經(jīng)低強度超聲波照射后組織工程骨成骨的組織學(xué)觀察

王居勇，王居強，王華，沈惠良，劉爭宇，張慶明，劉利民，穆虹

（1.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院骨科，北京 100053；2.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科，沈陽 110001；3.北京黎明醫(yī)院婦產(chǎn)科，北京100011）

經(jīng)低強度超聲波照射后組織工程骨成骨的組織學(xué)觀察

王居勇1，王居強2，王華3，沈惠良1，劉爭宇1，張慶明1，劉利民1，穆虹1

（1.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院骨科，北京 100053；2.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科，沈陽 110001；3.北京黎明醫(yī)院婦產(chǎn)科，北京100011）

目的觀察低強度超聲波照射后組織工程骨的骨形成情況和生物力學(xué)變化。方法將骨髓間充質(zhì)細胞/β-磷酸三鈣（BMSCs/β-TCP）共同增殖分化培養(yǎng)2周后，手術(shù)植入同基因鼠背部兩側(cè)皮下，一側(cè)行超聲波照射20 min/d，另一側(cè)作為對照。術(shù)后5、10、25和50 d，分別取出組織工程骨，行HE染色和CD31免疫組化染色，觀察組織學(xué)變化。結(jié)果組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，超聲波組組織工程骨較對照骨軟組織修復(fù)、血運和血管形成更佳，骨形成更廣泛。結(jié)論低強度超聲波能夠促進組織工程骨內(nèi)的血運和骨形成。

磷酸三鈣；低強度超聲波；骨髓間充質(zhì)細胞；骨形成

研究顯示，組織工程骨內(nèi)骨形成具有一定的局限性［1～3］。有學(xué)者采用低壓細胞種植和流動性細胞培養(yǎng)方法提高細胞在多孔生物材料內(nèi)的種植效率，以增強組織工程骨的骨形成［2，4，5］。另外，生物材料內(nèi)血運建立的遲緩也可導(dǎo)致組織工程骨內(nèi)部分細胞死亡，引起骨形成量減少和分布不均勻［2，6］。因此，手術(shù)將組織工程骨植入體內(nèi)后，如何促進其骨形成非常重要。研究證實，低強度超聲波能夠促進骨折愈合，增強骨折的生物力學(xué)強度，促進骨折創(chuàng)傷部位炎癥消除、骨折修復(fù)和再建［7～10］。本研究擬將骨髓間充質(zhì)細胞/β-磷酸三鈣（bone marrow stromal cells/β tricalcium phosphate，BMSCs/β-TCP）復(fù)合體植入鼠的皮下，然后進行超聲波照射，通過生化學(xué)、生物力學(xué)和組織學(xué)方法觀察組織工程骨的骨形成情況和生物力學(xué)變化。

1 材料與方法

1.1 材料

多孔生物材料：β-TCP由日本Olympus公司無償提供。5 mm×5 mm×5 mm立方體形狀，多孔率75%，孔尺寸200～400 μm，孔與孔之間的連接通道直徑100～200 μm。

實驗動物：7周齡Fischer-344鼠，雄性，24只，由日本東京醫(yī)科齒科大學(xué)骨科提供。

低強度超聲波（SAFHS；Smith&Nephew，Memphis，TN，美國）：強度30 mW/cm2，頻率1.5 MHz，超聲波探頭直徑25 mm。

主要試劑：蛋白酶、鼠抗人CD31單克隆抗體、豬抗鼠/兔/羊的免疫球蛋白G均購自丹麥DakoCytomation公司。

1.2 方法

1.2.1 BMSCs的分離和擴增：動物骨髓來源于7周齡雄性Fischer-344鼠的股骨。采用Wang等［2］的方法進行骨髓間充質(zhì)細胞提取、培養(yǎng)及與多孔β-TCP的二次培養(yǎng)分化。二次分化培養(yǎng)細胞2周后，植入鼠背部皮下。

1.2.2 移植手術(shù)方法：腹腔內(nèi)注射苯巴比妥（3.5 mg/100 g）麻醉后，于鼠背部中線做切口，向左右兩側(cè)分離皮下至2.5 cm處，并各植入1個組織工程骨，縫合切口。

1.2.3 低強度超聲波照射：給予Fischer-344鼠背部右側(cè)組織工程骨（超聲波組）超聲波照射20 min/d；左側(cè)作為對照組，不給予任何處置。照射后5、10、25和50 d時，分別處死每組動物各6只，取出組織工程骨標(biāo)本（圖1）。

圖1 低強度超聲波動物模型Fig.1 Animal model of the low?intensity pulsed ultrasound（LIPUS）treatment

1.2.4 組織學(xué)和免疫組織化學(xué)觀察：收獲BMSCs/β-TCP標(biāo)本后，立即行10%中性甲醛固定、K-CX溶液脫鈣和石蠟包埋。制5 μm厚切片，HE染色，行組織學(xué)觀察。將脫鈣切片依次經(jīng)0.4 mg/mL蛋白酶K、3%過氧化氫溶液和5%脫脂乳處理，滴加鼠抗人CD31單克隆抗體（1∶100稀釋），4℃過夜，與豬抗鼠/兔/羊的免疫球蛋白G作用10 min。

2 結(jié)果

照射5 d后，肉眼可見超聲波組組織工程骨周圍軟組織緊密結(jié)合，顏色鮮紅，顯示血運較好，鏡下見組織工程骨孔隙內(nèi)存在大量紅細胞（圖2C）；對照組工程骨周圍鮮見軟組織附著，周圍組織色澤暗淡（圖2A），骨孔隙內(nèi)很少有細胞存在（圖2B）。

圖2 低強度超聲波照射5 d后組織學(xué)觀察Fig.2 The histomorphology images of the implanted porous composites treated by LIPUS for 5 days

照射10 d后，CD31免疫組化染色結(jié)果顯示：對照組組織工程骨孔隙內(nèi)很少見到血管內(nèi)皮細胞（圖3A），而超聲波組孔隙內(nèi)可見大量血管內(nèi)皮細胞，周圍伴隨纖維組織（圖3B）。

圖3 超聲波照射10 d后組織學(xué)觀察 CD31染色×100Fig.3 Representative histological sections of the composites treated by LIPUS for 10 days，stained with immunohistochemistry for the anti?CD31 antibody×100

超聲波照射25 d后，與對照組（圖4A）比較，超聲波組組織工程骨孔隙內(nèi)可見大量的骨形成，分布于β-TCP空隙邊緣，骨組織逐漸向孔隙深部生長（圖4B）；孔隙內(nèi)形成的骨組織表面可見成骨細胞呈鏈狀排列分布，顯示骨形成活躍；同時可見大量的小血管分布于骨形成周圍。

超聲波照射50 d后，對照組（圖4C）和超聲波組（圖4D）組織工程骨孔隙內(nèi)都可見大量骨形成。β-TCP孔隙內(nèi)排列的骨組織更多，新生的骨組織周圍可見類骨髓樣組織，超聲波組這種組織學(xué)改變更加明顯。25 d和50 d這2個時點的骨組織形成幾乎都是纖維組織骨，未觀察到板層骨組織。

圖4 超聲波照射25 d和50 d組織學(xué)觀察結(jié)果 HE×100Fig.4 Sections of implants for 25 and 50 days in the LIPUS group and control group HE×100

3 討論

在臨床實踐中，經(jīng)常需要使用較大的替代骨組織的生物材料。然而，即使在多孔生物材料內(nèi)均勻地種植了骨細胞，組織工程骨內(nèi)骨形成也是很局限的，這是由于組織工程骨移植后，內(nèi)部血運建立遲緩，導(dǎo)致骨細胞死亡［6］。目前，多數(shù)骨組織工程研究仍是在體外進行；組織工程骨移植入體內(nèi)后，對于如何促進體內(nèi)的骨形成，還沒有更好的辦法。

研究證實，超聲波能夠促進骨折愈合，增強骨的抗應(yīng)力變化。低強度超聲波能夠促進組織血管、軟骨和骨形成，在促進骨愈合方面明顯優(yōu)于其他強度超聲波［9～12］。目前，關(guān)于低強度超聲波照射BMSCs的大量研究都是在體外進行的，超聲波照射移植術(shù)后組織工程骨的體內(nèi)研究還很少。Hui等［13］在猴子脊柱后外側(cè)融合手術(shù)中植入帶BMSCs的多孔生物材料，然后進行超聲波照射，發(fā)現(xiàn)脊柱后外側(cè)形成很好的骨融合，但這個骨形成是術(shù)中橫突部位去皮質(zhì)化后橫突本身的骨細胞長入還是BMSCs的骨形成，卻不能明確。本研究將BMSCs/β-TCP移植到動物皮下，排除了其他骨細胞作用的干擾，并在移植手術(shù)后給予超聲波照射，觀察到了組織工程骨內(nèi)大量的骨組織形成。

本研究通過觀察多孔材料β-TCP內(nèi)骨形成情況，證實了低強度超聲波對組織工程骨骨形成的影響。本研究結(jié)果顯示：超聲波照射5 d后，對照組周圍組織顏色暗淡且尚未與組織工程骨形成附著，鏡下觀察孔隙內(nèi)很少見到細胞和纖維組織，而超聲波組生物材料孔隙內(nèi)可見大量紅細胞存在。提示低強度超聲波能夠促進組織工程骨骨形成，促進生物材料內(nèi)早期血管形成和血液流動，從而增加組織工程骨內(nèi)骨細胞的營養(yǎng)供應(yīng)，加快排除機體代謝廢物。與Rawool等［14］的研究結(jié)果一致。

研究認為超聲波能夠促進血管內(nèi)皮生長因子的高度表達和新生血管形成，并提出了超聲波介導(dǎo)的微泡破壞機制（ultrasound-mediated microbubble technique，UMMT）［15，16］，即超聲波能夠產(chǎn)生聲波空洞化，破壞血管內(nèi)皮細胞，進一步促使新生血管形成［15，17，18］。盡管本研究中使用的超聲波強度與之不同，但是超聲波照射5 d和10 d后的組織學(xué)表現(xiàn)與其相似。超聲波照射引起的組織工程骨內(nèi)和周圍的早期血管形成增強了局部血液循環(huán)，有利于BMSCs分化成成骨細胞，從而對組織工程骨內(nèi)良好的骨形成發(fā)揮了重要作用。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，在組織工程骨移植手術(shù)后，用低強度超聲波照射體內(nèi)生物材料部位可以促進骨形成。因此，在組織工程骨移植術(shù)后的恢復(fù)階段，低強度超聲波是一種既方便又有效的治療手段。

［1］Amini A，Adams D，Laurencin C，et al.Optimally porous and biomechanically compatible scaffolds for large-area bone regeneration［J］. Tissue Eng Part AJ，2012，18（13-14）：1376-1388.

［2］Wang J，Asoua Y，Sekiy I，et al.Enhancement of tissue engineered bone formation by a low pressure system improving cell seeding and medium perfusion into a porous scaffold［J］.Biomaterials J，2006，27（13）：2738-2746.

［3］Wang Y，Uemura T，Dong J，et al.Application of perfusion culture system improves in vitro and in vivo ssteogenesis of bone marrow-derived osteoblastic cells in porous ceramic materials［J］.Tissue Eng，2003，9（6）：1205-1214.

［4］Sochaga LA，Tognana E，Penick K，et al.A rapid seeding technique for the assembly of large cell/scaffold composite constructs［J］.Tissue Eng，2006，12（7）：1851-1862.

［5］Gomes ME，Bossano CM，Johnston CM，et al.In vitro localization of bone growth factors in constructs of biodegradable scaffolds seeded with marrow stromal cells and cultured in a flow perfusion bioreactor［J］.Tissue Eng，2006，12（1）：177-188.

［6］Muschler G，Nakamoto C，Griffith L.Engineering principles of clinical cell-based tissue engineering［J］.J Bone Joint Surg Am，2004，86-A（7）：1541-1548.

［7］El-Mowafi H，Mohsen M.The effect of low-intensity pulsed ultrasound on callus maturation in tibial distraction osteogenesis［J］.Int Orthop，2005，29（2）：121-124.

［8］Xie L，Wangrangsimakul K，Suttapreyasri S，et al.A preliminary study of the effect of low intensity pulsed ultrasound on new bone formation during mandibular distraction osteogenesis in rabbits［J］. Int J Oral Maxillofac Surg（Denmark），2011，40（7）：730-736.

［9］Iwai T，Harada Y，Imura K，et al.Low-intensity pulsed ultrasound increases bone ingrowth into porous hydroxyapatite ceramic［J］.Bone Miner Metab，2007，25（6）：392-399.

［10］Rutten S，Nolte PA，Korstjens CM，et al.Low-intensity pulsed ultrasound increases bone volume，osteoid thickness and mineral apposition rate in the area of fracture healing in patients with a delayed union of the osteotomized fibula［J］.Bone，2008，43（2）：348-354.

［11］Azuma Y，Ito M，Harada Y.Low-intensity pulsed ultrasound accelerates rat femoral fracture healing by acting on the various cellular reactions in the fracture callus［J］.J Bone Miner Res，2001，16（4）：671-680.

［12］Rubin C，Bolander M，Ryaby JP.The use of low intensity ultrasound to accelerate the healing of fractures［J］.J Bone Joint Surg Am，2001，83-A（2）：259-270.

［13］Hui C，Chan C，Yeung H，et al.Low-intensity pulsed ultrasound en-hances posterior spinal fusion implanted with mesenchymal stem cells-calcium phosphate composite without bone grafting［J］.Spine（Phila Pa 1976），2011，36（13）：1010-1016.

［14］Rawool NM，Goldberg BB，F(xiàn)orsberg F，et al.Power Doppler assessment of vascular changes during fracture treatment with low-intensity ultrasound［J］.J Ultrasound Med，2003，22（2）：145-153.

［15］Zhang Q，Wang Z，Ran H，et al.Enhanced gene delivery into skeletal muscles with ultrasound and microbubble techniques［J］.Acad Radiol，2006，13（3）：363-367.

［16］Xu YL，Gao YH，Liu Z，et al.Myocardium-targeted transplantation of mesenchymal stem cells by diagnostic ultrasound-mediated microbubble destruction improves cardiac function in myocardial infarction of New Zealand rabbits［J］.Int J Cardiol，2010，138（2）：182-195.

［17］Zhang XL，Zheng RQ，Yang YB，et al.The use of contrast-enhanced ultrasound in uterine leiomyomas［J］.Chin Med J（Engl），2010，123（21）：3095-3099.

［18］Zhou XY，Liao Q，Pu YM，et al.Ultrasound-mediated microbubble delivery of pigment epithelium-derived factor gene into retina inhibits choroidal neovascularization［J］.Chin Med J（Engl），2009，122（22）：2711-2717.

（編輯 王又冬）

HistologicalObservation ofBone Formation in Tissue Engineering Bone after Low-intensity Pulsed Ultrasonic Irradiation

WANG Ju-yong1，WANG Ju-qiang2，WANG Hua3，SHEN Hui-liang1，LIU Zheng-yu1，ZHANG Qing-ming1，LIU Li-min1，MUHong1

（1.Department of Orthopedic Surgery，Xuanwu Hospital，Capital Medical University，Beijing 100053，China；2.Department of Orthopaedics，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China；3.Department of Obsterics and Gynecology，Beijing Liming Hospital，Beijing100011，China）

Objective To promote extensive bone formation in the composites of porous ceramics and bone marrow stromal cells（BMSCs）by lowintensity pulsed ultrasound（LIPUS）.MethodsBMSCs/βtricalcium phosphate（β-TCP）composites were sub-cultured for2 weeks and then subcutaneously implanted into syngeneic rats，and then the rats were randomly divided into LIPUS treatment group and control group.These implants were harvested at 5，10，25 and 50 days after implantation.The samples were then stained with hematoxylin and eosin（HE）and observed by light microscopy.ResultsHistomorphometric analysis revealed a great degree of soft tissue repair，increased blood flow，better angiogenesis，and increased bone formation in the LIPUS group compare to the controls.ConclusionLIPUS treatmentappearsto enhance bone formation and angiogenesisin the BMSCs/tricalcium phosphate composites.

tricalcium phosphate；low-intensity pulsed ultrasound；bone marrow stromal cells；bone formation

R687.3+4

A

0258-4646（2015）11-0970-05

國家自然科學(xué)基金（31040029）；北京自然科學(xué)基金（3112012）

王居勇（1967-），男，副教授，博士.

E-mail：wangjywh1@sina.com

2015-04-03

網(wǎng)絡(luò)出版時間：