纖維素酶分子改造技術(shù)研究進(jìn)展

柯 軼，王 娜，林俊涵

（福建生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福建 福州 350000）

社會(huì)的發(fā)展離不開能源的供給，但是近年來全球能源匱乏，天然氣、煤炭和石油等能源儲(chǔ)備量逐年下降。Laherrère和Campbell兩人根據(jù)目前石油開采情況和全球石油儲(chǔ)備情況進(jìn)行分析，預(yù)測從2010年開始，全球天然氣、石油的開采量將下降，到2050年，全球石油供應(yīng)量將從目前每年25億桶，降低至每年5億桶［1］。石油、煤炭等能源都是不可再生資源，所以尋找一種可再生的能源資源迫在眉睫。纖維素是地球上數(shù)量最多的可再生資源，約占總生物量的40%，是一種很好的可再生生物質(zhì)能，目前人類每年所消耗的能源僅僅是這部分能源的1／10［2］。如果可以利用生物轉(zhuǎn)化技術(shù)將纖維素轉(zhuǎn)化成可利用的單糖，并通過生物發(fā)酵等后續(xù)加工將單糖轉(zhuǎn)化為乙醇等綠色能源，不僅可以緩解當(dāng)今社會(huì)的能源危機(jī)，還可以減少石油、煤炭等傳統(tǒng)能源燃燒帶來的環(huán)境污染。但是纖維素具有穩(wěn)定的結(jié)晶結(jié)構(gòu)，在常溫下不易溶于水，也不易溶于一般的有機(jī)溶劑如乙醇、苯、丙酮等，而且其結(jié)晶結(jié)構(gòu)十分緊密，又有其他生物聚合物鑲嵌在一起，大大增加了其降解難度。

纖維素酶是能夠?qū)⒗w維素降解成單糖的一種復(fù)合酶，包括內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶及β－D－葡萄糖苷酶。在降解纖維素方面，它具有特異性高、反應(yīng)條件溫和、綠色無污染等特點(diǎn)，是當(dāng)今生物質(zhì)能研究的熱點(diǎn)。但是在工廠化生產(chǎn)中，纖維素酶也存在著不足之處，例如不耐高溫、降解效率低、易受產(chǎn)物抑制等，這些不足制約了纖維素酶的進(jìn)一步開發(fā)利用。分子改造為纖維素酶實(shí)現(xiàn)工廠化生產(chǎn)提供了可能。纖維素酶分子的改造是近年來學(xué)術(shù)界的研究熱點(diǎn)，該技術(shù)的應(yīng)用有效彌補(bǔ)了纖維素酶在工業(yè)生產(chǎn)上的不足，使纖維素酶在降解纖維素方面更完善。本文對(duì)近年來纖維素酶及其分子改造技術(shù)的研究進(jìn)行了綜述。

1 纖維素酶酶系組成及其作用機(jī)理

1.1 纖維素酶酶系組成

纖維素酶主要來自于細(xì)菌和真菌，屬于糖苷水解酶類，是一類復(fù)合酶，是由多種能夠水解纖維素中β－D－糖苷鍵的酶組合而成。根據(jù)水解功能的不同，可以將纖維素酶中的各種酶分成三大類：內(nèi)切型β－葡聚糖酶（E.C 3.2.1.4）；外切型β－葡聚糖酶（E.C 3.2.1.91）；β－葡萄糖苷酶（E.C 3.2.1.21）。

內(nèi)切 型β－葡聚糖酶（E.C 3.2.1.4）：也稱EG，胞外酶型的分子量介于47～76KDa，胞內(nèi)酶型的分子量介于23～118KDa［3］；主要作用于纖維素的非晶體區(qū)，水解β－1－4糖苷鍵，使得纖維素產(chǎn)生大量的非還原斷，主要產(chǎn)物有纖維糊精、纖維二糖、纖維三糖等。

外切型 β－葡聚糖酶（E.C 3.2.1.91）：也叫CBH，分子量介于38～118KDa，是纖維素酶中重要的組成部分，主要作用于纖維素鏈中的非還原端，水解β－1－4糖苷鍵，每次水解都會(huì)從纖維素鏈上切下一個(gè)纖維二糖分子，主要的水解產(chǎn)物有纖維糊精和纖維二糖。

β－葡萄糖苷酶（E.C 3.2.1.21）：也稱BG，胞內(nèi)酶型分子量介于90～100KDa，胞外酶型分子量介于47～76KDa，主要作用是將短鏈的纖維寡糖或者纖維二糖水解成葡萄糖。

1.2 作用機(jī)理

目前有三種纖維素酶水解機(jī)理被學(xué)術(shù)界普遍接受：碎片理論、原初反應(yīng)假說和協(xié)同理論。其中協(xié)同理論是多數(shù)研究人員所接受的。協(xié)同理論認(rèn)為，纖維素酶在降解纖維素的過程中，內(nèi)切酶、外切酶和葡萄糖苷酶之間相互協(xié)作，共同完成纖維素的降解［4］。但是這一觀點(diǎn)也存在的兩種爭議：一是認(rèn)為在降解過程，先由EG從纖維素分子內(nèi)部隨機(jī)水解β－1－4糖苷鍵，產(chǎn)生非還原端，之后CBH從非還原端水解產(chǎn)生纖維二糖，最后由BG水解纖維二糖產(chǎn)生葡萄糖；二是認(rèn)為在降解過程中，先是由CBH水解不溶性纖維素，產(chǎn)生可溶性的纖維二糖和纖維糊精，之后由EG水解β－1－4糖苷鍵產(chǎn)生纖維二糖，最后由BG水解纖維二糖產(chǎn)生葡萄糖。兩種爭議主要是內(nèi)切酶和外切酶作用的先后順序。

2 纖維素酶分子改造技術(shù)

纖維素酶分子改造技術(shù)是從DNA層面上使得纖維素酶編碼區(qū)或者上下游調(diào)控區(qū)內(nèi)的堿基發(fā)生突變，從而改變纖維素酶空間結(jié)構(gòu)，提高纖維素酶性能或者提高纖維素酶產(chǎn)量。

2.1 提高纖維素酶性能的分子改造技術(shù)

提高酶性能的分子改造技術(shù)主要是改造酶催化結(jié)構(gòu)和結(jié)合域的空間結(jié)構(gòu)或者是氨基酸之間的化學(xué)鍵，以更好地催化纖維素的水解。常用于提高纖維素酶性能的分子改造技術(shù)主要有定點(diǎn)突變技術(shù)、易錯(cuò)PCR、DNA改組技術(shù)。

2.1.1 定點(diǎn)突變 定點(diǎn)突變技術(shù)是Michael Smith發(fā)明的，他也因此獲得了1993的諾貝爾獎(jiǎng)化學(xué)獎(jiǎng)。在定點(diǎn)突變發(fā)明之前，突變株的產(chǎn)生是通過自然界或者化學(xué)誘變等方法使基因發(fā)生變化，但是這些突變方法通常時(shí)間漫長或者不定向突變。而定點(diǎn)突變技術(shù)則可以讓突變變得可控，是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能之間關(guān)系的有效手段，是探索啟動(dòng)子調(diào)節(jié)位點(diǎn)的有力工具，是優(yōu)化、改造基因的便捷方案。定點(diǎn)突變技術(shù)的基本原理是設(shè)計(jì)一對(duì)包含有目標(biāo)突變的引物，這個(gè)突變可以使單個(gè)堿基的改變，也可以使多個(gè)堿基的改變，缺失或者增加。利用這對(duì)含有目標(biāo)突變的引物去擴(kuò)增目的基因，這樣拷貝后的基因就包含了所需的突變位點(diǎn)。之后再利用載體將目的片段導(dǎo)入宿主細(xì)胞進(jìn)行克隆，最后通過DNA測序技術(shù)確保目的片段已導(dǎo)入宿主細(xì)胞。

定點(diǎn)突變技術(shù)通常與生物信息學(xué)結(jié)合使用，首先對(duì)待改造纖維素酶進(jìn)行同源分析，對(duì)其分子結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系進(jìn)行研究，包括影響pH、熱穩(wěn)定性、底物結(jié)合區(qū)域等結(jié)構(gòu)，之后在模擬軟件中進(jìn)行突變，預(yù)測突變體的結(jié)構(gòu)和新的功能，根據(jù)所掌握的信息，在相應(yīng)的位點(diǎn)設(shè)計(jì)含有目標(biāo)突變的引物進(jìn)行突變。方芳等［5］利用定點(diǎn)突變技術(shù)對(duì)糖苷水解酶家族中EGV（endoglucanase V）的耐熱性進(jìn)行改造，在進(jìn)行同源建模和序列比對(duì)后，將第49位的脯氨酸刪除，之后將突變體導(dǎo)入畢氏酵母進(jìn)行研究分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在70℃環(huán)境下處理2h，突變酶49P（del）剩余酶活性為72.8%，而EGV剩余酶活性只剩51.2%，熱穩(wěn)定性比EGV 提高了21.6%，其他酶性質(zhì)與EGV基本相似，這說明定點(diǎn)突變技術(shù)有效地提高了EGV的熱穩(wěn)定性；唐自鐘等［6］人利用定點(diǎn)突變技術(shù)對(duì)高酶活F－10突變株內(nèi)切葡聚糖酶基因進(jìn)行定點(diǎn)突變，將位于第91位的賴氨酸突變?yōu)楣劝彼幔↘91E），第369位的賴氨酸突變成精氨酸（K369R），構(gòu)建了含有K91E、K369R及K91E／K369R等3個(gè)質(zhì)粒的工程菌，試驗(yàn)結(jié)果表明3種工程菌所產(chǎn)的內(nèi)切葡聚糖酶在熱穩(wěn)定上都有所提高，在70℃下處理1h，K91E剩余酶活力為36%，K369R剩余酶活力為30%，K91E／K369R剩余酶活力為41%，相比而言，原始酶剩余酶活力僅為12%。在酶的比活力比較中，K31E、K369R、K31E／K369R的比活力分別為202U／mg、162.8U／mg、77.9U／mg，分別比原始酶提高了3倍、2.4倍、1.2倍。張洪喜［7］對(duì)纖維素酶cel 18－7進(jìn)行體外定點(diǎn)突變，將第212位上的Asn突變成Asp和His，將第140位上的His突變成Gln，結(jié)果發(fā)現(xiàn)cel18－7N212D的最適pH值由原先的6.0～6.5偏移到5.5，在堿性環(huán)境中酶活降低，cel18－7N212H最適pH偏移到6.5～7.0，在堿性環(huán)境中酶活提高，cel18－7H140Q最適pH偏移到了5.0，對(duì)酸堿的耐受性提高了。

2.1.2 易錯(cuò)PCR 易錯(cuò)PCR是體外定向進(jìn)化常用技術(shù)之一，原理是在目標(biāo)基因進(jìn)行復(fù)制擴(kuò)增過程中，通過改變反應(yīng)體系、加入錳離子，提高鎂離子濃度等手段，降低復(fù)制過程的保真性，隨機(jī)引入突變位點(diǎn)，之后通過篩選獲得有益突變體。易錯(cuò)PCR的關(guān)鍵技術(shù)在于如何選擇合適的突變頻率，如果突變頻率過高，將導(dǎo)致絕大部分的突變?yōu)橛泻ν蛔儯焕诤笃谟幸嫱蛔凅w的篩選。易錯(cuò)PCR與定點(diǎn)突變技術(shù)相比較，易錯(cuò)PCR不需要預(yù)先知道目的基因的序列（引物結(jié)合部分除外），這有利于研究人員對(duì)基因序列未知蛋白的研究。

目前，利用易錯(cuò)PCR定向改造纖維素酶的報(bào)道很多。唐自鐘等［8］利用易錯(cuò)PCR技術(shù)對(duì)來自枯草芽孢桿菌C－36的內(nèi)切葡聚糖酶基因進(jìn)行定向突變，并通過篩選獲得了一株有益突變體F－10；對(duì)于F－10的研究表明其所分泌的內(nèi)切葡聚糖酶的活性比親本酶提高了4.2倍，測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)易錯(cuò)PCR結(jié)果導(dǎo)致目標(biāo)基因序列中5個(gè)堿基發(fā)生改變，導(dǎo)致2個(gè)氨基酸發(fā)生突變，分別為D212V、T307S。姚友旭等［9］通過易錯(cuò)PCR技術(shù)對(duì)枯草芽孢桿菌C－36內(nèi)切葡聚糖酶基因進(jìn)行定向改造，最終篩選到兩株最佳突變株b－15和b－28；結(jié)果表明，b－15分泌的內(nèi)切葡聚糖酶的活性比親本酶提高了2.1倍，b－28的酶活性比親本酶提高了3.6倍；測序結(jié)果表明，突變體b－15目的基因共有6個(gè)堿基發(fā)生改變，導(dǎo)致4個(gè)氨基酸突變，分別為N134K、Q140L、N403S與Q466L；突變體b－28的目的基因上有一個(gè)堿基發(fā)生變化，導(dǎo)致398位的賴氨酸突變?yōu)榫彼?。張揚(yáng)［10］采用易錯(cuò)PCR對(duì)嗜熱子囊菌的egⅠ基因進(jìn)行定向突變，最終獲得兩株酶活提高的菌株NT0252和NT0253，測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)NT0252中3個(gè)氨基酸發(fā)生突變：F52E、D91N、W170H，NT0253中有3個(gè)氨基酸發(fā)生突變：A14G、H198M、S224C；這些突變導(dǎo)致所產(chǎn)的纖維素酶酶活分別提高了2.19倍和1.88倍，最適溫度分別提高了10℃和5℃，最適pH值由原先的4.0分別變?yōu)?.0和6.0。

2.1.3 DNA 改組 DNA 改組技術(shù)（DNA shuffling），又稱有性PCR，是由stemmer在1994年發(fā)明的。其原理及步驟如下：（1）目的基因的獲得。目的基因可以是單一的基因，或者是某個(gè)基因家族，目的基因之間必須具有一定的同源性。（2）目的基因的隨機(jī)片段化。待改組基因可以通過DNase I或者超聲波等技術(shù)進(jìn)行隨機(jī)切割成一定大小的片段。片段大小與突變頻率、重組頻率密切相關(guān)，片段的大小可以通過控制酶量和反應(yīng)時(shí)間來控制。（3）無引物擴(kuò)增。即不添加引物進(jìn)行PCR。在這個(gè)過程中，不同片段互為引物互為模板，由于配對(duì)的不精確性，就會(huì)在擴(kuò)增中引物突變（缺失、插入、點(diǎn)突變、顛倒、整合等）及重組。（4）有引物PCR。在這一過程中，加入特定的引物對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行擴(kuò)增，從而獲得全長的目標(biāo)片段。（5）篩選。將擴(kuò)增到的目的片段導(dǎo)入宿主進(jìn)行表達(dá)，通過篩選獲得目的功能有所提高的突變株，之后以這些突變株作為下一次DNA改組的模板，重復(fù)1～5次重組，知道獲得性狀改良明顯的突變體。

DNA改組技術(shù)與其他突變技術(shù)相比，其具有諸多優(yōu)勢：（1）可以實(shí)現(xiàn)同源序列間大片段的交換；（2）高通量突變、篩選的技術(shù)；（3）可以進(jìn)行反復(fù)篩選；（4）可以實(shí)現(xiàn)目的蛋白的多種特性的共進(jìn)化；（5）提高了良性突變的概率。DNA改組作為一種體外定向進(jìn)化的技術(shù)，也常常被用于改造纖維素酶分子。姜大磊［11］提取綠色木霉的內(nèi)切葡聚糖酶Ⅰ基因，利用改組技術(shù)對(duì)內(nèi)切葡聚糖酶Ⅰ基因進(jìn)行突變和改造，構(gòu)建了重組突變體庫，并通過選擇性培養(yǎng)基（羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基）篩選到了4株內(nèi)切葡聚糖酶活性較高的突變體S1、S2、S3、S4；通過酶活檢測發(fā)現(xiàn)S1、S2、S3、S4所產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶酶活比親本酶提高了5.75、4.78、3.19、361倍。白玉［12］以嗜熱子囊菌內(nèi)切葡聚糖酶Ⅰ基因?yàn)楦脑鞂?duì)象，利用DNA改組技術(shù)對(duì)野生型egⅠ基因進(jìn)行突變，最終通過篩選獲得一株酶活性較高的菌株BY2，其酶活為23.75U／mL，為原始菌株酶活提高了10倍。林凌［13］從450株海洋菌和陸地樣品中克隆到能夠表達(dá)出具有較高水解活性的內(nèi)切葡聚糖酶基因cel5A；之后通過DNA shuffling技術(shù)對(duì)cel5A進(jìn)行突變，通過剛果紅染色法篩選到3株高活性菌株：M44－11、S75、S78，其所產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶水解羧甲基纖維素鈉的活性是原始菌株的2.03、2.54、2.68倍，其中 M44－11所產(chǎn)的內(nèi)切葡聚糖酶在熱穩(wěn)定性和耐酸堿性都有所提高。

2.2 提高纖維素酶產(chǎn)量的分子改造技術(shù)

提高酶量的分子改造技術(shù)并不針對(duì)酶的空間結(jié)構(gòu)和氨基酸之間的化學(xué)鍵，而是通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子、啟動(dòng)子、密碼子等手段來影響酶的表達(dá)量。

2.2.1 啟動(dòng)子 啟動(dòng)子的本質(zhì)是一段能夠與RNA聚合酶特異性結(jié)合的DNA序列，它可以通過與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合控制基因表達(dá)的程度和起始時(shí)間。而強(qiáng)啟動(dòng)子則是指與RAN聚合酶有著很高親和力的啟動(dòng)子，它能夠知道宿主轉(zhuǎn)錄出大量的mRNA。強(qiáng)啟動(dòng)子常常被用于提高目標(biāo)蛋白的研究中，將強(qiáng)啟動(dòng)子與所需的目標(biāo)蛋白基因整合導(dǎo)入宿主細(xì)胞，讓宿主細(xì)胞表達(dá)大量的目標(biāo)蛋白。目前較為常用的強(qiáng)啟動(dòng)子包括來自大腸桿菌的乳糖操縱子lacP、色氨酸操縱子trpP、多角體蛋白基因啟動(dòng)子、sv40啟動(dòng)子、T7啟動(dòng)子等。

關(guān)于利用強(qiáng)啟動(dòng)子提高纖維素酶產(chǎn)量的報(bào)道很多。Ma等［14］為了提高里氏木霉的纖維素產(chǎn)量，將斜臥青霉的β－葡萄糖苷酶I和T.reesei的cbh1的啟動(dòng)子構(gòu)成的載體導(dǎo)入到里氏木霉中進(jìn)行表達(dá)，通過篩選發(fā)現(xiàn)2株轉(zhuǎn)化菌株產(chǎn)的β－葡萄糖苷酶I的酶活比原始菌株提高了6～8倍。陳科等［15］為了提高celY基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)量，將celY分別與T7啟動(dòng)子、脂蛋白啟動(dòng)子相連接，導(dǎo)入到表達(dá)宿主細(xì)胞中，結(jié)果celY－T7啟動(dòng)子、celY－脂蛋白啟動(dòng)子兩種表達(dá)宿主都在不同程度上提高了纖維素酶的表達(dá)量。

2.2.2 轉(zhuǎn)錄因子 轉(zhuǎn)錄因子是一類蛋白分子，這類蛋白分子能夠參與調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄，在一定程度上影響基因的表達(dá)量。關(guān)于轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控纖維素酶基因表達(dá)的報(bào)道很多。薛番艷等［16］在黑腐病菌中發(fā)現(xiàn)一個(gè)調(diào)控纖維素酶合成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子XC－2736（HpaR1），研究發(fā)現(xiàn)如果突變體中缺失轉(zhuǎn)錄因子HpaR1，則突變體幾乎無法檢測到胞外纖維素酶，之后將HpaR1通過功能反式互補(bǔ)到突變體中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變體恢復(fù)了纖維素酶的活性，這說明HpaR1可以調(diào)控纖維素酶的表達(dá)。張紀(jì)偉［17］在瑞氏木霉中發(fā)現(xiàn)了調(diào)控纖維素酶表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子TrRas2，研究人員當(dāng)將TrRas2用分子手段敲除后，發(fā)現(xiàn)瑞氏木霉表達(dá)纖維素酶的能力明顯降低，而當(dāng)研究人員持續(xù)激活轉(zhuǎn)錄因子TrRas2時(shí)，瑞氏木霉中主要的纖維素基因cbh1和cbh2的表達(dá)量比原始菌株分別提高了73%和128%。

2.2.3 其他方法 Teng等［18］通過優(yōu)化纖維素酶的密碼子組成，使得β－1，3－1，4葡聚糖酶在表達(dá)宿主中的表達(dá)量提高了10倍。Wang等［19］利用RNA干擾技術(shù)將阻遏纖維素酶和木聚糖酶相關(guān)代謝的基因沉默，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RNA干擾后的菌株所產(chǎn)外切葡聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶和木聚糖酶的酶活比原始菌株提高了0.8倍、1.4倍和0.8倍。周廣麒等［20］人構(gòu)建了一株去泛素化酶基因creB缺失的斜臥青霉突變株ΔcreB，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ΔcreB表達(dá)的外切葡聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶、木聚糖酶的酶活比原始菌株分別提高了2.04倍、1.71倍、2.06倍，說明creB基因可能參與了纖維素酶表達(dá)的過程。

3 結(jié)語

纖維素酶作為一種可降解纖維素的高分子復(fù)合酶，具有特異性高、反應(yīng)條件溫和、綠色無污染等降解特點(diǎn)。隨著纖維素酶在各行各業(yè)中的廣泛應(yīng)用，生產(chǎn)者對(duì)于纖維素酶的要求也越來越高，而當(dāng)前已知的自然界纖維素酶已經(jīng)不能夠滿足工業(yè)生產(chǎn)的要求，尋求高產(chǎn)高活性的突變株迫在眉睫。傳統(tǒng)的誘變技術(shù)存在周期長，突變率低等缺點(diǎn)，而分子改造技術(shù)的發(fā)展為研究人員提供了一條全新的思路。近年來，研究人員利用分子改造技術(shù)在改善纖維素酶學(xué)性能和提高纖維素酶產(chǎn)量方面取得了很大的進(jìn)步。雖然離工業(yè)生產(chǎn)要求還有一定的距離，但是相信隨著分子生物學(xué)、生物化學(xué)、生物信息學(xué)等交叉學(xué)科的發(fā)展，以及人們對(duì)纖維素酶分子改造研究的深入，纖維素酶必然會(huì)達(dá)到工業(yè)生產(chǎn)要求，必將在環(huán)境保護(hù)、能源開發(fā)等領(lǐng)域發(fā)揮越來越大的作用。

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