瘦素缺陷型ob/ob小鼠和C57BL/6J小鼠生物學(xué)特性的對比研究

薛欣，李玉梅，陳冰，張立石，馬雅鑾，汪旭

（1.中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所實驗中心，北京 100700；2.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)鏡診療科，沈陽 110001）

瘦素缺陷型ob/ob小鼠和C57BL/6J小鼠生物學(xué)特性的對比研究

薛欣1，李玉梅1，陳冰1，張立石1，馬雅鑾1，汪旭2

（1.中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所實驗中心，北京 100700；2.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)鏡診療科，沈陽 110001）

目的對比瘦素基因遺傳缺陷ob/ob小鼠與C57BL/6J野生型小鼠的生物學(xué)特征，為進(jìn)一步的中藥研究提供可靠的脂肪肝動物模型。方法將8周齡、雌性C57BL/6J野生型及ob/ob小鼠分別作為對照組和模型組，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)至16周。每周測量1次體質(zhì)量和體溫；檢測血清肝功能（天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶）和血脂（總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白）含量；檢測肝質(zhì)量、肝組織中總膽固醇、甘油三酯含量，并進(jìn)行肝組織HE染色。結(jié)果與C57BL/6J野生型小鼠比較，ob/ob小鼠體質(zhì)量顯著增加（P＜0.000 1）；肛溫明顯降低（P＜0.001）；血脂總膽固醇、高密度脂蛋白、肝重、肝臟指數(shù)、肝功能、肝組織中總膽固醇、甘油三酯含量明顯增高（P均＜0.01）。大體及組織病理結(jié)果顯示，16周ob/ob小鼠肝臟表現(xiàn)為中、重度脂肪肝的病理特征。結(jié)論ob/ob小鼠是較好的非酒精性脂肪性肝病動物模型，具有發(fā)病快、穩(wěn)定、顯著、重復(fù)性高等特點。

ob/ob小鼠；非酒精性脂肪性肝??；生物學(xué)特性；瘦素基因遺傳缺陷

非酒精性脂肪性肝?。╪onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）已經(jīng)成為危害人類健康的常見慢性肝病之一，在我國NAFLD患病率有逐年上升的趨勢［1］。NAFLD與代謝綜合征、2型糖尿病、心腦血管等疾病的發(fā)病密切相關(guān)，合適的脂肪肝動物模型在NAFLD的發(fā)病機(jī)制研究、預(yù)防、治療及藥物開發(fā)過程中發(fā)揮極其重要的作用。目前應(yīng)用的脂肪肝動物模型以大鼠高脂模型為主，但其造模時間長、成本高。瘦素基因遺傳缺陷ob/ob小鼠是用于研究人類NAFLD的動物模型之一。本研究通過對瘦素基因遺傳缺陷ob/ob小鼠與C57BL/6J野生型小鼠的部分生物學(xué)特征、生理生化指標(biāo)進(jìn)行對比研究，為該小鼠在NAFLD研究中的應(yīng)用提供參考及基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：瘦素基因遺傳缺陷ob/ob小鼠及野生型C57BL/6J小鼠各10只，8周齡，雌性，購自南京鵬晟生物科技發(fā)展有限公司［SCXK（蘇）2009-0001］；在中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所清潔級動物室喂養(yǎng)，實驗動物室許可證號SYXK（京）2005-0024。動物室溫度20～25℃，濕度65%～75%，通風(fēng)良好。2組小鼠均以標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)、自由飲水。1.1.2 主要試劑：總膽固醇測定試劑盒（COD-PAP法）、甘油三酯測定試劑盒（GPO-PAP法）購自中生北控生物科技股份有限公司，批號分別是201301131491、201301135901。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組與造模：分為2組，C57BL/6J野生型小鼠為對照組，瘦素基因遺傳缺陷ob/ob小鼠為模型組。2組小鼠從8周標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)至16周。

1.2.2 生存狀態(tài)觀測：每周測體質(zhì)量、肛溫，并觀察小鼠外觀、行為、飲食、糞便、毛發(fā)及死亡情況等一般指標(biāo)。

1.2.3 生化檢測：第16周時將小鼠禁食不禁水12 h，小鼠摘眼球取血、分離血清。血清天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）、低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）的含量在首都醫(yī)科大學(xué)臨床檢測中心用全自動生化分析儀（日本Olympus 2700）檢測，測定方法按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.4 肝臟相關(guān)指標(biāo)檢測：（1）處死小鼠并剖開腹腔，肉眼觀察肝臟的形態(tài)、大小、色澤等。（2）分離肝組織，生理鹽水沖洗、吸干后稱取肝濕重，計算肝臟指數(shù)，肝臟指數(shù)（%）=肝濕重/體質(zhì)量×100。（3）肝組織TC、TG含量檢測：取50 mg肝組織，加入2 mL氯仿/甲醇（體積比為2∶1）進(jìn)行肝組織勻漿，將肝組織勻漿液封閉、置于旋轉(zhuǎn)式搖床過夜；加入2 mL 0.6%氯化鈉溶液，振蕩混勻，3 000 r/min離心10 min，取下層有機(jī)相，置于45℃金屬浴上，并用氮氣吹干后再溶于500 μL異丙醇中，振蕩混勻。肝組織TC或TG含量的測定參照試劑盒操作說明。（4）肝組織病理HE染色：取肝組織，浸泡于4%多聚甲醛中固定、脫水、石蠟包埋、切片，行蘇木素－伊紅（hematoxylin and eosin，HE）染色，光鏡下觀察小鼠肝臟病變。判斷標(biāo)準(zhǔn)參見中華肝病學(xué)會脂肪肝和酒精性肝病學(xué)組制定的《非酒精性脂肪性肝病診療指南》（2010年修訂版）［2］。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 11.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料用表示，組間比較使用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般狀態(tài)觀察

ob/ob小鼠與同周齡的野生型小鼠相比，體形明顯胖大、活動減少、排尿量增多，排便量無明顯差別。2組小鼠皮毛均烏黑亮澤，五官無異常分泌物，皮膚、呼吸均正常。

2.2 體質(zhì)量、肛溫、肝重、肝臟指數(shù)的比較

與野生型小鼠比較，ob/ob小鼠體質(zhì)量顯著增加（P＜0.000 1），增高約2.3倍，肝重、肝臟指數(shù)亦明顯增加（均P＜0.000 1），肛溫較明顯降低（P＜0.001），見表1。

表1 2組小鼠生理、生化指標(biāo)的比較Tab.1 Comparison of physiological and biochemical indexes of WT and ob/ob mice

2.3 肝脂、肝功能的比較

與野生型小鼠比較，ob/ob小鼠肝組織中TC、TG含量明顯增高（均P＜0.01），血清中AST、ALT含量亦顯著增加（均P＜0.001）。說明ob/ob小鼠肝組織脂肪堆積的同時，肝細(xì)胞受損明顯。見表1。

2.4 血脂（TC、TG、HDL、LDL）的比較

與野生型小鼠比較，ob/ob小鼠血清中TC、HDL（均P＜0.000 1）明顯增高，TG、LDL略有升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。見表1。

2.5 肝臟病理形態(tài)學(xué)的比較

肉眼觀察，野生型小鼠肝臟外觀呈紅褐色，表面光滑，邊緣銳利，質(zhì)軟有彈性；ob/ob小鼠肝臟呈棕黃色、腫大包膜稍緊、邊緣圓鈍，切面有油膩感（圖1）。光鏡下，野生型小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)正常，以中央靜脈為中心細(xì)胞索排列整齊，肝竇正常，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰、胞質(zhì)豐富、核圓位于中央。ob/ob小鼠肝小葉難辨認(rèn)，肝索紊亂，肝細(xì)胞腫脹、胞質(zhì)疏松、核被擠向邊緣，胞質(zhì)內(nèi)有大小不等的空泡，以小泡性為主；匯管區(qū)和中央靜脈周圍出現(xiàn)明顯炎性細(xì)胞浸潤，并可見肝細(xì)胞壞死，脂變肝細(xì)胞占肝小葉的50%以上（圖2）。

圖1 2組小鼠肝臟肉眼觀察Fig.1 Liver gross pathology of wild?type and ob/ob mice

圖2 2組小鼠肝組織脂肪變性HE染色 ×200Fig.2 HE staining of hepatic steatosis of wild?type and ob/ob mice×200

3 討論

瘦素基因遺傳缺陷的ob/ob小鼠是一種由于ob基因的純合子自發(fā)隱性突變、無法表達(dá)和分泌，具有正常功能的瘦素，表現(xiàn)為明顯肥胖、代謝減退和低體溫等特點的遺傳性小鼠［3］。瘦素是由肥胖（ob）基因編碼、脂肪細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)類激素，具有調(diào)節(jié)機(jī)體攝食和能量代謝的作用：（1）抑制食欲；（2）增加能量消耗，抑制脂肪合成、促進(jìn)其分解；（3）通過調(diào)控胰島素、甲狀腺激素、皮質(zhì)酮、生長激素的合成及分泌發(fā)揮調(diào)節(jié)作用［4］。另外，瘦素在免疫調(diào)節(jié)、創(chuàng)傷修復(fù)、生殖、神經(jīng)內(nèi)分泌和血管新生等方面起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)ob/ob小鼠體質(zhì)量明顯增加，16周時可達(dá)到同周齡野生型小鼠的2.3倍。究其原因是由于ob/ob小鼠基因遺傳性缺乏瘦素，對交感神經(jīng)活性的興奮作用減弱，能量消耗降低引起大量脂肪蓄積導(dǎo)致肥胖［5］。另外，ob/ob小鼠體溫明顯低于野生型小鼠，整體活動度下降、喜聚集，其體質(zhì)量的增加可能亦與體溫降低、活動度減少引起的基礎(chǔ)代謝率降低有關(guān)。

有文獻(xiàn)報道ob/ob小鼠可出現(xiàn)明顯的脂肪肝，并且ob/ob小鼠的肝臟在受脂多糖、缺血－再灌注損傷和乙醇的毒性作用下，極易出現(xiàn)明顯的脂肪性肝炎和急性死亡［6，7］。研究發(fā)現(xiàn)：16周時ob/ob小鼠肝重、肝臟指數(shù)（P＜0.000 1）、肝組織TC、TG含量（P＜0.01）、肝功能（AST、ALT）（P＜0.001）較野生型小鼠顯著增加；大體及組織病理學(xué)結(jié)果顯示：16周的ob/ ob小鼠肝臟出現(xiàn)顯著病理變化，表現(xiàn)為中、重度脂肪肝的病理特征。另外，ob/ob小鼠的脂肪肝具有發(fā)病快、穩(wěn)定、顯著、重復(fù)性高等特點，是良好的NAFLD實驗動物模型，為相關(guān)藥品的研發(fā)及NAFLD發(fā)病機(jī)制的探討提供背景資料和參考依據(jù)。

［1］Fan JG，F(xiàn)arrell GC.Epidemiology of non-alcoholic fatty liver disease in China［J］.J Hepatol，2009，50（1）：204-210.

［2］范建高.非酒精性脂肪性肝病診療指南（2010年修訂版）［J］.中華肝臟病雜志，2010，18（3）：163-166.

［3］Zhang J，Wright W，Bernlohr DA，et al.Alterations of the classic pathway of complement in adipose tissue of obesity and insulin resistance［J］.Am J Physiol Endocrinol Metab，2007，292（5）：1433-1440.

［4］蘇曉艷，方朝暉.瘦素及瘦素抵抗與肥胖、2型糖尿病的關(guān)系研究進(jìn)展［J］.安徽醫(yī)藥，2009，13（1）：1-3.

［5］李宏睿，孫文夏，潘杰.瘦素功能研究進(jìn)展［J］.中國動脈硬化雜志，2004，12（1）：108-112.

［6］Hookman P，Barkin JS.Metformin reverses fatty liver disease in obese leptin-deficient mice［J］.Nat Med，2000，6（8）：998-1003.

［7］Yang SQ，Lin HZ，Lane MD，et al.Obesity increases sensitivity to endotoxin liver injury：implications for the pathogenesis of steatohepatitis［J］.Proc Natl Acad Sci，1997，94（6）：2557-2562.

（編輯 陳 姜）

Comparative Study of Biological Characteristics between Leptin Defectob/ob Mice and C57BL/6J Wild-type Mice

XUE Xin1，LIYu-mei1，CHENBing1，ZHANG Li-shi1，MAYa-luan1，WANGXu2

（1.Experimental Center，Institute of Basic Theory of Traditional Chinese Medicine，China Academy of Traditional Chinese Medicine，Beijing 100700，China；2.Department of Endoscopy，The First Hospital，China Medical University，Shenyang110001，China）

Objective To comparatively study the biological characteristics of leptin gene defect ob/ob mice and C57BL/6J wild-type mice，so as to provide a reliable fatty liver animal model in further study of traditional Chinese medicine.MethodsFemale C57BL/6Jwild-type and ob/ob mice at the age of8 weeks were selected as control and model animals.The mice were feed with standard dietfor16 weeks，the body weight and analtemperature of mice were determined every week，liver function and blood fat of serum were determined in the 16th week.The liver tissues were harvested for liver index，total cholesterol（TC），triglycerides（TG）content detection and HE staining.ResultsCompared with the wild-type mice，the body weight，liver weight，liver index，TC，HDL，AST，ALT of serum and TC，TG concentration of liver tissues of ob/ob mice were significantly increased（both P＜0.01），and anal temperature ofob/ob mice were decreased obviously（P＜0.001）.General and histopathology showed that16 weeksofob/ ob mice performed the pathological features of moderate and severe fatty liver.ConclusionThe ob/ob mice is proved to be a good animal model of nonalcoholic fatty liver disease，with the characteristics of fast，stable，significant and high repeatability.

ob/ob mice；nonalcoholic fatty liver disease；biological characteristics；leptin gene defect

R-332

A

0258-4646（2015）11-0983-04

中國中醫(yī)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)費自主選題項目（YZ-1109）；遼寧省科學(xué)技術(shù)計劃項目（2013010043-401）

薛欣（1971-），女，副研究員，博士.

汪旭，E-mail：wangxu_cmu@163.com

2015-05-07

網(wǎng)絡(luò)出版時間：