新式線栓法建立大鼠局灶性腦缺血再灌注模型的建立

范瑞娟等

【摘要】目的：在Zea Longa線栓法的基礎(chǔ)上，對(duì)現(xiàn)有的改良線栓法進(jìn)一步改進(jìn)，為建立更加穩(wěn)定的局灶性腦缺血再灌注模型提供參考。方法：30只雄性SD大鼠隨機(jī)分Zea Longa線栓法組、改良線栓法組、新式線栓法組三組，每組10只。比較上述3組大鼠局灶性腦缺血再灌注模型的制作時(shí)間，及再灌注24h后大鼠的神經(jīng)功能評(píng)分、腦梗死體積率及動(dòng)物死亡率等指標(biāo)，評(píng)價(jià)經(jīng)過(guò)再改進(jìn)后的新式線栓法制作的大鼠局灶性腦缺血再灌注模型的有效性。結(jié)果：Zea Longa線栓法組、改良線栓法組、新式線栓法組大鼠的神經(jīng)功能評(píng)分、腦梗死體積率，模型成功率無(wú)明顯差異（P>001），但新式線栓法組的模型制作時(shí)間及大鼠死亡率明顯低于Zea Longa線栓法組和改良線栓法組。結(jié)論：經(jīng)過(guò)進(jìn)一步改進(jìn)的新式線栓法可以有效縮短模型制作時(shí)間，減少動(dòng)物死亡率，優(yōu)于Zea Longa線栓法組、改良線栓法組，使大腦中動(dòng)脈阻塞再灌注模型的建立更加簡(jiǎn)易穩(wěn)定。

【關(guān)鍵詞】線栓法；局灶性腦缺血再灌注；模型研究

【中圖分類號(hào)】R-332【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517（2014）02-0026-02

缺血性腦血管疾病已成為現(xiàn)代社會(huì)致死、致殘的最主要疾病之一，而抑制再灌注損傷是缺血性腦血管疾病治療的重要環(huán)節(jié)，開展對(duì)腦缺血再灌注損傷模型、損傷機(jī)制、防治的研究具有重要意義。其中，最為首要的是建立有效的腦缺血再灌注模型。而大腦中動(dòng)脈（MCA）為臨床上缺血性腦損傷的易患部位，故大腦中動(dòng)脈阻斷（MCAO）模型被廣泛用于腦梗塞的研究[1]。

制備MCAO模型的方法有很多種，迄今主要包括光化學(xué)法，三氯化鐵法，線栓法，自體血栓法，電流損傷法，自發(fā)性MCAO等[2]。其中線栓法制備的大鼠局灶性腦缺血模型是目前公認(rèn)的較為理想的局灶性腦缺血模型.它具有不開顱，損傷小，重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)，并可準(zhǔn)確控制缺血和再灌注的時(shí)間，因此應(yīng)用范圍廣泛[3]。但是我們?cè)趯?shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，Longa線栓法模型因?yàn)橐蛛x結(jié)扎翼腭動(dòng)脈，游離頸外動(dòng)脈，損傷大，動(dòng)物死亡率高，模型成功率低。而現(xiàn)階段的改良模型因?yàn)橐坞x結(jié)扎頸外動(dòng)脈，手術(shù)損傷仍然較大，操作時(shí)間偏長(zhǎng)，動(dòng)物死亡率仍然較高。因此我們對(duì)模型進(jìn)行了進(jìn)一步的改進(jìn)，使手術(shù)更簡(jiǎn)潔，操作時(shí)間更短，動(dòng)物死亡率更低，模型更具穩(wěn)定性。

1材料與方法

11實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組30只SPF級(jí)雄性SD大鼠，體重250～300g，隨機(jī)分為L(zhǎng)onga線栓法組、改良線栓法組、新式線栓法組，每組10只。由長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供，生產(chǎn)許可證：SCXK（湘）2009-0012。

12試劑及線栓準(zhǔn)備TTC染色劑由貴州博奧瑞杰生物科技有限公司提供；栓線由北京沙東生物技術(shù)有限公司提供，線身直徑026mm，頭端包被多聚賴氨酸，線頭直徑036±002mm，線長(zhǎng)40mm，和球端相距19～20mm處有黑色標(biāo)記。

13方法

131術(shù)前準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)前對(duì)大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，自由飲水進(jìn)食。術(shù)前12h禁食，自由飲水。3℅水合氯醛1ml/100g腹腔注射麻醉大鼠，仰臥位固定，頸前區(qū)備皮，常規(guī)消毒。

132模型制備Zea Longa線栓法組[4]：參照Z(yǔ)ea Longa線栓法制備大鼠MCAO模型，頸正中線切口，鈍性分離，暴露右側(cè)胸鎖乳突肌和胸骨舌骨肌之間的三角區(qū)域，沿胸鎖乳突肌內(nèi)側(cè)分離肌肉筋膜，暴露頸總動(dòng)脈（CCA），頸外動(dòng)脈（ECA），頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA）。電凝器電凝ECA的分支，結(jié)扎翼腭動(dòng)脈（PPA），并在ECA近心端、遠(yuǎn)心端分別穿線，遠(yuǎn)心端系緊，近心端系一松結(jié)備用， 用微動(dòng)脈夾暫時(shí)夾閉CCA與ECA，在ECA的兩線間剪一小口，將栓線經(jīng)小口插入頸外動(dòng)脈并送入頸內(nèi)動(dòng)脈；改良線栓法組[5]：頸正中切口，暴露右側(cè)CCA、ICA和ECA，電凝ECA與ICA之間的交通支，結(jié)扎并游離ECA，確保ECA殘端長(zhǎng)度不少于05 cm。以微動(dòng)脈夾暫時(shí)阻斷CCA及ICA血流，用眼科剪于ECA 殘端作一縱行小切口，將線栓從右側(cè)ECA殘端插入ICA，輕輕牽拉ECA殘端，使其與ICA成一條直線，調(diào)整線栓角度，使線栓弧度水平向外，與頸前正中線呈45度水平向外的夾角，移去夾閉ICA的動(dòng)脈夾，輕輕將線栓送入顱內(nèi)，栓塞成功后，結(jié)扎ECA殘端，移去CCA上的微動(dòng)脈夾，觀察無(wú)活動(dòng)性出血后關(guān)閉切口。新式線栓法組：頸正中線切口3～4cm，鈍性分離，暴露右側(cè)胸鎖乳突肌和胸骨舌骨肌之間的三角區(qū)域，沿胸鎖乳突肌內(nèi)側(cè)分離肌肉筋膜，暴露CCA，在CCA的近心端和遠(yuǎn)心端分別穿線，近心端系緊，距此節(jié)1cm處的遠(yuǎn)心端系一松節(jié)備用，在CCA近ICA分叉處以微動(dòng)脈夾暫時(shí)夾閉，在CCA的兩線間，距CCA分叉處5mm左右，剪一斜行45°小口，松開分叉處微動(dòng)脈夾進(jìn)行插線，在栓線標(biāo)記接近CCA與ICA分叉處或遇阻力感時(shí)停止。

133神經(jīng)功能評(píng)分參照Garcia神經(jīng)功能評(píng)分[6]標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)價(jià)大鼠的神經(jīng)行為學(xué)，包括以下6項(xiàng)：自主運(yùn)動(dòng)；四肢運(yùn)動(dòng)對(duì)稱性；前爪伸展性；攀爬運(yùn)動(dòng)；肢體本體感覺(jué)；觸須反應(yīng)。采用雙盲法于術(shù)后24小時(shí)評(píng)分并記錄。

134TTC染色及腦梗死體積率測(cè)定 于缺血再灌注24h后麻醉剪下頭部，取出腦組織，置于腦模具中，沿視交叉向后平均切成5片，將其放入2%TTC的磷酸鹽緩沖液，于37℃溫箱中染色30min，再用4%多聚甲醛固定并攝片。

135觀測(cè)指標(biāo)記錄從切口至插入栓線模型制作的時(shí)間；分析動(dòng)物死亡原因，統(tǒng)計(jì)死亡率；于造模24h后對(duì)存活大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，統(tǒng)計(jì)模型成功率；用Image-Pro-Plus軟件測(cè)量TTC染色后腦梗死體積率。

136模型成功標(biāo)準(zhǔn)神經(jīng)功能評(píng)分為4～12 分，存活超過(guò)24h，取大腦無(wú)蛛網(wǎng)膜下腔出血，大腦冠狀切面TTC染色可見明顯蒼白梗死區(qū)者為造模成功。

137統(tǒng)計(jì)學(xué)分析各組計(jì)量資料均采用SPSS190統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（x±s）表示，數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布時(shí)進(jìn)行單因素方差分析，不呈正態(tài)分布采用非參數(shù)檢驗(yàn)。

2結(jié)果

21大鼠死亡情況Zea Longa線栓法組大鼠共10只，死亡5只，存活5只，其中2只疑因造模時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，在造模完成后2h內(nèi)死亡，3只在24h內(nèi)死亡，解剖有蛛網(wǎng)膜下腔出血。改良線栓法組大鼠10只，死亡3只，存活7只，1只因大失血死亡，2只在造模完成后24h內(nèi)死亡，解剖一只有嚴(yán)重腦水腫，一只蛛網(wǎng)膜下腔出血。Zea Longa線栓法組大鼠死亡率為50%，改良線栓法組大鼠為30%。新式線栓法組大鼠10只，存活10只，但有一只因栓線反復(fù)進(jìn)退致血管痙攣，導(dǎo)致栓線深度未達(dá)到，造模失敗，但沒(méi)有大鼠死亡。就大鼠死亡情況而言，新式線栓法組優(yōu)于Zea Longa線栓法組和改良線栓法組。

22模型制作時(shí)間、神經(jīng)功能評(píng)分、腦梗死體積率實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，新式線栓法組與Zea Longa線栓法組和改良線栓法組比較，神經(jīng)功能評(píng)分、腦梗死體積率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>005）；造模時(shí)間比較，新式線栓法組的模型制作時(shí)間最少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005）

3討論

線栓法因?yàn)楦鞣N優(yōu)點(diǎn)，成為了廣大研究者最為青睞的方法之一。為了使模型成功率更高，更穩(wěn)定，廣大研究者對(duì)線栓法進(jìn)行了諸多改進(jìn)。筆者在傳統(tǒng)線栓法的基礎(chǔ)上，查閱相關(guān)文獻(xiàn)，經(jīng)反復(fù)實(shí)踐并總結(jié)諸多改良線栓法，對(duì)線栓法進(jìn)行了進(jìn)一步改良，僅需分離一根血管，打兩個(gè)手術(shù)結(jié)，夾一個(gè)微動(dòng)脈夾，使模型的制作時(shí)間和大鼠的死亡率明顯低于Zea Longa線栓法組和現(xiàn)有的改良線栓法組，進(jìn)一步確保的模型制作的穩(wěn)定?，F(xiàn)將模型制作中的相關(guān)經(jīng)驗(yàn)探討如下，以期對(duì)各科研者有所幫助。

31大鼠的選擇SD大鼠與Wistar大鼠差異不大，但是SD大鼠出血更少。選擇SD大鼠使手術(shù)操作更容易[7]。因?yàn)榇萍に貙?duì)大腦具有保護(hù)作用，故選擇雄性大鼠。低于250g的大鼠，血管太細(xì)，容易刺破血管，死亡率高，超過(guò)300g的大鼠的血管過(guò)粗，容易造成栓塞不完全，認(rèn)為大鼠體重控制在250～300g為佳。

32線栓的選擇栓線的選擇主要有尼龍線和魚線兩種，制作方法主要有石蠟包被，硅膠包被，多聚萘胺酸包被，也有用指甲油包被的。我們主要采用多聚賴氨酸包被的漁線，購(gòu)買成品，規(guī)格更為一致，對(duì)模型的影響因素更小。

33麻醉劑的選擇選用3%的水合氯醛1ml/100g，安全有效。5分鐘內(nèi)起效，但是維持時(shí)間較短。需要在50min左右加補(bǔ)水合氯醛，劑量一般為總劑量的1/3。

34切口及分離的部位關(guān)于切口，廣大研究者主要有三種觀點(diǎn)：正中切口，右側(cè)切口，右側(cè)斜向正中切口。筆者選用正中切口，鈍性分離，暴露右側(cè)胸鎖乳突肌和胸骨舌骨肌之間的三角區(qū)域，沿胸鎖乳突肌內(nèi)側(cè)分離肌肉筋膜，暴露頸總動(dòng)脈，頸外動(dòng)脈，頸內(nèi)動(dòng)脈。視野清晰，出血少，損傷相對(duì)較小，通常1～2min即可完成，用時(shí)短。

35栓線的入路僅分離頸總動(dòng)脈一根血管，有效降低了手術(shù)操作時(shí)間；在頸總動(dòng)脈（CCA）的近心端和遠(yuǎn)心端分別穿線，近心端系緊，距此節(jié)1cm處的遠(yuǎn)心端系一松節(jié)備用；在頸總動(dòng)脈（CCA）和頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA）的分叉處以微動(dòng)脈夾夾閉，僅使用一個(gè)動(dòng)脈夾，大大減少了手術(shù)的損傷；在頸總動(dòng)脈的兩線間剪一斜行的45°小口進(jìn)行插線，切口具有一定傾斜角度更有利于插線；在分離頸總動(dòng)脈分叉處時(shí)，可提拉遠(yuǎn)心端的松節(jié)，更利于暴露交感神經(jīng)干，以避免對(duì)其刺激，降低大鼠的死亡率，確保模型的穩(wěn)定性。尤其適用于線栓法操作尚不熟練的研究者。

36術(shù)中大鼠的護(hù)理我們?cè)陂L(zhǎng)期的實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，術(shù)中大鼠死亡的原因主要有三種：一是呼吸急促。原因可能與分離血管時(shí)牽拉甚至損傷迷走神經(jīng)有關(guān)。僅分離頸總動(dòng)脈近分叉處1mm的血管，可以有效減少對(duì)迷走神經(jīng)的刺激及損傷；此外，采取分離血管前局部浸潤(rùn)利多卡因，使用剝離分針代替鑷子，小心分離，有利于暫時(shí)降低迷走神經(jīng)的敏感性，并且，在分離頸總動(dòng)脈分叉部時(shí)可稍向上提拉頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)心端的松結(jié)，有利于避免刺激頸動(dòng)脈竇，改善大鼠呼吸急促的問(wèn)題。二是呼吸困難，主要與麻醉有關(guān)。首先麻醉后大鼠的舌部麻醉腫脹，術(shù)前應(yīng)將大鼠舌部稍牽拉出并偏向一側(cè)，以免堵塞氣道。其次水合氯醛易增加呼吸道的分泌物，尤其造成痰液過(guò)多，文獻(xiàn)報(bào)道麻醉前可適量注射阿托品（1支稀釋成10ml，每只01ml）。但是，事實(shí)上，阿托品[8]是通過(guò)阻斷M受體的作用抑制腺體分泌，會(huì)使氣道分泌物變粘稠，而不是減少分泌，反而更容易形成痰痂，阻塞氣道，效果不佳。我們采取密切觀察，在大鼠有呼吸困難或者痰鳴音時(shí)予以吸痰處理，效果穩(wěn)定。三是大出血，傳統(tǒng)線栓法因?yàn)橐獜念i外動(dòng)脈插線，故要分離并電凝其分支兩到三條?，F(xiàn)有的改良線栓法雖然不從頸外動(dòng)脈插線，但是要結(jié)扎頸外動(dòng)脈，有時(shí)也會(huì)涉及到頸外動(dòng)脈與頸內(nèi)動(dòng)脈之間的分支。這些分支一旦破裂，極易造成大出血，導(dǎo)致大鼠因失血過(guò)多而死亡。而且頸總動(dòng)脈分叉處有頸動(dòng)脈竇，分離極易過(guò)度刺激神經(jīng)或者造成損傷，增加大鼠的死亡率。我們改良的線栓法，因?yàn)橹恍枰蛛x頸總動(dòng)脈一條，故而避免了分支破裂而造成的出血，也避開了頸總動(dòng)脈分杈處的分離，減少了動(dòng)物的死亡率及造模失敗的危險(xiǎn)性。

37術(shù)后大鼠的護(hù)理造模完成后，栓線抽出，將松結(jié)系緊。局部使用抗生素浸潤(rùn)，避免感染。先縫合肌肉層再縫合皮膚。解除固定后，若大鼠還未清醒，還可對(duì)大鼠四肢及腹部進(jìn)行按摩。術(shù)后24h大鼠宜單獨(dú)喂養(yǎng)。

線栓法建立大鼠局灶性腦缺血再灌注的模型雖然得到了廣泛的認(rèn)可，技術(shù)發(fā)展也日益成熟，但是由于影響模型成功的因素很多，如何規(guī)范和優(yōu)化手術(shù)操作，降低動(dòng)物的死亡率，使大鼠的腦梗塞恒定，更能模擬人類的發(fā)病機(jī)理，仍是廣大研究者亟待解決的問(wèn)題，仍需要科研者不斷探索總結(jié)，為建立更加穩(wěn)定的模型而努力。

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（收稿日期：20131201）