新生大鼠缺血缺氧性腦白質(zhì)損傷腦組織形態(tài)學(xué)的動態(tài)演變

程童菲，富建華，薛辛東

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院第一新生兒科，沈陽 110004）

新生大鼠缺血缺氧性腦白質(zhì)損傷腦組織形態(tài)學(xué)的動態(tài)演變

程童菲，富建華，薛辛東

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院第一新生兒科，沈陽 110004）

目的建立新生大鼠缺血缺氧（HI）腦白質(zhì)損傷模型，模擬早產(chǎn)兒HI腦白質(zhì)損傷，闡明少突膠質(zhì)細(xì)胞及髓鞘發(fā)育在腦組織HI中的動態(tài)演變過程。方法將3日齡新生大鼠隨機(jī)分為HI組（n=40）和對照組（n=40），HI組結(jié)扎右側(cè)頸總動脈后低氧2 h（8%氧氣）；對照組不結(jié)扎僅分離右側(cè)頸總動脈，也不給予低氧處理。實驗后l、3、7、14、21 d分別檢測體質(zhì)量及腦質(zhì)量的變化；HE染色觀察腦組織形態(tài)學(xué)改變，透射電鏡觀察少突膠質(zhì)細(xì)胞及髓鞘的超微結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果HI組實驗后3、7 d時體質(zhì)量及腦質(zhì)量的增長明顯落后于對照組（P＜0.01），14、21 d時HI組與對照組相比無明顯差異（P＞0.05）；HE染色發(fā)現(xiàn)HI組實驗后3 d時大量腦組織變性壞死形成小空洞，并通過透射電鏡發(fā)現(xiàn)3、21 d時HI組少突膠質(zhì)細(xì)胞壞死、髓鞘內(nèi)小空泡形成及板層結(jié)構(gòu)松懈。結(jié)論HI致腦白質(zhì)損傷后，新生大鼠生長發(fā)育延遲，少突膠質(zhì)細(xì)胞及髓鞘發(fā)育障礙。

缺血缺氧；腦白質(zhì)損傷；少突膠質(zhì)細(xì)胞；髓鞘；早產(chǎn)兒

早產(chǎn)兒腦白質(zhì)損傷是新生兒腦白質(zhì)損傷的重要表現(xiàn)形式，而缺血缺氧（hypoxia-ischemia，HI）是造成早產(chǎn)兒腦白質(zhì)損傷的最主要原因［1］。由于早產(chǎn)兒大腦發(fā)育尚未成熟，對HI損傷更為敏感［2］。隨著近幾年極低出生體重兒（very low birth weight，VLBW）和超低出生體重兒（extremely low birth weight， ELBW）的存活率逐漸增加，其遠(yuǎn)期生存質(zhì)量已越來越受到關(guān)注。在國外，10%的VLBW將發(fā)展為腦癱，在我國，25%～50%的VLBW將發(fā)展為行為及認(rèn)知功能障礙，且66%以上發(fā)生腦癱［3］。因此，本研究擬采用新生大鼠HI腦白質(zhì)損傷模型模擬早產(chǎn)兒HI腦白質(zhì)損傷，探討少突膠質(zhì)細(xì)胞及髓鞘發(fā)育在腦組織HI中的動態(tài)演變過程，并了解早產(chǎn)兒HI性腦白質(zhì)損傷對腦組織的結(jié)構(gòu)、少突膠質(zhì)細(xì)胞及其髓鞘化的重要影響，以期為治療和預(yù)防早產(chǎn)兒HI性腦白質(zhì)損傷、減少遠(yuǎn)期并發(fā)癥提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：選取孕21～23 d母鼠自然分娩的3日齡Sprague-Dawley（SD）大鼠80只，體質(zhì)量8.5～10 g，雌雄不限。實驗動物由中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院實驗中心動物部提供。

1.1.2 分組：將3日齡SD大鼠隨機(jī)分為HI組和對照組，每組40只。按照Mizuno等［4］的新生大鼠HI模型制備方法，給予HI組3日齡SD大鼠吸入性乙醚麻醉，仰臥位，碘伏消毒后，顯微鏡下在頸部緊貼氣管右側(cè)做縱行0.5～1.0 cm切口，用7/0一次性縫合線結(jié)扎右側(cè)頸總動脈，在結(jié)扎的兩端之間將動脈剪斷，防止結(jié)扎線脫落缺血不徹底，縫合切口，表皮用生理鹽水清洗干凈，術(shù)后將新生鼠放入低氧箱2 h（92%氮氣和8%氧氣混合氣體）；對照組僅分離右側(cè)頸總動脈，不結(jié)扎也不給予低氧處理。手術(shù)完成后，返回母鼠身邊飼養(yǎng)。2組大鼠均于術(shù)后1、3、7、14、21 d處死并取腦組織。

1.2 方法

1.2.1 HI后新生大鼠體質(zhì)量及腦質(zhì)量的改變：在實驗第1、3、7、14、21天分別測量2組新生大鼠的體質(zhì)量。然后，給予異氟烷吸入性麻醉，局部消毒后切開腹部，依次打開腹腔、橫膈、胸腔，暴露心臟，用4%多聚甲醛灌注心臟，見血液流出，直至流出清亮液體為止。開顱取腦，測量腦質(zhì)量。

1.2.2 HE染色觀察HI后大鼠腦組織形態(tài)學(xué)的改變：給予大鼠乙醚吸入麻醉，心臟灌注處死，于視交叉為中心前后2 mm取組織，4%多聚甲醛固定腦組織24 h，梯度乙醇脫水，浸蠟，包埋，連續(xù)冠狀切片，片厚5 μm，行HE染色。每組動物各時間點隨機(jī)抽取6張，每張切片光鏡下（×400）隨機(jī)選取5個腦室周圍腦白質(zhì)視野觀察病理改變。

1.2.3 透射電鏡觀察HI后大鼠少突膠質(zhì)細(xì)胞及髓鞘超微結(jié)構(gòu)的改變：取腦組織于2.5%的戊二醛4℃浸泡固定24 h，1%鋨酸固定，丙酮脫水，環(huán)氧樹脂包埋，制成超薄切片，醋酸雙氧鈾及硝酸鉛雙重染色后，在JEM-1200Ex透射電鏡（Hitachi Electronic Company，日本）下觀察少突膠質(zhì)細(xì)胞、髓鞘的超微結(jié)構(gòu)（×25 000）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)以表示。組內(nèi)各時間點差異用LSD-t檢驗進(jìn)行比較分析，各組間差異采用兩因素方差分析（two-way ANOVA）進(jìn)行比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HI后新生大鼠生長發(fā)育落后

2.1.1 HI后新生大鼠體質(zhì)量的改變：與對照組相比，HI組各個時間點大鼠的體質(zhì)量明顯降低，且在術(shù)后第1、3、7天體質(zhì)量增長緩慢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；7 d后，HI組大鼠出現(xiàn)較明顯的生長追趕，在第14、21天，HI組的體質(zhì)量較對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

2.1.2 HI后新生大鼠腦質(zhì)量的改變：與對照組相比，HI組各時間點大鼠的腦質(zhì)量明顯減輕，術(shù)后第3、7天時HI組腦質(zhì)量增長滯后，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），但是隨后的第14、21天時，HI組腦質(zhì)量發(fā)生明顯生長追趕，HI組的腦質(zhì)量較對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。

表1 2組新生大鼠HI前后體質(zhì)量的比較Tab.1 Comparison of the body weights of each group before and after HI

表1 2組新生大鼠HI前后體質(zhì)量的比較Tab.1 Comparison of the body weights of each group before and after HI

Group 1 d 3 d 7 d 14 d 21 d HI group 9.11±0.24 10.00±0.22 16.95±0.54 37.04±0.50 45.49±1.33 Control group 11.29±0.42 14.97±0.37 24.65±0.22 40.42±0.92 51.42±1.24 t 7.50 10.55 9.57 0.83 0.09 P＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＞0.05 ＞0.05

2.2 HI后腦組織形態(tài)學(xué)改變

對照組各時間點腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞分布均勻、密集，腦組織輪廓清晰（圖1A～1E）；HI組1 d時僅有少量的細(xì)胞核固縮，發(fā)生細(xì)胞凋亡（圖1F）；而HI組3 d時在腦室周圍損傷部位可見大量細(xì)胞發(fā)生核固縮后細(xì)胞壞死，腦組織結(jié)構(gòu)疏松軟化，存在大量的腦白質(zhì)囊性壞死區(qū)及空洞（圖1G，箭頭所示為細(xì)胞變性壞死后的核固縮）；HI組第7、14、21天與第3天相比，細(xì)胞分布逐漸密集，囊性壞死區(qū)域也相對減少，篩網(wǎng)狀壞死區(qū)逐漸消失，轉(zhuǎn)變?yōu)榇貭罨螯c狀壞死，但仍存在一些核固縮及細(xì)胞液化壞死后形成的小空洞（圖1H～1J）。

表2 2組新生大鼠HI前后腦質(zhì)量的比較Tab.2 Comparison of the brain weights of each group before and after H（I

表2 2組新生大鼠HI前后腦質(zhì)量的比較Tab.2 Comparison of the brain weights of each group before and after H（I

Group 1 d 3 d 7 d 14 d 21 d HI group 0.33±0.04 0.40±0.02 0.54±0.01 0.86±0.01 1.17±0.01 Control group 0.31±0.02 0.45±0.02 0.62±0.02 0.91±0.01 1.20±0.02 t 0.25 3.87 14.52 0.05 0.00 P＞0.05 ＜0.01 ＜0.01 ＞0.05 ＞0.05

2.3 HI后腦組織超微結(jié)構(gòu)的變化

圖1 HI導(dǎo)致腦組織結(jié)構(gòu)變化 HE染色×400Fig.1 Malacotic periventricular brain tissues caused by hypoxia?ischemia HE×400

2.3.1 HI少突膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育障礙：對照組少突膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)規(guī)則，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整，核膜明顯，胞核大而清晰，核內(nèi)染色質(zhì)豐富且分布均勻（圖2A、2C）。與對照組相比，HI組3 d時少突膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)極其不規(guī)則，結(jié)構(gòu)明顯異常，核膜破損不清晰，胞核模糊不清，大量細(xì)胞壞死（圖2B）。HI組21 d時細(xì)胞形態(tài)異常，有的甚至細(xì)胞核結(jié)構(gòu)消失，發(fā)生核溶解，核染色質(zhì)濃縮、異染，少突膠質(zhì)細(xì)胞壞死（圖2D）。

2.3.2 HI髓鞘成熟障礙：對照組髓鞘形態(tài)清晰，板層之間結(jié)構(gòu)致密，髓鞘內(nèi)可見正在發(fā)育中的軸突（圖3A、3D，箭頭所示為軸突）。HI組髓鞘結(jié)構(gòu)明顯異常，HI組3 d時髓鞘內(nèi)大量小空泡形成，呈篩網(wǎng)狀改變，髓鞘發(fā)育明顯障礙（圖3B、3C）；HI組21 d時髓鞘結(jié)構(gòu)仍存在明顯異常，可見板層之間結(jié)構(gòu)疏松，有的甚至出現(xiàn)明顯分層現(xiàn)象（圖3E、3F）。

圖2 透射電鏡下觀察HI對少突膠質(zhì)細(xì)胞的影響 ×25 000Fig.2 Observation of the effects of hypoxia?ischemia on oligodendrocytes under transmission electron microscopy×25 000

3 討論

早產(chǎn)兒腦白質(zhì)損傷已成為嚴(yán)重影響早產(chǎn)兒遠(yuǎn)期生存質(zhì)量的最常見疾病之一。盡管早產(chǎn)兒腦白質(zhì)損傷的病因復(fù)雜，如炎性因子的異常分泌、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、氧自由基的損傷作用及血流動力學(xué)特點等，但HI是引起早產(chǎn)兒腦白質(zhì)損傷的主要病因。模擬早產(chǎn)兒腦白質(zhì)損傷，并了解HI對生長發(fā)育及腦組織的損傷至關(guān)重要。進(jìn)一步研究早產(chǎn)兒腦白質(zhì)損傷機(jī)制，為其治療和預(yù)防提供新靶點是目前亟待解決的問題。

研究認(rèn)為，出生5～7 d大鼠的腦發(fā)育程度相當(dāng)于足月新生兒的腦發(fā)育程度［5］，而生后2～5 d的新生鼠的神經(jīng)發(fā)育相當(dāng)于人類早產(chǎn)兒胎齡28～32周［6］，這與人類早產(chǎn)兒腦白質(zhì)損害發(fā)生的時間窗一致，在病理、臨床表現(xiàn)方面與早產(chǎn)兒腦白質(zhì)損傷十分相似。因此，本研究采用HI致3日齡新生大鼠腦白質(zhì)損傷的動物模型研究HI對新生大鼠少突膠質(zhì)細(xì)胞及髓鞘發(fā)育的影響。早產(chǎn)兒腦白質(zhì)損傷好發(fā)于早產(chǎn)兒髓鞘形成的高峰期［7］，該時期新生大鼠腦組織富含晚期少突膠質(zhì)前體細(xì)胞（oligodendrocyte precursor cells，OPCs），約占少突膠質(zhì)細(xì)胞90%，OPCs將進(jìn)一步發(fā)育成包裹軸突的髓鞘。OPCs對HI高度敏感［8］，若新生大鼠在生后2～5 d受到HI等因素刺激，髓鞘化將無法完成，從而導(dǎo)致腦白質(zhì)損傷發(fā)生［9］。目前，少突膠質(zhì)細(xì)胞是HI性腦白質(zhì)損傷的主要靶細(xì)胞［10］，早產(chǎn)兒生后髓鞘尚未完全沉積，HI對發(fā)育期OPCs的損傷是導(dǎo)致早產(chǎn)兒腦白質(zhì)損傷嚴(yán)重后遺癥腦癱的主要原因［11］。因此，本研究利用新生大鼠HI模型模擬了早產(chǎn)兒腦白質(zhì)的損傷過程。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HI后早期新生大鼠體質(zhì)量及腦質(zhì)量的增長均較對照組遲緩，尤其在實驗后第3、7天，生長發(fā)育明顯落后于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），但在后期存在一定程度的生長追趕現(xiàn)象。雖然實驗后第14、21天，2組大鼠的體質(zhì)量及腦質(zhì)量的差異在統(tǒng)計學(xué)上無意義，但大腦內(nèi)部的損傷已經(jīng)形成。本研究還發(fā)現(xiàn)HI后新生大鼠腦組織結(jié)構(gòu)疏松，鏡下呈疏松網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，組織排列紊亂，大量腦細(xì)胞變性壞死后形成小空洞，說明HI對腦組織存在嚴(yán)重的破壞作用。術(shù)后第1天，大鼠腦組織開始發(fā)生變化，隨著時間推移，腦組織損傷越來越明顯，雖然后期有一定的好轉(zhuǎn)，空洞數(shù)量減少（猜測可能與小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖有關(guān)，具體原因不明），但是空洞的面積較前擴(kuò)大，與Cai等［12］的研究結(jié)果一致。這種腦白質(zhì)的改變將影響腦細(xì)胞及髓鞘的進(jìn)一步發(fā)育成熟。

本研究中，透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)HI后少突膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊不清，胞核溶解后細(xì)胞壞死，甚至有的輪廓已經(jīng)消失。然而對照組少突膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，胞核大而飽滿，且核膜清晰可見。導(dǎo)致腦白質(zhì)損傷的關(guān)鍵是少突膠質(zhì)細(xì)胞的損傷，因少突膠質(zhì)細(xì)胞占據(jù)了腦白質(zhì)的大部分，對大腦的能量代謝、分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子及促進(jìn)神經(jīng)元的發(fā)育非常重要。透射電鏡還觀察到HI組髓鞘內(nèi)小空泡形成及板層結(jié)構(gòu)松懈，而對照組髓鞘發(fā)育良好，板層致密，且對照組在21 d時被髓鞘包裹的軸突清晰可見。HI致少突膠質(zhì)細(xì)胞的損傷主要影響髓磷脂的產(chǎn)生，從而使髓鞘化延遲［13］，最終導(dǎo)致腦白質(zhì)的損傷。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，HI致腦白質(zhì)損傷后，新生大鼠生長發(fā)育延遲，少突膠質(zhì)細(xì)胞及髓鞘發(fā)育障礙。但是HI后髓鞘的損傷能否再次進(jìn)行修復(fù)尚不清楚，仍有待于進(jìn)一步研究探討。

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（編輯 王又冬）

Dynamic Evolution Process of Brain Tissue Morphology in A Rat Model with Neonatal White Matter Damage Induced by Hypoxia-ischemia

CHENGTong-fei，F(xiàn)UJian-hua，XUE Xin-dong

（Department of Pediatrics，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China）

ObjectiveTo establish a hypoxia-ischemia（HI）ratmodel forneonatal white matterdamage（WMD）and simulate WMDin premature infants，so as to observe the changes of morphology and ultrastructure in the brain tissues and clarify dynamic evolution process of the development of oligodendrocytes（OLs）and myelin in HI brain tissue.MethodsEighty newborn rats（3-day-old）were randomly divided into HI group（n=40）and control group（n=40）.Animals in the HI group were subjected to ligation of the right carotid artery，followed by 8%oxygen delivery for 2 h，while rats in the control group were only subjected to isolation of the right carotid artery，without exposure to hypoxia.The changes of body and brain weight were recorded on day 1，3，7，14 and 21，respectively.The changes of morphology in the brain tissues were observed by Hematoxylin and eosin（HE）staining，and the changes of ultrastructure in OLs and myelin were also determined.ResultsThe growth of body weight and brain weight of day 3，7 in HI group obviously lagged behind that of the control group（P＜0.01）；there was no obvious difference at day 14 and day 21 between the HI group and control group（P＞0.05）.In HI group，the focus of necrosis was observed in a high number of cells of brain tissues，along with a cribriform change at day 3 by HE staining.OLs necrosis，myelin with a large number of small vacuoles and a loose structure were observed on day 3 and 21.ConclusionRats with neonatal WMD grow slower than the control，and the development and maturation of OLs and myelin are impaired.

hypoxia-ischemia；white matter damage；oligodendrocytes；myelin；premature infants

R722.6

A

0258-4646（2015）11-0987-05

程童菲（1986-），女，醫(yī)師，碩士.

薛辛東，E-mail：xuexd@sj-hospital.org

2015-02-22

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