湘雜油631油菜種子黃、黑粒的耐貯性差異

李 亮，米澤洲，張 祥，李曉明，田向榮

(1.吉首大學(xué)植物資源保護與利用湖南省高校重點實驗室，湖南 吉首 416000；2.湘西土家族苗族自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，湖南 吉首 416000；3.吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，湖南 吉首 416000)

?

湘雜油631油菜種子黃、黑粒的耐貯性差異

李 亮1，2，米澤洲1，3，張 祥1，3，李曉明2，田向榮1

(1.吉首大學(xué)植物資源保護與利用湖南省高校重點實驗室，湖南 吉首 416000；2.湘西土家族苗族自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，湖南 吉首 416000；3.吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，湖南 吉首 416000)

油菜；種子；黃黑粒；耐貯性；差異

在相同遺傳背景下，不管是甘藍型還是芥菜型油菜，黃籽油菜與黑籽油菜相比，具有皮殼率低、含油量高、蛋白質(zhì)含量高等特點，受到油菜育種專家的普遍重視[1].實際上，油菜種子顏色不只是一個外觀問題，還是關(guān)系到收獲產(chǎn)品品質(zhì)的重要問題，也是關(guān)系到作物生存繁衍的生態(tài)和進化問題.以往對油菜種子顏色的研究主要針對形成黃、黑色籽粒的物質(zhì)基礎(chǔ)[1-3].人們雖然對油菜種皮中各類物質(zhì)含量的測定有了一定的研究成果，但未見將油菜黃籽與黑籽所含物質(zhì)的差別與其耐貯藏性聯(lián)系起來進行研究，也幾乎沒有對黃、黑粒種子在萌發(fā)和貯藏行為中的差別進行研究.

1 材料與方法

1.1 供試材料

湘雜油631油菜種子由湖南省春云農(nóng)業(yè)科技股份有限公司提供，按顏色的深淺分為黃色和黑色2種，用1 g/L的NaClO溶液表面消毒2～3 min，去離子水沖洗后吸去表面水分，按照文獻[5]的方法，將種子置于40 ℃和相對濕度為100%的培養(yǎng)箱中進行人工老化.

1.2 種子萌發(fā)率的測定

按照文獻[6]的方法，分別取老化0，3，6，9 d的黃、黑色油菜種子，置于墊有2層濾紙的培養(yǎng)皿中，加入適量蒸餾水.每個取樣50粒，在20 ℃、光照為0 級的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，測其發(fā)芽率(發(fā)芽率=油菜種子發(fā)芽的數(shù)目/50 ×100%)，重復(fù)3次.

參照文獻[7]的方法，本實驗用羥胺氧化法測定超氧陰離子自由基的產(chǎn)生速率，用單位時間內(nèi)NaNO2的增加值表示超氧陰離子自由基的產(chǎn)生速率.具體操作過程如下：稱取經(jīng)不同方法處理后的材料0.2 g，加入50 mmol/L的磷酸緩沖液3 mL,冰浴研磨5 min，然后迅速轉(zhuǎn)入預(yù)冷的離心管中，在12 000g,4 ℃條件下離心25 min，得到上清液(即實驗所需的超氧陰離子自由基提取液).取經(jīng)不同方法處理的實驗組提取液各1 mL，分別按照標(biāo)準(zhǔn)溶液的反應(yīng)過程依次加入反應(yīng)試劑至反應(yīng)完全.取反應(yīng)液中粉紅色水相用分光光度計測定溶液在530 nm下的吸光值(每組共測定5次吸光值，每次間隔30 s).最后用材料每克干重每分鐘變化的微摩爾數(shù)作為超氧陰離子自由基的實際反應(yīng)速率.

1.4 過氧化氫(H2O2)含量的測定

參照文獻[8-9]的方法，利用Ti4+與H2O2形成有色絡(luò)合離子的特性測定其含量.稱取經(jīng)不同方法處理后的材料0.2 g,用50 g/L的三氯乙酸(TCA)3 mL冰浴研磨5 min，然后在4 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心20 min，得樣品提取液.分別取樣品提取液各1 mL，依次加入反應(yīng)液0.1 mL 50 g/L的硫酸鈦0.2 mL的濃氨水，待沉淀形成后，在4 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min，棄去上清液，保留沉淀并加入濃度為2 mol/L的H2SO45.0 mL，使沉淀充分溶解，并在410 nm波長下比色測定各組的吸光值.結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線以每克干重材料中所含的H2O2的微摩爾數(shù)作為過氧化氫含量的定量指標(biāo).

1.5 抗氧化酶活性的測定

參照文獻[10-11]的方法進行抗氧化酶的初步提取.稱取經(jīng)不同方法處理后的材料0.2 g，加入50 mmol/L的磷酸緩沖液3 mL,冰浴研磨5 min，然后迅速轉(zhuǎn)入預(yù)冷的離心管中，在10 000g,4 ℃條件下離心15 min，得上清液(即SOD和CAT活性測定所需粗酶提取液).

1.5.2 過氧化氫酶(CAT)活性測定 參照文獻[13]的方法，用H2O2溶液的紫外吸收變化來表示CAT的活性.測定時，在3 mL反應(yīng)液 (含50 mmol/L 磷酸緩沖液，pH值7.0)中加入100 μL 10 mmol/L的H2O2迅速混勻，在240 nm下記錄光吸光值的變化，30 s讀數(shù)1次，連續(xù)讀數(shù)5次,最后以每毫克蛋白每分鐘光度值變化作為CAT活性.

1.6 抗壞血酸(AsA)含量的測定

參照文獻[14]的方法，稱取植物材料0.2 g，加入提取液(60 g/L)TCA，含0.1 mmol/L的EDTA)3 mL,冰浴研磨5 min，然后迅速轉(zhuǎn)入預(yù)冷的離心管中，在12 000g,4 ℃條件下離心20 min，得上清液(即實驗所需AsA粗提取液).利用Fe3+對抗壞血酸的氧化作用，用雙吡啶定量的Fe2+濃度(單位：μmol/L)來表示AsA的含量.

1.7 丙二醛(MDA)含量的測定

參照文獻[15]的方法，稱取植物材料0.2 g，加入提取液(100 g/L的TCA)3 mL,冰浴研磨5 min，然后迅速轉(zhuǎn)入預(yù)冷的離心管中，在8 000g,4 ℃條件下離心15 min，得上清液(即實驗所需丙二醛粗提取液).

取上清液1 mL于試管中，加入3 mL 5 g/L的TBA溶液，混合均勻，蓋上試管塞,沸水浴25 min,迅速冷卻至室溫.8 000g離心15 min，用1 mL 100 g/L TCA+3 mL 5 g/L TBA溶液混合均勻作對照，分別測定粗提取液在532 nm和450 nm下的吸光值.

2 結(jié)果與討論

2.1 萌發(fā)率變化

圖1 老化處理時間對油菜種子發(fā)芽率的影響

不同的老化處理時間下油菜種子的發(fā)芽率變化如圖1所示.從圖1可知，人工老化對黃、黑粒油菜種子的萌發(fā)率影響十分明顯，隨著老化程度的加深，黃、黑粒油菜種子的萌發(fā)率均在明顯下降.其中，人工老化5 d是一個重要拐點，在此之前湘雜油631種子萌發(fā)率損失較為緩慢，而之后則喪失十分迅速.從黃、黑粒種子對老化響應(yīng)曲線可知，黃粒種子萌發(fā)率更容易喪失.人工老化過程中，黃籽的老化比黑籽萌發(fā)率損失速度更快，老化9 d時，黃籽已經(jīng)徹底喪失了萌發(fā)能力，而黑籽萌發(fā)率仍有約21.33%.

老化3 d及未老化處理的黃、黑粒湘雜油631種子超氧陰離子自由基產(chǎn)生速率如圖2所示.從圖2可知，經(jīng)過3 d的人工老化處理后，老化過的黃、黑籽超氧陰離子產(chǎn)生速率要比相應(yīng)的未老化處理的黃、黑籽的稍高，老化黃籽比未老化黃籽高0.006 μmol·min-1·g-1DW，老化黑籽比未老化黑籽高0.008 μmol·min-1·g-1DW，但差別均不明顯.從黃、黑粒種子的比較來看，不管是老化處理過的還是未老化處理過的種子，黃籽的超氧陰離子產(chǎn)生速率要比黑籽的大很多，老化3 d處理過的黃籽要比黑籽高0.23 μmol·min-1·g-1DW，未老化處理的黃籽要比黑籽高0.24 μmol·min-1·g-1DW.

2.3 過氧化氫(H2O2)含量比較

圖2 老化3 d及未老化處理的黃、黑粒湘雜油631

圖3 老化3 d及未老化處理的黃、黑粒湘雜油631

老化3 d及未老化處理的黃、黑粒湘雜油631種子的過氧化氫(H2O2)含量如圖3所示.從圖3可知，人工老化3 d的H2O2含量的提升非常明顯，老化3 d的黃、黑籽相對于未老化處理的黃、黑籽中H2O2含量都偏高，分別提升了約1倍和1.8倍.從黃、黑籽的比較來看，無論老化處理過的還是未老化處理過的，黃籽中H2O2含量要比黑籽高，老化3 d處理的黃籽比黑籽高0.002 9 μmol·g-1DW，未老化處理的黃籽要比黑籽高0.003 4 μmol·g-1DW.2.4 超氧化物歧化酶(SOD)活性比較

老化3 d及未老化處理的黃、黑粒湘雜油631種子的超氧化物歧化酶(SOD)活性如圖4所示.從圖4可知,人工老化處理提高了黃、黑粒種子的SOD活性，老化3 d處理的黃籽比未老化處理的黃籽SOD活性變化高約30%，老化3 d處理的黑籽比未老化處理的黑籽SOD活性變化高約26%，這說明二者在老化過程中SOD活性提升差距不大.從黃、黑籽的比較來看，無論是老化處理過的還是未老化處理過的，黑籽SOD活性要比黃籽SOD活性高，老化3 d處理的黑籽比黃籽高79.12 unit·mg-1protein，未老化處理的黑籽要比黃籽高74.57 unit·mg-1protein.

2.5 過氧化氫酶(CAT)活性比較

圖4 老化3 d及未老化處理的黃、黑粒湘雜油

圖5 老化3 d及未老化處理的黃、黑粒湘雜油

老化3 d及未老化處理的黃、黑粒湘雜油631種子的CAT活性如圖5所示.從圖5可知，老化3 d處理的黃籽比未老化處理的黃籽CAT活性高0.007 μmol H2O2·min-1·mg-1protein，老化3 d處理的黑籽比未老化處理的黑籽CAT活性高0.052 μmol H2O2·min-1·mg-1protein.與前幾個參數(shù)不同的是，老化3 d處理過的黃籽CAT活性要比黑籽CAT活性高，但未老化處理過的黑籽CAT活性要比黃籽CAT活性高，老化3 d處理的黃籽CAT活性比黑籽CAT活性高0.011 μmol H2O2·min-1·mg-1protein，未老化處理的黑籽CAT活性要比黃籽CAT活性高0.007 2 μmol H2O2·min-1·mg-1protein.

2.6 人工老化過程中黃、黑粒湘雜油631種子抗壞血酸(ASA)含量比較

老化3 d及未老化處理的黃、黑粒湘雜油631種子的抗壞血酸(ASA)含量如圖6所示.從圖6可知，經(jīng)過老3 d處理的黃、黑籽ASA含量都要比未老化處理的黃、黑籽的低.老化3 d處理的黃籽比未老化處理的黃籽ASA含量低0.39 μmol AsA·g-1DW，老化3 d處理的黑籽比未老化處理的黑籽ASA含量低0.27 μmol AsA·g-1DW.但不管是老化處理過的還是未老化處理過的，黑籽的ASA含量都要比黃籽的高.老化3 d處理的黑籽ASA含量比黃籽的高0.26 μmol AsA·g-1DW，未老化處理的黑籽ASA含量要比黃籽的高0.15 μmol AsA·g-1DW.

2.7 人工老化過程中黃黑粒湘雜油631種子丙二醛(MDA)含量比較

老化3 d及未老化處理的黃、黑粒湘雜油631種子的丙二醛(MDA)含量如圖7所示.從圖7可知，經(jīng)過老化3 d處理的黃、黑籽MDA含量都要比未老化處理的黃、黑籽的高，但不是很明顯.老化3 d處理的黃籽比未老化處理的黃籽MDA含量高0.403 nmol·g-1DW，老化3 d處理的黑籽比未老化處理的黑籽MDA含量高0.399 nmol·g-1DW.但不管是老化處理過的還是未老化處理過的，黑籽的MDA含量都要比黃籽的稍高.老化3 d處理的黑籽MDA含量比黃籽高0.062 μmol·g-1DW，未老化處理的黑籽MDA含量要比黃籽的高0.066 μmol·g-1DW.

圖6 老化3 d及未老化處理的黃、黑粒湘雜油631

圖7 老化3 d及未老化處理的黃、黑粒湘雜油631

3 結(jié)論與分析

人工老化對湘雜油631黃、黑粒種子的萌發(fā)率有明顯的降低作用，且人工老化5 d為萌發(fā)率喪失的重要拐點.就黃、黑粒的比較而言，人工老化5 d以前二者的萌發(fā)率喪失雖有區(qū)別，但變化的差距不是十分明顯；而在人工老化5 d以后，黃粒種子的萌發(fā)率降低明顯快于黑粒種子.這些結(jié)果說明湘雜油631的黑粒種子比黃粒種子的耐貯性強.

(1)結(jié)合氧化衰老學(xué)說，黑粒種子具有更強的耐貯性的物質(zhì)基礎(chǔ)可能與氧代謝和抗氧化系統(tǒng)有關(guān).黃、黑粒種子超氧陰離子自由基在老化過程中的差異不大，而H2O2的含量則差距明顯，說明黃、黑粒種子活力喪失與H2O2積累及其所帶來的活性氧損傷有關(guān).盡管在脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物MDA含量上，老化狀態(tài)下黃、黑粒湘雜油631種子的差距并不大.但從抗氧化酶系統(tǒng)活性和抗氧化抗壞血酸含量的差距上，可以認(rèn)為較弱抗氧化能力是黃粒種子萌發(fā)率喪失快的直接原因.同時，從抗氧化酶系統(tǒng)活力與非酶抗氧化物質(zhì)的比較上可以認(rèn)為，非酶抗氧化物質(zhì)含量的差距可能是黃、黑粒種子萌發(fā)率喪失差距的主要物質(zhì)基礎(chǔ).

(2)對油菜種子顏色差異的物質(zhì)基礎(chǔ)研究上，比較統(tǒng)一地指向了2類物質(zhì)：一類是多酚，曾盔等[2，16]對芥菜型油菜種皮物質(zhì)化學(xué)成分進行分析，指出多酚物質(zhì)的差別是黃、黑粒種皮顏色差距的物質(zhì)基礎(chǔ)，觀察到黑皮樣品對香草醛變紅色而黃色種皮沒有變色，這表明黃、黑粒種子的多酚在總量上雖差距不大，但在分子結(jié)構(gòu)存在差異；另一類是黃酮，在劉顯軍等[3]的油菜種皮的分子基礎(chǔ)研究中，香草醛染色表明，在發(fā)育中的芥菜型油菜黑籽種皮中含有黃烷3,4-二羥基醇和黃烷4-羥基醇，而黃籽沒有這種物質(zhì).就抗氧化而言，這2類物質(zhì)都是非酶抗氧化物質(zhì)的重要組成部分，筆者對氧代謝變化和抗壞血酸含量的差異上得到了更明顯的驗證，很可能多酚的活性結(jié)構(gòu)和黃烷醇的新成分賦予了黑粒種子更強的抗氧化能力，從而可以維持較高的通用還原力(如抗壞血酸)水平.

(3)湘雜油631黑粒種子的耐貯性強于黃粒種子，其背后的關(guān)鍵機制是黑粒種子中所含非酶抗氧化物質(zhì)強于黃粒種子.所以，黃粒油菜種子的選育固然有利于后期加工，但在種子生產(chǎn)和活力保持的環(huán)節(jié)上則要作更為充分的考慮.

[1] 梁艷麗，梁 穎，李加納，等.甘藍型黃、黑籽油菜種皮特性比較研究[J].中國油料作物學(xué)報，2002，24(4)：14-18.

[2] 曾 盔，劉忠松，嚴(yán)明理，等.芥菜型油菜黃黑種皮色澤特征的分析化學(xué)研究[J].中國油料作物學(xué)報,2006，28(4)：480-483.

[3] 劉顯軍，嚴(yán)明理，袁謀志，等.油菜種皮顏色的分子基礎(chǔ)[C]∥全國植物分子育種研討會摘要集.2004：44-45.

[4] 傅家瑞.種子生理[M].北京：科學(xué)出版社，1985：340-376.

[5] 宋松泉，程紅焱，姜孝成，等.種子生物學(xué)[M].北京：科學(xué)出版社，2008.

[6] 宋松泉，程紅焱，龍春林，等.種子生物學(xué)實驗指南[M].北京：科學(xué)出版社，2005.

[7] ELSTNER E F，HEUPEL A.Inhibition of Nitrite Formation from Hydroxylammonium-Chloride：A Simple Assay for Superoxide Dismutase[J].Analytical Biochemistry，1976，70(2)：616-620.

[8] HUANG A X，SHE X P，CAO B H，et al.Distribution of Hydrogen Peroxide During Adventitious Roots Initiation and Development in Mung Bean Hypocotyls Cuttings[J].Plant Growth Regulation，2011，64(2)：109-118.

[10] JIANG M，ZHANG J.Effect of Abscisic Acid on Active Oxygen Species，Antioxidative Defense System,Oxidative Damage in Leaves of Maize Seedlings[J].Plant Cell Physiol.，2001，42(11):1 265-1 273.

[11] JIANG M，ZHANG J.Water Stress-Induced Abscisic Acid Accumulation Triggers the Increased Generation of Reactive Oxygen Species and Up-Regulates the Activities of Antioxidant Enzymes in Maize Leaves[J].Journal of Experimental Botany，2002，53(379)：2 401-2 410.

[12] DONAHUE J L，OKAPODU M C，CRAMER C.Response of Antioxidants to Paraquat in Pea Leaves[J].Plant Physiol.，1997，113(1)：249-257.

[13] AEBI H E CATALASE.Methods of Enzymatic Analysis[M]∥BERGMEYER H U,Ed.Methods of Enzymatic Analysis. 3rd.Weiheim：Verlag Chmie，1983:273-282.

[14] KAMPFENKEL K，MONTAGUE M V，INZé D.Extraction and Determinationof Ascorbate and Dehydroascorbate from Plant Tissue[J].Analytical Biochemistry，1995，225(1)：165-167.

[15] 趙世杰，許長成，鄒 琦，等.植物組織中丙二醛測定方的改進[J].植物生理學(xué)通訊，1994，30(3):165-167.

[16] 曾 盔，劉忠松，龍 桑，等.芥菜型油菜黃黑種皮多酚差異的紫外-可見光譜研究[J].作物學(xué)報,2007,33(3):476-481.

(責(zé)任編輯 陳炳權(quán))

Storability Differences Between Yellow and Black Seeds of Xiangzayou 631

LI Liang1，2，MI Zezhou1，3，ZHANG Xiang1，3，LI Xiaoming2,TIAN Xiangrong1

(1.Key University Laboratory of Plant Resources Conservation and Utilization (Hunan Province)，Jishou University,Jishou 416000，Hunan China;2.Institute of Agricultural Science，Xiangxi Autonomous Prefecture of Tujia and Miao Minorities，Jishou 416000,Hunan China;3.College of Biology and Environmental Science，Jishou University，Jishou 416000,Hunan China)

To investigate the relationship between seed color and storability，the artificial aged Xiangzayou 631 seeds have been used as materials to study the germination and antioxidative physiological and biochemical variation.Results showed that the germination rate of both yellow and black rape seeds decreased significantly after accelerated artificial aging，and germination of yellow seeds decreased dramatically faster than the black. Superoxide radicle production，contents of hydrogen peroxide and MDA increased by 3d accelerated artificial aging treatment，activities of antioxidative enzyme (SOD and CAT) increased obviously，and the content of AsA declined obviously.The comparison between two color seeds showed superoxide radicle production，hydrogen peroxide contents of the yellow seeds were much higher than those of the black seeds，but the SOD activity and AsA content of yellow seeds were much lower than those of the black seeds.It can be concluded that the black seeds of Xiangzayou 631 possess stronger storability due to greater contents of nonenzymatic antioxidants.

Xiangzayou 631;yellow and black;seeds;storability;difference

1007-2985(2015)04-0048-06

李 亮(1970—)，男，湖南常德人，湘西土家族苗族自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院農(nóng)藝師，主要從事種子評價與推廣研究.

Q945；S351.1

A

10.3969/j.issn.1007-2985.2015.04.013