SUMO-1及ERα在子宮內膜癌中的表達及相關性研究

袁俐，袁夢嵐，陳旭紅，姜忠敏，李艷霞，馬曉芳，劉曉智

子宮內膜癌是女性生殖道常見三大惡性腫瘤之一，其發(fā)病與雌激素的長期持續(xù)刺激有關，其中雌激素受體 α（estrogen receptor alpha，ERα）參與該病的發(fā)生發(fā)展過程，但其具體調控機制尚不明確[1]。小類泛素化修飾蛋白（small ubiquitin-like modifier，SUMO）是近年發(fā)現(xiàn)的一類結構及生成和降解循環(huán)通路均與泛素化蛋白相似，但功能迥異的蛋白質翻譯后修飾蛋白，其通過異肽鍵與靶蛋白共價結合，調控靶蛋白的生物學功能[2]。新近研究發(fā)現(xiàn)，ERα是SUMO-1的確切靶蛋白[3]，但兩者如何在子宮內膜癌發(fā)病過程中發(fā)揮作用尚不知曉。本文通過檢測ERα和SUMO-1在子宮內膜癌中的表達，分析其與患者年齡、組織學病理類型及病理分級的關系，探討兩者在子宮內膜癌發(fā)生、發(fā)展中可能存在的相互協(xié)調作用機制。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集2006年1月—2013年12月天津市第五中心醫(yī)院（我院）病理科初診為子宮內膜癌的腫瘤組織蠟塊共50例，所有患者術前均未經放療、化療或激素治療。另選取35例大致正常及增生的子宮內膜組織作為對照。所有病例HE染色切片均經病理醫(yī)生復查，并就組織類型、壞死、核分裂相等進行特征評估。

1.2 主要試劑 鼠抗人SUMO-1單克隆抗體（美國Abcam公司），兔抗人ERα多克隆抗體及相應二抗（北京中杉生物技術有限公司）；Envision試劑盒及二氨基聯(lián)苯胺（DAB）試劑盒（美國Dako公司）。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學染色 取上述存檔的石蠟組織塊，連續(xù)組織切片，厚5 μm，常規(guī)HE染色及免疫組織化學染色。采用Envison兩步法進行免疫組織化學染色。二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH6.0）中行高壓熱修復，山羊血清37℃封閉30 min；甩去血清，滴加適當稀釋度的抗體工作液（SUMO-1為 1∶1000，ERα 為 1∶200），4℃過夜，順序加入生物素化二抗和辣根酶標記鏈霉卵白素，顯色后蘇木素復染，封片。用已知陽性片和磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）代替一抗分別作為陽性和陰性對照。

1.3.2 結果測定標準 以胞質和（或）胞核內明顯的黃色或棕黃色顆粒為陽性染色。2名病理醫(yī)師獨立觀察，選染色均勻腫瘤區(qū)10個高倍視野，以陽性細胞百分率為判定標準。陽性強度判斷采用兩種計分結合的方法：①選染色均勻腫瘤區(qū)10個高倍視野，以陽性細胞所占的百分比計分（0～3分）：切片中無陽性細胞記0分；陽性細胞率＜25%記1分；陽性細胞率26%～50%記2分；陽性細胞率≥51%記3分。②按染色強度計分（0～3分）：不著色0分；黃色1分；棕黃色2分；黃褐色3分。①和②兩項評分相加，0～1分為陰性（-），2分為弱陽性（+），3～4分為陽性（++），5～6分為強陽性（+++）。

1.3.3 免疫熒光雙染步驟 該部分實驗步驟基本同1.3.1，與1.3.1步驟不同的是以SUMO-1和ERα一抗同時加入代替之前的分別加入，二抗為相應的四甲基異硫氰酸羅丹明（tetramethylrhodamine，TRITC）和異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標記的熒光抗體，抗體稀釋度均為1∶500，以 4′，6-二脒基-2-苯基吲哚 （4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）進行細胞核復染，倒置熒光顯微鏡下觀察，奧林巴斯DP72成像系統(tǒng)采集圖像，觀察細胞共染情況。

1.4 統(tǒng)計學方法 使用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學分析。定量資料正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（x±s）表示。定性資料用率表示，差異性檢驗采用卡方檢驗，一致性分析采用Kappa檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 子宮內膜癌臨床資料 本研究共選取50例確診病例。患者34～69歲，平均（55.7±11.9）歲。絕經前患者17例，絕經后患者33例，絕經年限平均（8.5±3.2）年，最長24年。病理類型：子宮內膜樣腺癌39例，混合性癌8例，透明細胞癌3例。組織學分級：高分化（G1）17例，中分化（G2）22例，低分化（G3）11例。

2.2 免疫組織化學染色結果

2.2.1 2組患者SUMO-1蛋白和ERα蛋白在子宮內膜中的表達 SUMO-1蛋白和ERα蛋白在正常子宮內膜和不同病理分級子宮內膜癌組織中的表達見圖1（見后插三）。SUMO-1蛋白在子宮內膜癌中的陽性表達率高于對照組，而ERα蛋白則相反，2組差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見表1。

表12 組患者SUMO-1蛋白和ER-α蛋白在子宮內膜中陽性表達率比較 例（%）

2.2.2 子宮內膜癌患者SUMO-1蛋白和ERα蛋白表達與臨床病理特征的關系 SUMO-1蛋白在≥55歲的子宮內膜癌患者中的表達明顯高于＜55歲者，而ERα蛋白則相反，2組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；同樣SUMO-1蛋白在絕經后的子宮內膜癌患者中的表達明顯高于未絕經者，而ERα蛋白則相反，2組間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；SUMO-1蛋白的表達隨著子宮內膜癌組織學分級的下降而下降，而ERα蛋白則相反，組間比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；2種蛋白在不同病理類型的患者間的陽性表達率差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），見表2。

表2 子宮內膜癌患者SUMO-1蛋白和ER-α蛋白表達與臨床病理特征的關系 例（%）

2.3 免疫熒光雙染實驗結果

2.3.1 SUMO-1蛋白和ERα蛋白在子宮內膜癌組織中的共表達關系 42例SUMO-1陽性的子宮內膜癌組織中ERα蛋白陽性表達率為88.10%（37/42），8例SUMO-1陰性的子宮內膜癌組織中ERα蛋白陽性表達率為0.00%（0/8）；37例ERα陽性的子宮內膜癌組織中SUMO-1蛋白陽性表達率為100.00%（37/37），13例ERα陰性的子宮內膜癌組織中 SUMO-1蛋白陽性表達率為 38.46%（5/13）。SUMO-1和ERα蛋白在子宮內膜癌組織中共表達的陽性率為74.00%（37/50）。對兩者按照雙向有序且屬性相同的特征進行Kappa檢驗，表明兩者一致性較好（Kappa=0.875，Z=5.473，P=0.001），見表 3。

表3 SUMO-1和ERα蛋白在子宮內膜癌組織中的共表達關系

2.3.2 SUMO-1蛋白和ERα蛋白在中分化子宮內膜癌組織中的共表達定位 在子宮內膜癌組織中SUMO-1蛋白主要定位于細胞核和細胞質，而ER-α蛋白則主要定位于細胞核，見圖2（見后插三）。

3 討論

一般認為，子宮內膜癌根據(jù)其發(fā)病機制和生物學行為特點可分為雌激素依賴型（Ⅰ型）和非雌激素依賴型（Ⅱ型）[4]。雌激素依賴型子宮內膜癌絕大部分為子宮內膜樣癌，少部分為黏液腺癌；非雌激素依賴型子宮內膜癌包括漿液性癌和透明細胞癌等[5]。

在雌激素依賴性子宮內膜癌中，ERα和ERβ均參與子宮內膜癌的發(fā)生、發(fā)展，但是由于ERβ表達于多種組織器官，其功能覆蓋范圍遠遠超出了經典雌激素受體機制范疇[6]。本研究選擇與子宮內膜癌關系密切的ERα為研究對象，研究其與蛋白質翻譯后的修飾因子SUMO的關系。Hilmi等[3]從分子生物學研究角度報道ERα為SUMO-1作用的靶基因，共同參與調節(jié)選擇性雌激素受體下調因子（selective estrogen receptor downregulator，SERD） 的表達和功能。其研究結果表明ERα蛋白被SUMO-1共價結合以后能夠在雌激素水平持續(xù)降低的情況下明顯抵抗雌激素活性。

雖然ERα與SUMO-1的關系密切，但至今未見兩者在子宮內膜癌中表達及功能特點的相關報道。本研究發(fā)現(xiàn)，子宮內膜癌患者SUMO-1蛋白和ERα蛋白陽性表達率在不同年齡、不同絕經狀態(tài)、不同組織學分級的患者中不同，推測可能與低分化子宮內膜腫瘤細胞喪失雌激素生成和分泌功能有關。與此相對比，SUMO-1在正常子宮內膜中表達水平極低（14.29%），但在子宮內膜癌中的陽性表達率明顯升高（84.00%）。通過對子宮內膜癌中SUMO-1和ERα的表達按照雙向有序且屬性相同的特征進行Kappa檢驗，發(fā)現(xiàn)兩者一致性較好。

本研究發(fā)現(xiàn)所有ERα表達陽性的子宮內膜癌均出現(xiàn)SUMO-1的陽性表達，但并非所有SUMO-1表達陽性的子宮內膜癌細胞均伴隨ERα表達陽性。因此認為SUMO-1可能在ERα介導子宮內膜癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮了一定的調節(jié)功能，或者說ERα蛋白發(fā)揮相應的調節(jié)功能均伴隨著SUMO-1的參與調節(jié)，但SUMO-1的功能亦不僅只限于對ERα蛋白的調控，同時可能調控其他多組蛋白質的表達和功能。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)SUMO-1和ERα在子宮內膜癌中存在共表達關系，兩者在子宮內膜癌的發(fā)生和發(fā)展過程中可能發(fā)揮了協(xié)同作用，其具體機制研究將成為我們下一步工作的重點。

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