PDCD5基因?qū)樸K在裸鼠A549肺癌中療效的協(xié)同作用

梅同華，戴玲麗，張明川

（1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，重慶 400016；2.南昌市第三醫(yī)院呼吸內(nèi)科，南昌 330006；3.重慶市銅梁區(qū)人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，重慶 402560）

PDCD5基因?qū)樸K在裸鼠A549肺癌中療效的協(xié)同作用

梅同華1，戴玲麗2，張明川3

（1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，重慶 400016；2.南昌市第三醫(yī)院呼吸內(nèi)科，南昌 330006；3.重慶市銅梁區(qū)人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，重慶 402560）

目的探討PDCD5基因聯(lián)合順鉑對于裸鼠A549肺癌的治療作用。方法建立裸鼠A549肺癌模型，將25只裸鼠隨機(jī)分為5組（每組5只）：空白對照（N-null）組、脂質(zhì)體-pcDNA3.1（lip-null）組、脂質(zhì)體-PDCD5（lip-PDCD5）組、順鉑（DDP）組和聯(lián)合治療（PDCD5+DDP）組。觀察腫瘤生長情況，繪制腫瘤生長曲線圖；原位TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡情況；免疫組化法及Western blot法檢測PDCD5、bcl-2、survivin蛋白表達(dá)情況。結(jié)果PDCD5+DDP組與lip-PDCD5組或DDP組相比，腫瘤的生長明顯抑制（P＜0.05）。TUNEL結(jié)果顯示，PDCD5+DDP組細(xì)胞凋亡率較lip-PDCD5組或DDP組增高（P＜0.05）。免疫組化及Western blot結(jié)果顯示，lip-PDCD5組和PDCD5+DDP組裸鼠肺癌組織中PDCD5呈高表達(dá)，bcl-2、survivin蛋白呈低表達(dá)，兩者呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。結(jié)論P(yáng)DCD5基因能增強(qiáng)順鉑誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡的敏感性，為肺癌的基因治療提供了一條新策略。

PDCD5；順鉑；肺癌；聯(lián)合治療

肺癌是當(dāng)前高發(fā)病率和高死亡率的惡性腫瘤之一，已成為我國居民的重要死因之一。肺癌的傳統(tǒng)治療包括手術(shù)治療、放射治療和化學(xué)藥物治療。研究表明肺癌早期發(fā)現(xiàn)率僅為15%左右，在診斷時(shí)往往已是中晚期，且有約30%的晚期患者對化療藥物不敏感，以上因素導(dǎo)致肺癌的低生存率［1，2］。因此，越來越多的研究者致力于基因靶向藥物的研究，以提高肺癌治療的有效性。細(xì)胞程序性死亡基因5（programmed cell death 5 gene，PDCD5），原名TFAR-19，是近年來發(fā)現(xiàn)的一個細(xì)胞凋亡正調(diào)控基因，有研究發(fā)現(xiàn)PDCD5可以促進(jìn)凋亡誘導(dǎo)因子發(fā)揮凋亡作用［3，4］。且有研究發(fā)現(xiàn)PDCD5基因可以增加順鉑誘導(dǎo)前列腺細(xì)胞和胃癌細(xì)胞凋亡的敏感性，兩者可能有協(xié)同作用［5，6］。本研究就PDCD5基因協(xié)同順鉑治療非小細(xì)胞肺癌的作用進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 材料

pcDNA3.1-PDCD5重組質(zhì)粒購自北京鼎國生物科技公司；lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司；人肺癌A549細(xì)胞由重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸科實(shí)驗(yàn)室贈送；1640胎牛血清購自美國Gibico公司；Balb/C裸鼠（4～6周齡，雌性）購自重慶醫(yī)科大學(xué)動物中心；順鉑購自美國Selleckchem公司；兔抗人PDCD5多克隆抗體購自英國Abcam公司；bcl-2多克隆抗體、兔抗人β-actin多克隆抗體購自武漢三鷹生物公司；兔抗人survivin抗體購自德國CST公司。免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋公司，原位TUNEL檢測試劑盒購自羅氏公司。

1.2 A549肺癌裸鼠模型的建立及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

體外培養(yǎng)A549細(xì)胞，取對數(shù)期生長的細(xì)胞，以0.25%胰酶消化，用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整濃度至1×107/mL。每只裸鼠右側(cè)背下皮膚接種0.1 mL（每只接種1×106個細(xì)胞）。皮下瘤體積長至50～100 mm3時(shí)進(jìn)行隨機(jī)分組，每組5只，分為空白對照組（N-null組，每只100 μL生理鹽水）、脂質(zhì)體-pcDNA3.1組（lip-null組，每只100 μL脂質(zhì)體-pcDNA3.1復(fù)合物，含10 μg質(zhì)粒）、脂質(zhì)體-PDCD5組（lip-PDCD5組，每組100 μL脂質(zhì)體-PDCD5復(fù)合物，含10 μg質(zhì)粒）、順鉑組（DDP組，DDP 2 mg/kg）和聯(lián)合治療組（PDCD5+DDP組，每只100 μL脂質(zhì)體-pcDNA3.1復(fù)合物，含10 μg質(zhì)粒，DDP 2 mg/kg）。0.9%生理鹽水、脂質(zhì)體-質(zhì)粒復(fù)合物為瘤旁注射，隔日1次，共9次。順鉑為腹腔注射，每3 d 1次，共5次。觀察腫瘤生長情況，治療開始后每隔1 d用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的最長直徑及寬徑，計(jì)算腫瘤體積：V（mm3）=1/6×π×長×寬2。最后一次給藥后1 d處死裸鼠，取腫瘤組織，固定于4%甲醛中，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，組織切片（厚度4 μm）。用作HE染色、免疫組化和原位TUNEL檢測。

1.3 TUNEL法檢測凋亡

按羅氏TUNEL試劑盒實(shí)驗(yàn)步驟操作，光學(xué)顯微鏡下觀察各組細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果判定：凋亡細(xì)胞核呈棕黃色或黃色，符合凋亡特征。隨機(jī)選取5個高倍視野（×400），分別計(jì)算視野中的陽性染色細(xì)胞與細(xì)胞總數(shù)的比例作為凋亡指數(shù)。

1.4 免疫組化

采用S-P法進(jìn)行，PBS稀釋一抗：PDCD5（1∶1 000）、bcl-2（1∶40）和survivin（1∶400）。嚴(yán)格按照S-P試劑盒步驟操作，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片。用已知陽性表達(dá)PDCD5的肺癌組織做陽性對照，用PBS代替一抗做陰性對照。顯微鏡下閱片。結(jié)果判定：由2位以上病理科醫(yī)師閱片，胞質(zhì)和（或）胞核著色棕黃色顆粒為陽性表達(dá)細(xì)胞，每張切片隨機(jī)選取5個高倍視野（×400），共計(jì)數(shù)100個細(xì)胞，按顯色程度和陽性細(xì)胞百分比總和計(jì)分：無色為0分；細(xì)胞百分比＜10%、淡黃色為1分；10%～50%、棕黃色為2分；＞50%、棕褐色為3分。兩者相乘之積為總分，總分≥3為陽性。

1.5 Western blot檢測蛋白表達(dá)

用細(xì)胞裂解液將腫瘤組織中細(xì)胞裂解，提取細(xì)胞總蛋白并進(jìn)行定量，SDS-PAGE凝膠電泳，按抗體說明書比例進(jìn)行一抗、二抗孵育，暗室曝光觀察蛋白表達(dá)情況。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 PDCD5及PDCD5聯(lián)合順鉑對于裸鼠原位瘤的抑制作用

在第14天即注射開始第1天時(shí)，N-null組、lipnull組、lip-PDCD5組、DDP組和PDCD5+DDP組裸鼠的腫瘤體積分別為（104.81±6.30）mm3、（110.76± 5.67）mm3、（110.87±6.35）mm3、（108.88±0.91）mm3和（108.75±1.50）mm3，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。治療后5組裸鼠腫瘤體積分別為（1 296.93±61.44）mm3、（1 272.89±99.24）mm3、（969.06±22.70）mm3、（954.63± 19.63）mm3和（446.40±19.38）mm3，PDCD5+DDP組腫瘤體積較lip-PDCD5組或DDP組明顯減?。≒＜0.05），lip-PDCD5組和DDP組較N-null組或lip-null組腫瘤體積亦顯著減小（P＜0.01）。見圖1。

2.2 TUNEL檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果

N-null組和lip-null組僅見少數(shù)幾個凋亡細(xì)胞，lip-PDCD5組和DDP組可見部分凋亡細(xì)胞，而PDCD5+DDP組凋亡細(xì)胞顯著增多，見圖2。N-null組、lip-null組、lip-PDCD5組、DDP組和PDCD5+DDP組細(xì)胞凋亡指數(shù)分別為（1.72±1.11）%、（1.77± 1.29）%、（3.84±0.98）%、（13.08±1.59）%和（25.33± 4.73）%，PDCD5+DDP組與lip-PDCD5組、DDP組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 免疫組化結(jié)果

圖1 治療開始后裸鼠生長曲線Fig.1 Tumor growth curve after treatment

圖2 TUNEL檢測各組細(xì)胞凋亡結(jié)果 ×400Fig.2 Apoptotic index by TUNEL in each group×400

lip-PDCD5組及PDCD5+DDP組PDCD5蛋白表達(dá)水平明顯高于N-null組、lip-null組和DDP組（P＜0.01）；lip-PDCD5組及PDCD5+DDP組bcl-2蛋白及survivin蛋白表達(dá)水平明顯低于N-null組、lip-null組和DDP組（P＜0.01）；lip-PDCD5組及PDCD5+DDP組與N-null組、lip-null組和DDP組兩兩比較，PDCD5蛋白、bcl-2蛋白及survivin蛋白的表達(dá)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。見表1、圖3。

2.4 Western blot結(jié)果

表1 免疫組化檢測各組PDCD5、bcl?2及survivin蛋白的表達(dá)Tab.1 Immunohistochemical observation of PDCD5，bcl?2 and survivin in each group

lip-PDCD5組及PDCD5+DDP組PDCD5蛋白表達(dá)水平明顯高于N-null組、lip-null組和DDP組；lip-PDCD5組及PDCD5+DDP組bcl-2蛋白及survivin蛋白表達(dá)水平明顯低于N-nul組、lip-null組和DDP組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖4。

3 討論

PDCD5基因是從白血病TF-1細(xì)胞中克隆得到的一個凋亡正調(diào)控基因，低表達(dá)于許多惡性腫瘤，如胃癌、宮頸癌和多發(fā)性骨髓瘤等［7～9］。近來研究發(fā)現(xiàn)在肺癌組織中PDCD5也呈低表達(dá)，且在PDCD5基因上游有一個片段與肺癌的發(fā)病密切相關(guān)［10，11］。在進(jìn)一步的研究中發(fā)現(xiàn)，將PDCD5重組蛋白聯(lián)合依托泊苷、順鉑、卡鉑及長春新堿等化療藥物用于腫瘤細(xì)胞株時(shí)，包括白血病、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等，可以明顯增強(qiáng)以上化療藥物的敏感性［12，13］。由此可知，PDCD5基因可能與肺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，且聯(lián)合化療藥物可發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤的作用。

圖3 免疫組化檢測PDCD5、bcl?2和survivin蛋白表達(dá) ×400Fig.3 Immunohistochemical observation of PDCD5，bcl?2 and survivin in each group×400

圖4 Western blot檢測PDCD5、bcl?2及survivin蛋白表達(dá)Fig.4 Western blot observation of PDCD5，bcl?2 and survivin in each group

因此本研究中我們設(shè)計(jì)了相應(yīng)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：構(gòu)建裸鼠肺腺癌A549模型，設(shè)置N-null組、lip-null組、lip-PDCD5組、DDP組和PDCD5+DDP組進(jìn)行治療。通過繪制腫瘤體積生長曲線可以觀察裸鼠移植瘤抑制情況，從生長曲線圖中可以觀察到PDCD5+ DDP組裸鼠的移植瘤體積較lip-PDCD5或DDP單藥組小，較N-null組則是明顯減?。≒＜0.05），此結(jié)果表明PDCD5重組質(zhì)粒聯(lián)合DDP能夠明顯抑制腫瘤的生長。另外用TUNEL法檢測移植瘤細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示lip-PDCD5和DDP單藥組僅見少數(shù)凋亡細(xì)胞，而PDCD5+DDP組較lip-PDCD5及DDP單藥組比較細(xì)胞凋亡明顯（P＜0.05）。2種實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)PDCD5協(xié)同順鉑可以發(fā)揮明顯的腫瘤抑制效應(yīng)。

目前對于PDCD5增加順鉑化療敏感性的具體機(jī)制尚不明了，近年來的研究提示可能與caspase依賴的細(xì)胞凋亡通路有關(guān)［14］。bcl-2家族是PDCD5促凋亡機(jī)制中一條重要通路，研究指出PDCD5可以通過調(diào)節(jié)bcl-2家族蛋白表達(dá)，影響線粒體轉(zhuǎn)位，最終抑制caspase-3活性來發(fā)揮促凋亡效應(yīng)［14，15］。Chen等［16］研究發(fā)現(xiàn)PDCD5能夠增強(qiáng)順鉑在軟骨肉瘤細(xì)胞中的化療敏感性，在研究中亦發(fā)現(xiàn)其可能是通過上調(diào)bax蛋白和下調(diào)bcl-2蛋白的表達(dá)，進(jìn)一步使caspase-3活性減弱，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞凋亡的。由此可推測PDCD5基因可能是通過調(diào)節(jié)bcl-2家族蛋白的表達(dá)從而實(shí)現(xiàn)對順鉑的增敏作用的。survivin蛋白是凋亡抑制蛋白家族成員，具有非常強(qiáng)的抑制凋亡作用［17，18］。張梅春等［19］利用脂質(zhì)體包裹survivin反義核苷酸轉(zhuǎn)染入A549細(xì)胞中，下調(diào)survivin的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其逆轉(zhuǎn)了細(xì)胞對順鉑誘導(dǎo)凋亡的耐受性，增強(qiáng)了A549細(xì)胞對順鉑的敏感性。在本研究中，我們采用免疫組化方法檢測了PDCD5蛋白及某些腫瘤相關(guān)蛋白的表達(dá)，如bcl-2、survivin等，結(jié)果顯示含PDCD5組PDCD5蛋白高表達(dá)的同時(shí)bcl-2及survivin蛋白呈低表達(dá)，呈負(fù)相關(guān)。結(jié)果提示PDCD5基因可能是通過調(diào)節(jié)bcl-2及survivin基因的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)對順鉑的增敏作用。

本研究提示了PDCD5基因在肺癌治療中與順鉑的協(xié)同作用，且初步探索了其可能機(jī)制，為其用于提高順鉑在肺癌治療中的敏感性奠定了基礎(chǔ)。

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（編輯 陳 姜）

Synergistic Effectsof PDCD5and Cisplatin in Lung Cancer Treatmentin Mice Model

MEITong-hua1，DAILing-li2，ZHANG Ming-chuan3

（1.Department of Respiratory Medicine，The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China；2.Department of Respiratory Medicine，The Third Hospital of Nanchang，Nanchang 330006，China；3.Department of Respiratory Medicine，Tongliang People’s Hospital of Chongqing，Chongqing 402560，China）

Objective To determine the antitumor effects of PDCD5recombinant plasmid in combination with cisplatin in lung carcinoma models.MethodsA549 lung cancernude mice model was established，and then the 25 mice were randomly divided into five groups.The tumorvolume was calculated and a tumor growth curve was recorded.The apoptosis rates were measured by TUNEL.The expression of PDCD5 and tumor-associated protein were examined by immunohistochemistry method.ResultsThe apoptosis rates of the A549 cells transfected by PDCD5recombinant plasmid were significantly higher than other groups（P＜0.05）.Mouse treated with PDCD5 and DDP showed more effective tumor inhibition（P＜0.05）. TUNEL analysis of tumors exhibited that PDCD5 in combination with cisplatin led to an increased rate of apoptosis（P＜0.05）.Mouse treated with PDCD5 had an higher expression of PDCD5 protein and lower expression of bcl-2 and survivin protein than other groups（P＜0.05）.ConclusionOur study demonstrated that PDCD5gene sensitizes A549 cellsto cisplatin-induced apoptosis，and provide a new strategy for gene therapy.

PDCD5；cisplatin；lung cancer；combination therapy

R734.2

A

0258-4646（2015）11-1002-04

江西省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（20121BBG70053）

梅同華（1954-），女，主任醫(yī)師，本科.

戴玲麗，E-mail：dailingli13@126.com

2015-03-03

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：