá)會(huì)消耗宿主細(xì)胞的碳源和能源，因此會(huì)給宿主帶來代謝負(fù)擔(dān)。但是對(duì)于畢赤酵母來說，分泌表達(dá)蛋白的量通常不超過胞內(nèi)總蛋白的5%。因此，很難僅用代謝負(fù)擔(dān)來解釋蛋白表達(dá)對(duì)于酵母的生理影響。近些年研究發(fā)現(xiàn)，蛋白分泌表達(dá)會(huì)消耗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中大量的蛋白伴侶，干擾細(xì)胞自身蛋白的正確折疊，這種現(xiàn)狀統(tǒng)稱為折疊脅迫[13]。折疊脅迫會(huì)改變細(xì)胞的正常代謝，降低細(xì)胞的抗逆性，甚至造成細(xì)胞的死亡[14]。因此，在實(shí)際應(yīng)用和生產(chǎn)上，高拷貝菌株對(duì)于細(xì)胞生理的影響不應(yīng)被忽視，必要時(shí)應(yīng)當(dāng)對(duì)于培養(yǎng)工藝進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整。

1.1.2 蛋白質(zhì)分泌

人們?cè)谘芯靠截悢?shù)時(shí)，發(fā)現(xiàn)拷貝數(shù)提高到一定程度，蛋白表達(dá)量并不是線性增加的，甚至有可能不變或降低。許多研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)將這些宿主細(xì)胞破碎后，有相當(dāng)大比例的新合成蛋白積累在細(xì)胞內(nèi)無法分泌出來[15]。因此，研究者逐漸意識(shí)到蛋白表達(dá)在分泌步驟上很易受到限制。

與基因劑量問題不同，分泌問題是一個(gè)表達(dá)系統(tǒng)分泌表達(dá)的共性問題，不僅限于畢赤酵母系統(tǒng)，而且分泌問題比拷貝數(shù)問題復(fù)雜的多，分泌過程包括蛋白的折疊、修飾、運(yùn)輸、修復(fù)以及降解等多個(gè)步驟[16]，涉及基因多達(dá)上千個(gè)[17]。當(dāng)外源蛋白過量表達(dá)時(shí)，大量新合成的多肽需要折疊和修飾，這就會(huì)占用大量宿主細(xì)胞分泌途徑中的蛋白伴侶等輔助因子，使得細(xì)胞對(duì)于外源蛋白的加工能力很快趨于飽和，結(jié)果有相當(dāng)比例的重組蛋白因缺乏足夠的伴侶因子而無法折疊成正確構(gòu)象，這些未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白將無法通過細(xì)胞自身的蛋白質(zhì)質(zhì)檢系統(tǒng)，因而或被保留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中繼續(xù)折疊，或被運(yùn)轉(zhuǎn)到細(xì)胞質(zhì)中降解[13,18]。為了解決分泌的限制，提高蛋白質(zhì)的分泌表達(dá)水平，前人進(jìn)行了大量的研究和嘗試，主要工作可分為理性改造和反向工程兩個(gè)思路。

1) 分泌途徑的理性改造。即基于既有的認(rèn)識(shí)和經(jīng)驗(yàn)，對(duì)一些目前認(rèn)為在分泌途徑中可能起限制性作用的分泌因子基因進(jìn)行過表達(dá)或敲除。改造目標(biāo)基因可分為 3大類：①在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白折疊相關(guān)基因，如BiP (Hsp70類伴侶蛋白，輔助分泌蛋白折疊的重要因子)、Pdi (負(fù)責(zé)二硫鍵形成) 等蛋白伴侶因子。過表達(dá) BiP因子，使得釀酒酵母Saccharomyce cerevisiae中表達(dá) Hirudin提高了 2.5倍[19]。Pdi的過表達(dá)使得抗體蛋白2F5 Fab在P. pastoris的表達(dá)水平提高了 2倍[20]。②蛋白轉(zhuǎn)位和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因。如 Ruohonen等[21]報(bào)道了在釀酒酵母中過表達(dá)Sso1p和 Sso2p因子 (與高爾基體-細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)囊泡定位和融合有關(guān))，使得淀粉酶表達(dá)量分別提高了4倍和6倍；Zhang等[22]在用P. pastoris表達(dá) GCSF蛋白時(shí)，分別過表達(dá)了與蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的3個(gè)因子 (Sec63、Ydj、Ssa1p)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些因子對(duì)于GCSF的表達(dá)有2.8、3.6和6.8倍不等的提高。③與蛋白降解或降解途徑相關(guān)的基因。這些基因改造時(shí)主要通過敲除這些基因來提高蛋白的分泌表達(dá)量。如PEP4 (編碼蛋白酶PrA) 和PRB1 (編碼蛋白酶PrB) 基因的缺失酵母菌株很早就用于蛋白表達(dá)。將Vps10 (液泡降解途徑的重要分選蛋白) 進(jìn)行敲除，可使得粟酒裂殖酵母Schizosaccharomyces pombe中的重組人生長(zhǎng)激素產(chǎn)量提高約2倍[23]。

這些工作雖然取得了一定程度的成功，但存在的很多問題仍未能解決，主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：首先，與分泌相關(guān)的基因有上千個(gè)之多，限于目前對(duì)蛋白分泌的認(rèn)識(shí)，如何從中識(shí)別出有效的改造靶點(diǎn)存在較大的問題。其次，由于蛋白伴侶具有特異性，即對(duì)于不同的外源蛋白，限制其表達(dá)的分泌因子也不相同，這使得成功案例的借鑒價(jià)值也有限。如Pdi的過表達(dá)并不能使得A33scFv抗體蛋白在P. pastoris中的產(chǎn)量提高[24]，BiP的過表達(dá)無法提高P. pastoris中甘露聚糖酶的表達(dá)量[25]，甚至使得葡萄糖氧化酶在漢遜酵母 Hansenula polymorpha的產(chǎn)量降低了10倍[26]。

2) 分泌途徑的反向工程改造。為了克服理性改造中遇到的問題，近年來人們也開始使用反向工程的策略進(jìn)行分泌途徑的改造?？傮w思路是利用組學(xué)手段比較蛋白過表達(dá)菌株與對(duì)照菌株，識(shí)別出顯著上調(diào)的基因，這些基因即是改造的潛在靶點(diǎn)。轉(zhuǎn)錄水平上，Gasser等[27]利用比較轉(zhuǎn)錄組識(shí)別出CUP5、SSA4、BMH2、KIN2等之前未報(bào)道的蛋白伴侶基因，這些基因的過表達(dá)對(duì)于2F5 Fab抗體在P. pastoris中的分泌有顯著促進(jìn)作用。同一個(gè)研究組的Stadlmayr等[28]建立了畢赤酵母的過表達(dá) cDNA文庫(kù)，結(jié)合高通量分析手段和轉(zhuǎn)錄組分析，成功地篩選到了3個(gè)新蛋白伴侶因子。蛋白質(zhì)水平上，Huangfu等[29]通過比較蛋白組分析識(shí)別出 6個(gè)顯著上調(diào)的基因，其中TPX、FBA和PGAM基因的共表達(dá)使得報(bào)告基因表達(dá)量提高了2.46、1.58和1.33倍。Pfeffer等還報(bào)道了利用相互作用組來篩選改造靶點(diǎn)的思路[30]。總之，在目前對(duì)于分泌因子和分泌途徑的認(rèn)識(shí)都比較有限的情況下，反向工程的手段使我們能夠在表達(dá)宿主全基因組范圍內(nèi)挖掘新改造宿主分泌途徑的新靶點(diǎn)，同時(shí)能夠拓寬和加深我們對(duì)于宿主分泌途徑的認(rèn)識(shí)。

1.2 遺傳操作工具和方法的進(jìn)展

畢赤酵母屬于相對(duì)較易操作的系統(tǒng)，但是與大腸桿菌、釀酒酵母等模式宿主相比，無論是從操作工具還是操作方法上，仍有較大差距。近些年，研究者也在這些方面進(jìn)行了許多工作，也取得了很大的進(jìn)展。

1.2.1 啟動(dòng)子

啟動(dòng)子是調(diào)控基因表達(dá)的最重要元件之一，PAOX1啟動(dòng)子 (誘導(dǎo)型) 和 PGAP啟動(dòng)子 (組成型) 是畢赤酵母外源蛋白表達(dá)中最早也最具代表性的啟動(dòng)子，隨后陸續(xù)有各種新的啟動(dòng)子被開發(fā)出來[31-32]。這些啟動(dòng)子主要有以下幾個(gè)來源：1) 將蛋白表達(dá)量較高的基因啟動(dòng)子開發(fā)成通用啟動(dòng)子，例如TEF1、ICL1、FLD1、DAS、PEX8等啟動(dòng)子。這類工作多見于畢赤酵母研究的早期，多是研究畢赤酵母功能基因的副產(chǎn)物。2) 對(duì)已知啟動(dòng)子進(jìn)行理性改造。這部分工作主要集中在PAOX1啟動(dòng)子上。研究者對(duì)PAOX1啟動(dòng)子的調(diào)控模塊進(jìn)行了較為細(xì)致的解析[33-34]，在此基礎(chǔ)上對(duì)其進(jìn)行了人工設(shè)計(jì)[35]。3) 啟動(dòng)子工程。通過易錯(cuò)PCR對(duì)啟動(dòng)子引入隨機(jī)突變，再結(jié)合高通量篩選，可以得到不同強(qiáng)度的啟動(dòng)子的文庫(kù)。目前已報(bào)道了 PAOX1和 PGAP啟動(dòng)子的文庫(kù)的構(gòu)建[36-37]。4) 基于轉(zhuǎn)錄組分析的篩選。隨著畢赤酵母基因組序列的公布[38]，借助轉(zhuǎn)錄組分析，使得啟動(dòng)子元件的開發(fā)工作得到很大促進(jìn)。目前已篩選到了許多頗有應(yīng)用潛力的新的誘導(dǎo)型和組成型啟動(dòng)子[39-41]，如 PGTH1啟動(dòng)子[39]，其轉(zhuǎn)錄水平顯著高于PGAP啟動(dòng)子，更重要的是其轉(zhuǎn)錄水平與葡萄糖濃度負(fù)相關(guān)，因此可以通過培養(yǎng)過程中葡萄糖補(bǔ)料工藝的控制實(shí)現(xiàn)外源基因的誘導(dǎo)型表達(dá)。

1.2.2 Marker回收系統(tǒng)

隨著對(duì)畢赤酵母菌株改造的深入，經(jīng)常需要同時(shí)對(duì)畢赤酵母多個(gè)基因進(jìn)行改造。畢赤酵母系統(tǒng)已有的抗生素Marker，如Zeocin、G418、Blasticidin等顯然無法滿足改造的需求，因此對(duì)于抗生素Marker的回收非常必要。Yang等報(bào)道了基于MazF反向篩選的回收體系。隨后，基于畢赤酵母的Cre/loxP的Marker回收系統(tǒng)也得到建立和應(yīng)用[42-44]。

1.2.3 重組效率提升

目前已知，畢赤酵母為代表的非傳統(tǒng)酵母與釀酒酵母相比，非同源重組 (Non-homologous end joining，NHEJ) 途徑要明顯強(qiáng)于同源重組(Homologous recombination，HR) 途徑，因此其基因定向整合的效率很低。對(duì)某些“頑固基因”如OCH1[42]、ADE1[45]，即使使用大于1 kb的同源臂，也幾乎很難篩選到雙交換基因敲除的菌株。研究者不得不采用兩步法等折衷的方法[42]，操作非常繁瑣。最近報(bào)道顯示，阻斷KU70基因(NHEJ途徑的關(guān)鍵基因) 的畢赤酵母菌株定向整合效率顯著提升[45]，如對(duì)ADE1基因，150 bp長(zhǎng)度的同源臂也可以保證有17.5%的雙交換幾率。

1.3 在化學(xué)品研究上的進(jìn)展

隨著合成生物學(xué)的興起，酵母已成為重要的細(xì)胞工廠，用以生產(chǎn)大宗或精細(xì)化學(xué)品。已報(bào)道的以釀酒酵母為宿主生產(chǎn)的化學(xué)品包括從簡(jiǎn)單的甘油、1,3-丙二醇、乳酸、琥珀酸等到需多步催化合成的聚酮、類固醇、類異戊二烯等化合物。畢赤酵母的中間代謝產(chǎn)物庫(kù)覆蓋了釀酒酵母的 90%以上[46]，再加上畢赤酵母極易高密度培養(yǎng)特性，因而畢赤酵母具有相當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)品高產(chǎn)潛質(zhì)。目前，已用畢赤酵母生產(chǎn)的化學(xué)品包括 S-腺苷甲硫氨酸[47]、谷胱甘肽[48-49]、木糖醇[50]、核黃素[43]、番茄紅素[51]、β-胡蘿卜素[52]、透明質(zhì)酸[53]、聚酮類化合物[54]等。畢赤酵母也被開發(fā)為高效的NADH再生系統(tǒng)用于全細(xì)胞催化，如將3-羥基丁酮轉(zhuǎn)化為2,3-丁二醇[50]。

2 畢赤酵母系統(tǒng)的發(fā)展趨勢(shì)

2.1 畢赤酵母合成生物學(xué)

無論是從蛋白質(zhì)表達(dá)還是化學(xué)品生產(chǎn)角度，未來的工作都將涉及對(duì)畢赤酵母細(xì)胞工廠的深度修飾，而合成生物學(xué)無疑為畢赤酵母的發(fā)展提供了重大機(jī)遇，將深刻影響該系統(tǒng)今后發(fā)展的技術(shù)路線和應(yīng)用推廣。合成生物學(xué)的促進(jìn)主要表現(xiàn)在以下方面。

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)化、模塊化的調(diào)控元件

以啟動(dòng)子為例，以上已經(jīng)綜述了這些年在啟動(dòng)子開發(fā)領(lǐng)域的進(jìn)展，但迄今為止，畢赤酵母系統(tǒng)最常用、最可靠的啟動(dòng)子依然是 PAOX1和PGAP啟動(dòng)子。雖然研究者已開發(fā)了許多新的啟動(dòng)子并用啟動(dòng)子工程構(gòu)建了啟動(dòng)子文庫(kù)，但是總體上這些新啟動(dòng)子的通用性很少得到評(píng)價(jià)，啟動(dòng)子的元件描述得也非常不清楚 (目前僅有 PAOX1啟動(dòng)子的調(diào)控模塊研究的相對(duì)清楚)，這很大程度上限制了這些啟動(dòng)子的應(yīng)用和改造。未來如果要滿足合成生物學(xué)的應(yīng)用，畢赤酵母調(diào)控元件庫(kù)的擴(kuò)展和在一定程度的標(biāo)準(zhǔn)化、模塊化將是不可或缺的。

2.1.2 DNA克隆和組裝技術(shù)的應(yīng)用

畢赤酵母在分泌途徑和代謝工程改造上的應(yīng)用會(huì)經(jīng)常需要多個(gè)基因的引入，目前所使用的單個(gè)基因依次整合的策略顯然無法滿足今后操作的需求。可以預(yù)見，目前在大腸桿菌和釀酒酵母系統(tǒng)中較為常用的，如 TAR(Transformation associated recombination)[55]、Gibson assembly[56]和 SLIC (Sequence and ligation independent cloning)[57]等DNA組裝技術(shù)將會(huì)在畢赤酵母系統(tǒng)中取得廣泛的應(yīng)用，使得其遺傳改造效率得到質(zhì)的提高。

2.1.3 基因組規(guī)模的改造

對(duì)于菌株復(fù)雜表型的改造 (如溫度耐受性、溶劑耐受性等) 由于涉及多個(gè)基因的調(diào)節(jié)和協(xié)調(diào)一直是代謝工程的難點(diǎn)，從基因組規(guī)模引入擾動(dòng)，對(duì)于改造和理解復(fù)雜表型具有重要意義[58]。對(duì)于畢赤酵母系統(tǒng)，蛋白質(zhì)分泌涉及上千個(gè)基因，屬于典型的復(fù)雜表型。迄今為止，畢赤酵母系統(tǒng)中基因組規(guī)模的改造工作很少。Stadlmayr等報(bào)道了通過構(gòu)建cDNA過表達(dá)文庫(kù)來篩選高分泌菌株[28]，但該策略每個(gè)菌株中只有一個(gè)基因發(fā)生了擾動(dòng)，因此無法考察基因之間的協(xié)調(diào)作用。因此，諸如 gTME (Global transcription machinery engineering)[59]，MAGE(Multiplex automated genome engineering)[60]，GREASE (Genome replication engineering assisted continuous evolution)[61]等更加高效的基因組規(guī)模的擾動(dòng)方法，將為畢赤酵母分泌、耐受性等表型的改造提供重要保障。

2.2 分泌工程

克服蛋白的分泌限制，提高畢赤酵母的分泌表達(dá)水平，依然將是今后畢赤酵母在蛋白質(zhì)表達(dá)方向的研究熱點(diǎn)。所謂分泌工程，是指對(duì)表達(dá)宿主的分泌途徑進(jìn)行系統(tǒng)的設(shè)計(jì)和改造，它與之前的分泌途徑改造工作相比應(yīng)具有以下特點(diǎn)：1) 對(duì)宿主更系統(tǒng)深入的改造。之前的工作基本是考察單個(gè)伴侶基因?qū)τ谒拗鞯牡鞍踪|(zhì)分泌表達(dá)水平，而對(duì)于分泌途徑的系統(tǒng)改造顯然需要同時(shí)對(duì)多個(gè)靶點(diǎn)基因進(jìn)行改造。2) 引入改造的新思路。由于目前細(xì)胞分泌途徑的認(rèn)識(shí)仍有待加深，對(duì)于分泌途徑的改造思路和方法仍需要不斷探索。例如，前人對(duì)于分泌途徑的改造基本都是從蛋白伴侶的角度來進(jìn)行的，而對(duì)于分泌途徑來說，除了各種蛋白因子在起作用，同樣重要但卻容易被忽視的是脂類的作用。沒有相應(yīng)的脂類合成，就無法為蛋白加工和運(yùn)輸提供足夠的載體和基質(zhì)，也就很難有效提高細(xì)胞蛋白分泌的通量。前人的一些實(shí)驗(yàn)報(bào)道也初步顯示了脂類在分泌中可能起到的重要作用[62-63]。3) 不僅關(guān)注蛋白的“量”，還要關(guān)注表達(dá)蛋白的“質(zhì)”。這對(duì)于醫(yī)藥蛋白的表達(dá)尤為重要，如Wu等[64]研究發(fā)現(xiàn)畢赤酵母表達(dá)的干擾素會(huì)有相當(dāng)一部分無法完全生成二硫鍵，導(dǎo)致干擾素活力顯著下降，因此提高表達(dá)蛋白的質(zhì)量和均一性將是一個(gè)重要方向。另外，分泌途徑的糖基化改造，以實(shí)現(xiàn)重組蛋白的人源糖基化也是目前研究的熱點(diǎn)，這部分內(nèi)容已有綜述報(bào) 道[65]，本文不再詳細(xì)討論。

2.3 提高原料利用效率和范圍

原料是生物煉制體系中最為重要的核心問題之一。原料的利用效率 (得率和產(chǎn)率問題) 是判斷一個(gè)生物轉(zhuǎn)化過程是否能夠?qū)崿F(xiàn)商品化生產(chǎn)所需考慮的重要問題。另外，葡萄糖是目前生物煉制最為常用的原料，但葡萄糖的成本相對(duì)于大宗化學(xué)品的生產(chǎn)仍然較高，同時(shí)還涉及糧食安全問題。因此葡萄糖的替代原料也一直是研究的熱點(diǎn)，目前葡萄糖的替代原料包括五碳糖、合成氣、甲醇和二氧化碳等。

隨著頁巖氣開發(fā)技術(shù)的突破，甲醇的生產(chǎn)成本逐年下降 (近幾年顯著低于葡萄糖)，甲醇已越來越被看好是未來生物煉制體系的重要原料之一[66]。甲醇利用無疑是畢赤酵母系統(tǒng)的顯著特色，故提高甲醇的利用效率將是使用畢赤酵母系統(tǒng)作為細(xì)胞工廠生產(chǎn)大宗生物基產(chǎn)品的關(guān)鍵問題。Krainer等[67]報(bào)道了甲醛脫氫酶基因(FLD1) 和二羥丙酮合成酶 (DAS1) 的過表達(dá)，可顯著提高畢赤酵母的蛋白產(chǎn)率，這表明畢赤酵母對(duì)于甲醇的利用效率仍有繼續(xù)提高的空間。擴(kuò)大畢赤酵母菌株的底物利用范圍，無疑也是增強(qiáng)畢赤酵母系統(tǒng)競(jìng)爭(zhēng)力的重要路徑。Li等構(gòu)建了能夠有效利用木糖的畢赤酵母[68]，為畢赤酵母系統(tǒng)利用木質(zhì)纖維素原料奠定了基礎(chǔ)。

3 結(jié)論

雖然畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)已經(jīng)有20多年的研究，但與大腸桿菌、釀酒酵母等模式系統(tǒng)相比，對(duì)畢赤酵母系統(tǒng)的認(rèn)識(shí)仍有待深入，合成生物學(xué)層次的改造還有待加強(qiáng)。但畢赤酵母具備其他系統(tǒng)不具備的特點(diǎn)，如甲醇利用、高密度發(fā)酵、副產(chǎn)物少等，相信未來隨著上述問題的解決，畢赤酵母在生物煉制的細(xì)胞工廠中將占有重要的一席之地，應(yīng)用前景非常廣闊。

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