子宮肉瘤組織中SULT1E1、ERα、ERβ、PRA及PRB的表達(dá)

宋燕，閆大晶，王敏，周瑩瑩，冷旭

子宮肉瘤是一組起源于子宮平滑肌組織、子宮間質(zhì)、子宮內(nèi)組織或子宮外組織的惡性腫瘤，惡性程度高，占子宮惡性腫瘤的2%～4%[1]，其發(fā)病機(jī)制尚不明確，推測(cè)雌激素的長(zhǎng)期刺激可能促進(jìn)其發(fā)生發(fā)展。雌激素的硫酸化是一種重要的雌激素失活方式，而硫酸基轉(zhuǎn)移酶（suifotransferase，SULT）是這一過(guò)程的關(guān)鍵酶。在SULTs家族中的12種同功酶中，SULT1E1蛋白對(duì)雌激素催化作用最強(qiáng)，能夠促進(jìn)水溶性無(wú)活性硫酸化雌激素的形成，可降低循環(huán)及靶組織雌激素暴露水平[2-3]。國(guó)內(nèi)尚缺乏SULT1E1蛋白在子宮肉瘤中表達(dá)方面的報(bào)道，因此，本研究采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連結(jié)法（SP免疫組化法）對(duì)子宮肉瘤及正常子宮肌層組織的SULT1E1蛋白進(jìn)行檢測(cè)，明確SULT1E1、雌激素受體（ERα和ERβ）、孕激素受體（PRA和PRB）在子宮肉瘤及正常子宮肌層組織中的表達(dá)情況，探討其與子宮肉瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系及臨床意義。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 選取2001—2010年中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院（我院）婦科收治的子宮肉瘤患者的石蠟病理切片共46例，其中子宮內(nèi)膜間質(zhì)肉瘤31例，子宮平滑肌肉瘤15例，病理分期均為Ⅱ期以上，手術(shù)行根治性子宮切除術(shù)及盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù)。對(duì)照組為子宮肌瘤患者子宮平滑肌瘤及相應(yīng)肌瘤組織包膜外正常肌層的石蠟病理切片各10例，共20例?；颊吣挲g35～53歲，平均（46.93±4.80）歲。所有患者術(shù)前均未做放化療及激素治療，標(biāo)本均經(jīng)術(shù)后病理確診，均無(wú)卵巢腫瘤、甲狀腺功能亢進(jìn)或減低、糖尿病等并發(fā)癥，手術(shù)時(shí)間為患者月經(jīng)周期的第8～14天，手術(shù)前6個(gè)月未服用激素類藥物。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 ERα、ERβ、PRA及PRB單克隆抗體均為英國(guó)Novocastra公司產(chǎn)品，由泉暉貿(mào)易國(guó)際有限公司提供。兔抗人SULT1E1多克隆抗體、SP免疫組化試劑盒（通用型）及DAB顯色試劑盒（北京博奧森生物技術(shù)有限公司），PHY-Ⅲ病理組織漂烘處理儀（常州中威電子儀器有限公司），IX73-A21PH高分辨率顯微鏡（日本Olympus光學(xué)公司，帶自動(dòng)照相系統(tǒng)），ZT-12P生物組織自動(dòng)脫水機(jī)（湖北省孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司），BMJ-Ⅲ病理組織包埋劑和包埋冷凍臺(tái)（常州中威電子儀器有限公司），其他試劑及儀器由我院中心實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 采用SP免疫組化法分別檢測(cè)標(biāo)本中SULT1E1、ERα、ERβ、PRA 和 PRB 的表達(dá)情況：清洗玻片、防脫片處理后石蠟包埋，之后嚴(yán)格按照SP試劑盒說(shuō)明進(jìn)行切片染色，步驟如下：切片常規(guī)脫蠟水化（二甲苯15 min，二甲苯 15 min，100%乙醇 10 min，95%乙醇 10 min，80%乙醇 10 min，70%乙醇10 min，單蒸水沖洗2遍），后切片入濕盒[加入蒸餾水新鮮配制的3%過(guò)氧化氫（H2O2），室溫孵育20 min，以滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，單蒸水沖洗2遍，磷酸鹽緩沖液（PBS）浸泡5 min]。之后浸入0.01 mol/L枸椽酸鹽緩沖液（pH為6.0）微波修復(fù)抗原，單蒸水沖洗2遍，PBS浸泡5 min，再滴加封閉液（藍(lán)色），室溫靜置15 min，傾去封閉液后直接滴加一抗40℃過(guò)夜，PBS沖洗（3 min×3次），滴加特異性生物素化第二抗體（黃色），37℃溫箱孵育30 min，PBS沖洗（3 min×3次），滴加過(guò)氧化物酶復(fù)合物（紅色）37℃溫箱孵育30 min，PBS沖洗（3 min×3次），最后滴加二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色劑，閉光顯色5～8 min，蘇木素輕度復(fù)染3～5 min，水洗終止染色。切片經(jīng)過(guò)脫水后封片鏡檢。

1.4 結(jié)果判定 依據(jù)Sinicrope改良法進(jìn)行陽(yáng)性判斷，圖片中細(xì)胞核內(nèi)或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有棕黃色顆粒染色者為陽(yáng)性染色細(xì)胞[4]。根據(jù)各個(gè)受體蛋白的表達(dá)情況，以各切片中染色細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)為單位記錄進(jìn)行分級(jí)，0分：染色細(xì)胞＜5%：1分：染色細(xì)胞5%～25%；2分：染色細(xì)胞25%～50%；3分：染色細(xì)胞50%～75%；4分：染色細(xì)胞＞75%。染色強(qiáng)度分為4級(jí)，0分：不顯色；1分：淺黃色；2分：棕黃色；3分：深棕色。每份切片總記分=染色細(xì)胞計(jì)數(shù)分?jǐn)?shù)+染色強(qiáng)度分?jǐn)?shù)，所得分?jǐn)?shù)≤1分為陰性，2～3分為弱陽(yáng)性（+），4～5分為中度陽(yáng)性（++），＞5分為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。+～+++判定為陽(yáng)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。定性資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，資料相關(guān)性采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析。2組獨(dú)立數(shù)據(jù)資料的相關(guān)性進(jìn)行直線相關(guān)分析。各組間比較檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05，組間多重比較時(shí)檢驗(yàn)水準(zhǔn)校正為α′=0.0167。

2 結(jié)果

2.1 各組 SULT1E1、ERα、ERβ、PRA、PRB 蛋白表達(dá)情況 SULT1E1蛋白陽(yáng)性表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，ERα、ERβ、PRA、PRB蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞核中。子宮內(nèi)膜間質(zhì)肉瘤、子宮平滑肌肉瘤的SULT1E1蛋白表達(dá)陽(yáng)性率低于正常子宮肌層，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.0167）。子宮內(nèi)膜間質(zhì)肉瘤和子宮平滑肌肉瘤的ERα蛋白表達(dá)陽(yáng)性率低于子宮平滑肌瘤，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.0167）。子宮平滑肌肉瘤的PRA蛋白表達(dá)陽(yáng)性率低于子宮平滑肌瘤，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.0167）。各個(gè)蛋白在子宮平滑肌瘤與正常子宮肌層組織中的表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。見表1和圖1～5（見后插四）。

2.2SULT1E1與 ERα、ERβ、PRA、PRB 蛋白在子宮肉瘤組織中表達(dá)的相關(guān)性 在子宮內(nèi)膜間質(zhì)肉瘤組織中，SULT1E1與ERα、PRA及PRB之間均存在負(fù)相關(guān)關(guān)系（rs分別為-0.463，-0.389和-0.421，P 分別為0.009，0.031和0.018），與ERβ蛋白不相關(guān)（rs=0.018，P=0.925）；在子宮平滑肌肉瘤組織中，SULT1E1與 ERα、ERβ、PRA、PRB 均無(wú)相關(guān)性（均P＞0.05）。見表 2、3。

2.3 ERα、ERβ、PRA、PRB蛋白在子宮肉瘤組織中表達(dá)的相關(guān)性 在子宮內(nèi)膜間質(zhì)肉瘤組織中，ERα與PRA、PRB呈正相關(guān)；在子宮平滑肌肉瘤組織中，ERα、ERβ、PRA、PRB 之間均無(wú)線性相關(guān)性。見表 4。

3 討論

子宮肉瘤是女性生殖道的一種少見的惡性腫瘤，近年研究發(fā)現(xiàn)，子宮肉瘤的發(fā)生發(fā)展可能與雌、孕激素作用的失調(diào)有關(guān)[5]。而SULT1E1作為催化雌激素硫酸化作用最強(qiáng)的酶[4]，因其可降低循環(huán)及靶組織雌激素暴露水平而備受重視。本研究發(fā)現(xiàn)，SULT1E1與雌、孕激素在不同病理類型的子宮肉瘤中有不同的表達(dá)。

表1 SULT1E1、ERα、ERβ、PRA、PRB蛋白在各組織中的表達(dá)陽(yáng)性率 例（%）

表2 SULT1E1與ERα、ERβ、PRA、PRB蛋白在子宮內(nèi)膜間質(zhì)肉瘤中表達(dá)的相關(guān)性 例

表3 SULT1E1與ERα、ERβ、PRA、PRB蛋白在子宮平滑肌肉瘤中表達(dá)的相關(guān)性 例

表4 ERα、ERβ、PRA、PRB蛋白在子宮肉瘤中表達(dá)的相關(guān)性r（P）

子宮是雌、孕激素的直接靶器官，各種婦科腫瘤的發(fā)生與雌、孕激素水平密切相關(guān)，而雌、孕激素則是通過(guò)結(jié)合其特異性受體（ER、PR）來(lái)發(fā)揮作用的。雌、孕激素受體分別包括兩種亞型，即ERα、ERβ及PRA、PRB，分別發(fā)揮不同的臨床作用。本研究中，ERα蛋白在子宮肉瘤組織中的表達(dá)水平明顯低于正常子宮肌層，這可能是由于腫瘤發(fā)生過(guò)程中，雌激素通路發(fā)生變化，抑或是ERα發(fā)生突變，而突變體有增強(qiáng)野生型受體的作用，反而可能會(huì)導(dǎo)致ERα對(duì)雌激素的反應(yīng)增強(qiáng)甚至失控，從而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生、發(fā)展。因此，ERα的降低可能促進(jìn)正常組織向惡性轉(zhuǎn)化，并在轉(zhuǎn)化過(guò)程中不斷放大雌激素的作用，使信息傳遞通路發(fā)生變化，最終導(dǎo)致癌癥。本研究還發(fā)現(xiàn)，子宮平滑肌肉瘤的PRA表達(dá)陽(yáng)性率低于子宮平滑肌瘤組織（P＜0.0167）。推測(cè)PR變化刺激子宮平滑肌細(xì)胞的惡變可能是導(dǎo)致子宮平滑肌肉瘤發(fā)生的重要因素，從一方面也證明了子宮平滑肌瘤具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)染色體異常和高度干擾的基因調(diào)控[6]。也有研究發(fā)現(xiàn)低分化子宮內(nèi)膜間質(zhì)肉瘤ER和PR表達(dá)陽(yáng)性率較高，而未分化或者高級(jí)別子宮內(nèi)膜間質(zhì)肉瘤則較低[7]。高分化子宮內(nèi)膜間質(zhì)肉瘤的ER、PR表達(dá)陽(yáng)性率顯著低于低分化子宮內(nèi)膜間質(zhì)肉瘤，這可能是由于未分化或高級(jí)別的子宮內(nèi)膜間質(zhì)肉瘤ER和PR表達(dá)率較低所引起的。同樣，王書成等[8]提出子宮內(nèi)膜間質(zhì)肉瘤與平滑肌肉瘤比較ER、PR的表達(dá)有差異，并認(rèn)為ER調(diào)節(jié)過(guò)程的功能完整性有利于PR的合成，支持PR水平由雌激素調(diào)節(jié)的假說(shuō)。

硫酸化反應(yīng)是使性激素失活的重要途徑，而SULT1E1是SULTs家族中對(duì)雌激素硫酸化作用最強(qiáng)的[2-4]。本研究表明，SULT1E1在正常子宮肌層中較高表達(dá)，與子宮肉瘤陽(yáng)性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），與 Reich等[9]研究的 18%的陽(yáng)性率結(jié)果基本相似，表明腫瘤組織中SULT1E1的表達(dá)下調(diào)可能促使局部雌激素濃度增加及活性升高，促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。這與SULT1E1蛋白在子宮內(nèi)膜腺癌組織[10]和卵巢漿液性囊腺癌[11]中低表達(dá)結(jié)果是一致的。本研究發(fā)現(xiàn)SULT1E1表達(dá)降低或缺失可能與子宮肉瘤的形成有一定關(guān)系。推測(cè)在子宮內(nèi)膜間質(zhì)肉瘤組織中，SULT1E1的表達(dá)降低可以導(dǎo)致內(nèi)源性雌激素水平升高，雌激素可上調(diào)PR含量[12]。本研究證實(shí)在子宮內(nèi)膜間質(zhì)肉瘤組織中，PR與ERα蛋白的表達(dá)強(qiáng)度呈正相關(guān)，SULT1E1與ERα、PR間均呈負(fù)相關(guān)，而在子宮平滑肌肉瘤中，SULT1E1與ER、PR卻無(wú)線性相關(guān)性。考慮子宮平滑肌肉瘤的起源不用于子宮內(nèi)膜間質(zhì)肉瘤，有研究表明，子宮內(nèi)膜間質(zhì)肉瘤與雌激素依賴性有關(guān)[13]，推測(cè)在子宮平滑肌肉瘤SULT1E1并不是其重要的致病因素。SULT1E1是雌激素動(dòng)態(tài)平衡的關(guān)鍵酶[14]，但本研究發(fā)現(xiàn)，在子宮肉瘤組織中ERα蛋白含量明顯低于正常肌層組織，由此推測(cè)SULT1E1可能不是調(diào)控子宮肉瘤組織雌激素活性的獨(dú)立因素。另一方面，Kodama等[15]的研究發(fā)現(xiàn)，Pregnane X受體可以抑制SULT1E1的表達(dá)，并進(jìn)一步影響雌激素的滅活，說(shuō)明SULT1E1與ER、PR的作用是相互影響的。

SULT1E1在子宮肉瘤中的研究為子宮肉瘤的病因?qū)W及治療學(xué)的研究提供了新思路。但子宮肉瘤的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多階段、多因素參與的復(fù)雜過(guò)程，故對(duì)SULT1E1與ER、PR的相關(guān)關(guān)系及對(duì)子宮肉瘤發(fā)生、發(fā)展的作用機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。

[1] 樂杰.婦產(chǎn)科學(xué)[M].第7版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2008：276-277.

[2] Cole GB，Keum G，Liu J，et al．Specific estrogen sulfotransferase（SULT1E1）substrates and molecular imaging probe candidates[J]．Proc Natl Acad Sci U S A，2010，107（14）：6222-6227.

[3] Amar D，Berger I，Amara N，et al.The transition of human estrogen sulfotransferase from generalist to specialist using directed enzyme evolution[J].J Mol Biol，2012，416（1）：21-32.

[4] 管睿，鄭唯強(qiáng).硫酸基轉(zhuǎn)移酶家族與婦科腫瘤[J].國(guó)際婦產(chǎn)科學(xué)雜志，2011，38（4）：324-327.

[5] 仲麗美，姜曉晶.子宮肉瘤的臨床研究新進(jìn)展[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)生，2013，51（17）：26-28，34.

[6] 王春麗.子宮平滑肌肉瘤的研究進(jìn)展 [J].當(dāng)代醫(yī)學(xué)，2012，18（10）：18-20.

[7] 靳成娟，殷愛軍.子宮肉瘤發(fā)病相關(guān)因素 [J].現(xiàn)代婦產(chǎn)科進(jìn)展，2014，23（6）：486-488.

[8] 王書成，張霞.雌、孕激素受體與p16蛋白在子宮肉瘤中的表達(dá)[J].河北醫(yī)藥，2013，35（2）：243-244.

[9] Reich O，Singer C，Hudelist G，et al．Estrogen sulfotransferase expression in endometrial stromal sarcomas:an immunohistochemical study[J]．Pathol Res Pract，2007，203（2）：85-87．

[10] 王敏，張傳英，史春雪，等.人雌激素硫酸基轉(zhuǎn)移酶基因在雌激素依賴型子宮內(nèi)膜腺癌組織中的表達(dá)及臨床意義 [J].中國(guó)實(shí)用婦科與產(chǎn)科雜志，2011，27（10）：767-770.

[11] 岳陽(yáng)，王敏，曹蓉，等.雌激素硫酸基轉(zhuǎn)移酶在卵巢漿液性腫瘤組織中的表達(dá)及其臨床意義 [J].中華婦產(chǎn)科雜志，2010，45（5）：381-383.

[12] Pasqualini JR，Gelly C，Lecerf F.Estrogen sulfates:biological and ultrastructural responses and metabolism in MCF-7 human breast cancer cells[J].Breast Cancer Res Treat，1986，8（3）：233-240.

[13] 姚婷婷，林仲秋，張丙忠.子宮內(nèi)膜間質(zhì)肉瘤的研究進(jìn)展[J].國(guó)際婦產(chǎn)科學(xué)雜志，2011，38（6）：554-557.

[14] Xu Y，Liu X，Guo F，et al.Effect of estrogen sulfation by SULT1E1 and PAPSS on the development of estrogen-dependent cancers[J].Cancer Sci，2012，103（6）：1000-1009.

[15] Kodama S，Hosseinpour F，Goldstein JA，et al.Liganded pregnane X receptor represses the human sulfotransferase SULT1E1 promoter through disrupting its chromatin structure[J].Nucleic Acids Res，2011，39（19）：8392-8403.