葉酸代謝基因多態(tài)性與出生缺陷的關(guān)系

羅麗，陳岳明，王賢軍

出生缺陷（birth defects）是指嬰兒出生前發(fā)生的身體結(jié)構(gòu)、功能或代謝異常。隨著我國全民醫(yī)保制度的建立，醫(yī)療技術(shù)水平的明顯提高，孕產(chǎn)婦及新生兒死亡率明顯降低，但出生缺陷問題逐漸凸顯。衛(wèi)生部發(fā)布的《2012年中國出生缺陷防治報告》指出，我國每年新增出生缺陷人數(shù)約90萬[1]。葉酸在DNA合成、甲基化、生長發(fā)育和基因表達(dá)等方面發(fā)揮重要作用?，F(xiàn)就葉酸來源及代謝途徑、代謝相關(guān)基因多態(tài)性與出生缺陷相關(guān)疾病的關(guān)系進(jìn)行系統(tǒng)回顧。

1 葉酸來源及代謝途徑

人類食入的葉酸為葉酸多聚谷氨酸，需在空腸黏膜刷狀緣被水解為葉酸單聚谷氨酸，方能入血[2]。進(jìn)入全身循環(huán)的5-甲基四氫葉酸單聚谷氨酸在細(xì)胞膜還原型葉酸載體-1（reduced folate carrier-1，RFC-1）作用下進(jìn)入細(xì)胞，進(jìn)行胞內(nèi)葉酸循環(huán)代謝，見圖1。由圖1可知亞甲基四氫葉酸還原酶（methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）為胞內(nèi)葉酸代謝的關(guān)鍵酶，其將5，10-亞甲基四氫葉酸（5，10-methylenetetrahydrofolate，5，10-MTHF） 轉(zhuǎn)化為5-甲基四氫葉酸（5-methyl tetrahydrofolate，5-MTHF），為體內(nèi)合成代謝提供甲基。在甲硫氨酸合成酶（methionine synthase，MTR）和依賴維生素B12的甲硫氨酸合成還原酶（methionine synthase reductase，MTRR）共同作用下5-MTHF轉(zhuǎn)化為四氫葉酸（tetrahydrofolate，THF），而相應(yīng)同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）轉(zhuǎn)化為甲硫氨酸（Methionine，Met）。當(dāng)MTHFR酶活性降低，5-MTHF生成減少，同型半胱氨酸轉(zhuǎn)化率降低，體內(nèi)同型半胱氨酸堆積；DNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)甲基化不足，染色體不穩(wěn)定，影響機(jī)體合成代謝，導(dǎo)致疾病發(fā)生[3]。

2 葉酸代謝酶及其編碼基因多態(tài)性

圖1 葉酸吸收代謝途徑

參與葉酸代謝的酶有RFC-1、MTHFR、MTR、MTRR、FOLH1、PCFT、葉酸受體（folate receptor，F(xiàn)R）、胱硫醚β合酶（cystathionine-beta-synthase，CBS）、轉(zhuǎn)鈷氨素蛋白（transcobalamin，TC）等，其途徑中某些酶基因位點(diǎn)變異可能會影響循環(huán)中葉酸水平。

2.1 MTHFR MTHFR是葉酸代謝的關(guān)鍵酶，基因定位于人類染色體1p36.3處，編碼656個氨基酸，相對分子質(zhì)量45，基因組全長15835 bp，包括11個外顯子和10個內(nèi)含子，外顯子長度為99～252 bp，內(nèi)含子長度為192～981 bp[4]。其氨基酸序列高度保守，90%與鼠MTHFR同源。MTHFR有許多位點(diǎn)變異，研究最多的位點(diǎn)是677C＞T和1298A＞C變異。MTHFR 677位點(diǎn)位于第4外顯子上，該位點(diǎn)變異使胞嘧啶（C）被胸腺嘧啶（T）取代，導(dǎo)致丙氨酸變?yōu)槔i氨酸。1298位點(diǎn)位于第7外顯子，該位點(diǎn)變異使腺嘌呤（A）被C取代，則相應(yīng)谷氨酸被丙氨酸替換。這些位點(diǎn)變異導(dǎo)致酶活性及熱穩(wěn)定性降低，阻礙5，10-MTHF轉(zhuǎn)化為5-MTHF，體內(nèi)同型半胱氨酸堆積以致高同型半胱氨酸血癥、高同型半胱氨酸尿及低Met血癥。同型半胱氨酸轉(zhuǎn)化為Met障礙，使得甲基直接供體S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl methionine，SAM）生成減少，體內(nèi)DNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)甲基化不足影響機(jī)體合成代謝及造成染色體不穩(wěn)定。

2.2 MTR MTR是維生素B12依賴性酶，在同型半胱氨酸再甲基化為Met過程中發(fā)揮重要作用。基因定位于染色體1q43處，全長105.2 kb，編碼1265個氨基酸，mRNA全長7122個核苷酸（nt），有33個外顯子和32個內(nèi)含子[5]。同型半胱氨酸結(jié)合在第1～12外顯子區(qū)域，5-MTHF結(jié)合在第13～18外顯子區(qū)域，維生素B12輔基結(jié)合在第19～25外顯子區(qū)域，26～33外顯子區(qū)為MTR活性區(qū)域。該基因2756位點(diǎn)A被鳥嘌呤（G）替代，導(dǎo)致天冬氨酸轉(zhuǎn)化為甘氨酸。MTR 2756A＞G變異致使酶活性降低，同型半胱氨酸轉(zhuǎn)化為Met障礙以及高同型半胱氨酸血癥。

2.3MTRR MTRR協(xié)同維生素B12維持MTR的還原活性，參與體內(nèi)同型半胱氨酸-Met循環(huán)。此酶基因定位于染色體5p15.2～15.3處，基因組全長32021 kb，mRNA長3274 nt，含15個外顯子和14個內(nèi)含子，編碼726個氨基酸。第2外顯子上66位點(diǎn)A被G取代，則相應(yīng)的異亮氨酸轉(zhuǎn)化為Met[6]。MTRR 66A＞G變異不能維持MTR活性，可協(xié)同MTR 2756A＞G阻礙體內(nèi)同型半胱氨酸轉(zhuǎn)化為Met，致同型半胱氨酸增高。

2.4 RFC-1 RFC-1并不直接參與葉酸代謝，卻是5-MTHF轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞內(nèi)的主要機(jī)制。該基因定位于染色體21q22.2～22.3處，其基因組全長22.5 kb，由80～120 ku編碼整個膜蛋白。有8個外顯子，包括5個原始外顯子和3個選擇性表達(dá)的外顯子1（即外顯子1a、1b、1c）[7]。RFC-180位點(diǎn)A替換為G，導(dǎo)致精氨酸被組氨酸取代。Dufficy等[8]研究表明葉酸轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞的量與G等位基因呈負(fù)相關(guān)，RFC-180G等位基因與低葉酸水平一致，但與同型半胱氨酸增高并不完全一致。

3 葉酸缺乏及葉酸代謝基因多態(tài)性相關(guān)的疾病

3.1 NTD 1993—1995年，在我國開展的“中美預(yù)防神經(jīng)管缺損合作項(xiàng)目”中，通過妊娠前每天補(bǔ)充400 μg葉酸降低了NTD的發(fā)生率，可見妊娠前補(bǔ)充葉酸對NTD有明顯的預(yù)防作用。因此，美國在1998年出臺一項(xiàng)公共衛(wèi)生政策——面粉中強(qiáng)制添加葉酸，用以預(yù)防NTD發(fā)生。隨后加拿大、哥斯達(dá)黎加、智利等國也相應(yīng)出臺了添加葉酸預(yù)防NTD的政策。我國在參與“中美預(yù)防神經(jīng)管缺損合作項(xiàng)目”后對育齡女性補(bǔ)充葉酸進(jìn)行廣泛宣教及提供葉酸咨詢服務(wù)等，NTD的發(fā)生率已呈明顯下降趨勢，截至2011年我國NTD的發(fā)生率為4.5/萬。就4.5/萬這一數(shù)據(jù)而言，似乎已經(jīng)接近于葉酸預(yù)防NTD發(fā)生最小值5～6/萬[9]，但我國人口基數(shù)大，發(fā)病總?cè)藬?shù)不容忽視。

多項(xiàng)研究提出，NTD的發(fā)生是多基因及基因與環(huán)境相互作用的結(jié)果。Zhang等[10]的Meta分析指出MTHFR 677C＞T與NTD顯著相關(guān)（OR=1.23，95%CI=1.07～1.42），RFC-180A＞G可能是NTD發(fā)生的危險因素（OR=1.55，95%CI=1.24～1.92）。得出以上結(jié)果的原因在于此篇Meta分析有42篇病例對照研究納入了MTHFR 677C＞T變異，樣本量充足（病例組4374例，對照組7232例），而RFC-180A＞G僅在4篇含1107例患者和1585例對照的研究中涉及。基因之間的相互作用也在Relton等[11]的研究中得到體現(xiàn)，該研究病例組含219例NTD患兒、211例NTD患兒母親及100例NTD患兒父親，對照組含645例健康新生兒母親、602例健康新生兒。他們指出MTHFR 677C＞T是英國北部NTD患兒的危險因素，MTRR 66A＞G為保護(hù)因素，Logistic回歸顯示NTD患兒MTHFR 677T與MTRR 66G聯(lián)合作用增加患病風(fēng)險（P=0.003）；同時母親與NTD患兒間也存在基因相互作用，子代攜帶MTHFR 677C＞T變異與母親攜帶MTRR 66A＞G變異使NTD發(fā)生率顯著增高（P=0.001）。Erdogan等[12]采用與Relton相似的病例對照分組，對土耳其33例NTD患兒、26例NTD患兒母親、48例健康新生兒母親進(jìn)行研究卻得到了不同結(jié)論，MTHFR 677C＞T不能作為NTD發(fā)生的危險因素（P＞0.05）。以上研究主要從DNA水平分析遺傳基因多態(tài)性與NTD關(guān)系，Hansen等[13]另辟蹊徑，從mRNA水平分析MTHFR在NTD形成中的作用，結(jié)果表明MTHFR mRNA表達(dá)水平低下在小鼠胚胎NTD形成中發(fā)揮重要作用。

葉酸代謝途徑基因多態(tài)性分布具有明顯地域或人種差異，針對不同地區(qū)、不同民族人群研究結(jié)論也不盡相同。此外，多基因以及基因與環(huán)境的交互作用與NTD相關(guān)性還需進(jìn)一步深入研究。

3.2 唇裂/腭裂（cleft lip/palate，CL/P） 由于葉酸在預(yù)防NTD發(fā)生方面的突出作用，有學(xué)者推測葉酸同樣可以用于預(yù)防CL/P發(fā)生。

1998年1月，美國在谷物中強(qiáng)化補(bǔ)充葉酸后，發(fā)現(xiàn)其對CL/P的預(yù)防未見顯著成效。加拿大安大略省的一項(xiàng)研究顯示，強(qiáng)化補(bǔ)充葉酸前（1994—1997）較補(bǔ)充葉酸后（1998—2000）CL/P的發(fā)生率稍高但不顯著。智利對比葉酸強(qiáng)化前后差異也未見統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。隨后，Wehby等[14]對CL/P組和對照組采取隨機(jī)雙盲試驗(yàn)，通過補(bǔ)充兩種不同劑量葉酸（0.4 mg或者4 mg），觀察從妊娠前到妊娠后3個月2組體內(nèi)紅細(xì)胞葉酸、血清葉酸、血清同型半胱氨酸的變化，并對妊娠結(jié)局進(jìn)行隨訪。隨訪發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充葉酸0.4 mg組和4 mg組CL/P復(fù)發(fā)率分別為2.9%和2.5%，相比未強(qiáng)化補(bǔ)充前的復(fù)發(fā)率（6.3%）顯著下降（P=0.0009）。

目前葉酸代謝基因多態(tài)性與CL/P的關(guān)聯(lián)尚未得出一致結(jié)論。Estandia-Ortega等[15]對墨西哥城132例CL/P患者和370非CL/P患者的研究指出，母親攝入葉酸能降低CL/P發(fā)生率，同時指出個體攜帶MTHFR 677TT基因型CL/P發(fā)生率降低。MTHFR 677TT型個體體內(nèi)活性5-MTHF水平低，將使CL/P發(fā)生率增高，Estandia-Ortega等MTHFR 677TT使CL/P風(fēng)險降低的說法尚需進(jìn)一步探討。Brandalize等[16]對巴西南部114例CL患兒、110例患兒母親和100例非CL患兒及母親的配對研究認(rèn)為MTHFR、MTR及MTRR基因多態(tài)性均不是CL/P的危險因素。

由于美國、加拿大、智利等國谷物中添加葉酸后CL/P發(fā)生沒有明顯下降，選取研究的病例對照人群中尚未發(fā)現(xiàn)MTHFR 677C＞T使CL/P發(fā)生風(fēng)險增加，因此MTHFR 677C＞T尚不能作為導(dǎo)致CL/P發(fā)生的獨(dú)立風(fēng)險因素。

3.3 先天性心臟病（congenital heart disease，CHD）CHD發(fā)生率遠(yuǎn)高于NTD，鑒于葉酸在預(yù)防NTD發(fā)生中的重要作用，有研究認(rèn)為妊娠期補(bǔ)充葉酸對CHD也有同樣的預(yù)防作用。Li等[17]的Meta分析（19篇含4219例病例和20123例對照）指出，MTHFR 677C＞T多態(tài)性是CHD發(fā)生的風(fēng)險因素（OR=1.26，95%CI：1.06～1.51，P=0.009）。Huang等[18]通過對法樂四聯(lián)癥（tetralogy of Fallot，TOF）患者進(jìn)行病例對照研究指出MTHFR 677TT純合基因型是TOF的危險因素（OR=1.81，95%CI：1.15～2.84，P=0.010）。 有學(xué)者推測，意外妊娠者由于妊娠前未補(bǔ)充葉酸等多種維生素，可能導(dǎo)致胎兒心臟、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常。意外妊娠占女性正常妊娠的50%，其可能導(dǎo)致出生缺陷發(fā)生的數(shù)量不可忽視。補(bǔ)充葉酸能預(yù)防由乙醇、高同型半胱氨酸等引起的CHD。有CHD家族史者建議在妊娠前即服用大劑量葉酸預(yù)防CHD發(fā)生[19]。

由此可見，葉酸及MTHFR 677C＞T多態(tài)性在CHD發(fā)生的作用已較為明確，建議將MTHFR 677TT作為CHD的遺傳危險因素，有CHD史妊娠婦女可通過大劑量補(bǔ)充葉酸提高體內(nèi)葉酸水平，促進(jìn)體內(nèi)合成代謝，促進(jìn)心臟系統(tǒng)發(fā)育完善。

3.4 唐氏綜合征（Down′s syndrome，DS） 葉酸缺乏導(dǎo)致體內(nèi)活性5-MTHF水平低下，甲基直接供體S-腺苷同型半胱氨酸生成減少，DNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等甲基化障礙，染色體不穩(wěn)定性增加。有研究表明低葉酸水平在DS的發(fā)生中發(fā)揮重要作用。

單基因?yàn)镈S發(fā)生的獨(dú)立危險因素在Wu等[20]的Meta分析（28篇病例對照研究包含2806個病例和4597個對照）中得到體現(xiàn)，分析指出亞洲婦女?dāng)y帶MTHFR 677T等位基因增加DS患病風(fēng)險（OR=1.75，95%CI：1.084 ～2.824，P=0.022）， 而 MTHFR 1298A＞C與DS發(fā)生無關(guān)。而Coppedè等[21]找到了另一個相關(guān)基因，即DS兒母親攜帶RFC-180G等位基因，尤其是RFC-180GG純合型母親生育DS患兒的風(fēng)險明顯增加（OR=1.14，95%CI：1.01～1.30，P=0.03；OR=1.27，95%CI：1.04～1.57，P=0.02）。Coppedè等[22]還指出了MTHFR 677TT/RFC-180GG兩者聯(lián)合作用增加DS患病風(fēng)險的可能性（OR=6.0，95%CI=1.0～35.9，P=0.05）。葉酸代謝通路中單基因在DS發(fā)生中的作用在以上2篇Meta分析中有較為肯定的結(jié)論，多基因聯(lián)合作用增加DS發(fā)生風(fēng)險尚需進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)語

綜上所述，葉酸在預(yù)防NTD、CHD、DS方面的作用較明確，葉酸代謝基因MTHFR 677C＞T可能是NTD、CHD、DS發(fā)生的危險因素之一，但葉酸在CL/P發(fā)病方面的作用尚未取得一致結(jié)論，原因可能在于研究樣本大小差異、樣本人群所代表的區(qū)域及不同民族基因型分布差異。就我國而言，南北方飲食差異大，人體葉酸代謝基因多態(tài)性分布差異也大。葉酸不足或缺乏及葉酸代謝基因多態(tài)性只能解釋部分出生缺陷相關(guān)疾病的發(fā)生，尚需在環(huán)境與個體基因多態(tài)性交互作用上綜合分析致病因素。此外，目前大多數(shù)研究集中于關(guān)注葉酸代謝關(guān)鍵酶——MTHFR的基因多態(tài)性，忽視了對葉酸代謝途徑其他代謝酶基因多態(tài)性的相關(guān)性研究。因此，基于代謝途徑上多個酶基因多態(tài)性位點(diǎn)的交互作用研究對出生缺陷的分子遺傳學(xué)診斷可能更有指導(dǎo)意義。

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