利用斑馬魚模型研究 瓊膠寡糖抗氧化機制

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(1.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東青島 266003; 2.中國科學(xué)院海洋研究所,山東青島 266071; 3.福建環(huán)海生物科技股份有限公司,福建詔安 363502)

瓊膠(Agar)作為海洋紅藻植物細胞壁中的多糖成分,多從石花菜屬(Gelidium)或江蘺屬(Gracilaria)藻類提取獲得,常作為食品添加劑、微生物培養(yǎng)基等廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)和生物技術(shù)領(lǐng)域[1-2]。瓊膠雖無毒無害,但其粘度高、溶解性差,且作為生物大分子難以被人體吸收利用。這極大限制了其在醫(yī)藥、保健食品和化妝品中的高值化應(yīng)用[3]。通過酶法、酸法水解瓊膠獲得的瓊膠寡糖,分子量減小、水溶性好且易被人體吸收,其生物活性和應(yīng)用價值得到顯著提高[1]。

瓊膠寡糖(Agaro-oligosaccharide,AOS)多為1～10個瓊二糖重復(fù)結(jié)構(gòu)單位連接形成的低聚糖,根據(jù)碳鏈還原性末端結(jié)構(gòu)差異可劃分為瓊寡糖(3,6-內(nèi)醚-α-L-半乳糖殘基)和新瓊寡糖(β-D-半乳糖殘基)兩大系列[4]。作為新型的功能性海洋低聚糖,AOS可由酸法或酶法制得,且有多種生物活性,包括抗氧化[5]、抗炎[6-7]、抗腫瘤[8-9]、抗糖尿病[10]和益生元[4]等。Chen等[11-12]曾研究不同酸對瓊膠的降解產(chǎn)物的影響,結(jié)果表明鹽酸在一定條件下可將瓊膠降解為聚合度在2～10偶數(shù)瓊寡糖,且表現(xiàn)出一定的體外抗氧化活性。此外,許多研究證實AOS具有體外抗氧化活性[12-15],單一聚合度AOS在鼠類哺乳動物中的抗氧化活性鮮有報道[12-16],未見多聚合度AOS混合物的體內(nèi)抗氧化活性報道。

利用小鼠等哺乳動物模型研究天然物質(zhì)的抗氧化活性已較為普遍,但這一方法也存在成本高、周期長、操作復(fù)雜等問題。斑馬魚(Daniorerio),一種小型熱帶觀賞魚,屬鯉科淡水脊椎動物,由于其體型小、養(yǎng)殖成本低、繁殖周期短、產(chǎn)卵數(shù)目多、胚胎發(fā)育透明可見等優(yōu)勢已成為國際標準化組織推薦的模式生物[17]。此外,斑馬魚全基因組測序結(jié)果表明了其與人類基因組有87%的同源性,使其成為研究人類疾病的模式動物[18]。近年來,斑馬魚作為模式動物廣泛應(yīng)用于毒理評價、藥物篩選和生物活性評價等諸多領(lǐng)域[17],現(xiàn)已有利用斑馬魚模型評價海洋褐藻中多糖、多酚等物質(zhì)生物活性[19-20],但未見利用斑馬魚模型研究海洋紅藻AOS抗氧化活性的報道。

研究表明,一定濃度的2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二鹽酸鹽(AAPH)可刺激早期斑馬魚胚胎誘發(fā)其體內(nèi)的氧化應(yīng)激過程,機體產(chǎn)生過量且無法清除的活性氧(ROS),ROS又可造成一系列細胞損傷,引起細胞死亡[21-23]。熒光探針染料2,7-二氯二氫熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)本身無熒光,但可穿過生物體細胞膜進入其細胞內(nèi),被胞內(nèi)酯酶水解成不能透過細胞膜的DCFH,從而使探針裝載到細胞內(nèi)。細胞內(nèi)活性氧在過氧化物酶存在下氧化無熒光的DCFH生成有熒光的二氯熒光素(DCF)[24],因此,DCF的熒光強度可顯示機體細胞內(nèi)活性氧相對水平。吖啶橙,一種核酸特異性的異染染料,通過嵌入或靜電吸引與DNA和RNA相互作用,可染色壞死或非常晚期的凋亡細胞[22,25]。由于斑馬魚胚胎、幼魚早期透明可見,因此可通過熒光染料DCFH-DA、吖啶橙等特異性的檢測其體內(nèi)活性氧生成率和細胞死亡率,進一步說明其機體氧化應(yīng)激水平。

本實驗利用優(yōu)化的斑馬魚氧化模型,研究了不同濃度的AOS基本毒性和抗氧化活性,為AOS在功能性食品和化妝品中的應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

成年野生AB系斑馬魚 中國海洋大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院分子醫(yī)學(xué)生物學(xué)實驗室提供;瓊膠(提取原料為江蘺屬龍須菜) 福建環(huán)球海洋生物科技有限公司;AAPH、DCFH-DA、吖啶橙、三卡因 美國sigma公司;氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、硫酸鎂、亞甲基藍、鹽酸 分析純,上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司;瓊二糖、瓊四糖、瓊六糖 日本Takara Bio Inc公司。

Agilent 1260 II液相色譜儀 美國安捷倫公司;Thermo BioBasic SEC-120色譜柱(300 mm×7.8 mm) 美國Thermo公司;SPX-100B-Z型生化培養(yǎng)箱 上海博訊實業(yè)有限公司;SZ61體式顯微鏡 日本奧林巴斯;DMI 6000B倒置熒光顯微鏡 德國Leica公司;FA2004B電子天平 上海天美天平儀器有限公司;Milli Q純水機 默克密理博實驗室設(shè)備(上海)有限公司;FD5-2.5冷凍干燥機 北京金西盟儀器有限公司;斑馬魚全自動循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng) 北京愛生科技發(fā)展有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 AOS的制備 AOS的制備方法參考陳海敏等[26]的研究。將5 g瓊膠粉末加入100 mL 0.5 mol/L的鹽酸中攪拌均勻,加熱至100 ℃條件下反應(yīng)3 h后,再加入5 g瓊膠粉末繼續(xù)在100 ℃水解反應(yīng)3 h。反應(yīng)結(jié)束后,將水解產(chǎn)物冷卻至室溫后過濾、凍干(溫度:-55 ℃;時間:48 h;壓強:<1.33 Pa)。

1.2.2 AOS成分測定 稱量0.05 g凍干粉末用1 mL去離子水溶解后,用高效液相色譜法測定其比例和組成,色譜柱為 Thermo BioBasic SEC-120色譜柱,檢測器為示差檢測儀檢測,流速為0.5 mL/min,流動相為40%甲醇。使用商品化的瓊二糖、瓊四糖和瓊六糖(均為5 mg/mL)作標準品對制備的AOS進行定性分析,根據(jù)出峰時間和峰面積計算各聚合度AOS的組成比例。

1.2.3 斑馬魚喂養(yǎng)及胚胎收集 斑馬魚飼養(yǎng)于全自動循環(huán)系統(tǒng)中,參照Westerfield[27]的方法養(yǎng)殖、培育,(26±1) ℃水環(huán)境,光周期為照明14 h/黑暗10 h 交替進行,每日以一定量的豐年蝦(鹵蟲)于早晚固定時間各飼喂一次。實驗用胚胎由健康雌雄斑馬魚自然交配獲得。收集300～400枚胚胎于干凈培養(yǎng)皿中并移除排泄物、雜質(zhì)及未受精胚胎,加入胚胎培養(yǎng)液(10% NaCl,0.3% KCl,0.3% CaCl2,0.79% MgSO4,0.1%亞甲基藍),轉(zhuǎn)移于(28.5±1) ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7～9 h。

1.2.4 胚胎給藥 篩選受精且發(fā)育至7～9 hpf(hours post fertilization,受精小時)同時期的斑馬魚胚胎,移入24孔細胞培養(yǎng)板中,每孔15枚胚胎,除去殘留培養(yǎng)液后,根據(jù)實驗設(shè)計,每孔分別加入用胚胎培養(yǎng)液稀釋的AOS活性物(25、50、100、150、200、400 μg/mL)或AAPH誘導(dǎo)物(10、15、20、25、30 mmol/L),純胚胎培養(yǎng)液作空白對照,每個濃度3個孔(平行)[21]?；钚晕锖驼T導(dǎo)物給藥后,將24孔板轉(zhuǎn)移于(28.5±1) ℃恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)待后續(xù)觀察及檢測。

1.2.5 AAPH誘導(dǎo)斑馬魚氧化模型優(yōu)化 根據(jù)文獻[21-23],選擇不同濃度(10、15、20、25、30 mmol/L)AAPH,進行單因素的氧化應(yīng)激造模優(yōu)化。8～9 hpf給藥,3 dpf統(tǒng)計幼魚存活率、正常發(fā)育率,并檢測幼魚體內(nèi)活性氧生成率和細胞死亡率。

1.2.6 AOS毒性評價 根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果,選擇50、100、200、400 μg/mL AOS在7～8 hpf給藥,3 dpf時期進行幼魚存活率統(tǒng)計、幼魚體內(nèi)活性氧生成率和細胞死亡率的檢測。

1.2.7 AOS抗氧化活性評價 選擇無過氧化毒性的AOS安全濃度于7～8 hpf進行胚胎給藥,在(28.5±1) ℃恒溫培養(yǎng)箱中預(yù)孵育,1 hpf后選用得到的最優(yōu)AAPH誘導(dǎo)濃度進行氧化應(yīng)激誘導(dǎo),3 dpf時期進行幼魚存活率統(tǒng)計、幼魚體內(nèi)活性氧生成率和細胞死亡率檢測。

1.2.8 指標測定

1.2.8.1 斑馬魚表型觀察及存活率統(tǒng)計 每天于體式顯微鏡下觀察胚胎發(fā)育狀況,記錄并及時移除死亡胚胎(死亡胚胎發(fā)白,死亡幼魚無心跳,且尾部彎折),統(tǒng)計胚胎發(fā)育至3 dpf時期各孔幼魚存活率情況及發(fā)育狀況(存活率=3 dpf存活個數(shù)/總個數(shù),正常發(fā)育個數(shù)=3 dpf正常個數(shù)/總個數(shù))。

1.2.8.2 體內(nèi)活性氧生成率和細胞死亡率檢測 3 dpf時期,加入吖啶橙或DCFH-DA 等熒光試劑,于28 ℃培養(yǎng)箱中避光孵育。后用三卡因麻醉劑麻醉幼魚,于熒光顯微鏡下捕獲熒光圖片,并用Image J軟件分析、統(tǒng)計相對熒光強度。體內(nèi)細胞死亡率以吖啶橙染色后給藥組熒光強度與空白組熒光強度之比進行統(tǒng)計,體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生以DCFH-DA染色給藥組熒光強度與空白組熒光強度之比進行統(tǒng)計。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有的實驗至少重復(fù)三次,結(jié)果以M±SD表示,通過one-way ANOVA對實驗結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析,運用多重比較Turkey檢驗分析實驗數(shù)據(jù)間的差異性。所示結(jié)果中,p<0.05判斷為具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 AOS的組成

自制AOS的高效液相色譜見圖1。結(jié)果表明,制備的AOS為不同聚合度瓊寡糖混合物,主要是瓊二糖、瓊四糖和瓊六糖,占比分別為51.60%、28.40%、14.50%。課題組前期對瓊二糖、瓊四糖、瓊六糖分離純化后,分別測定了其細胞水平的抗氧化活性,結(jié)果表明,相同濃度下混合物的活性大于單一組分活性。因此,本論文以未經(jīng)純化的AOS混合樣品作為研究對象,探究其在斑馬魚體內(nèi)的抗氧化活性。

圖1 自制AOS的液相色譜圖Fig.1 HPLC spectrogram of the prepared AOS

2.2 AAPH誘導(dǎo)斑馬魚氧化模型優(yōu)化

2.2.1 AAPH誘導(dǎo)濃度對斑馬魚胚胎存活發(fā)育的影響 如圖2A所示,各實驗濃度下的AAPH均導(dǎo)致了一定數(shù)量的胚胎死亡現(xiàn)象,且胚胎存活率與AAPH誘導(dǎo)濃度呈劑量依賴性下降,

圖2 AAPH誘導(dǎo)濃度對斑馬魚胚胎存活發(fā)育的影響Fig.2 Effect of AAPH-induced concentration on the survival and development of zebrafish embryo注:柱形圖上方不同字母代表 差異性顯著,p<0.05,圖4～圖10同。

但存活率都在50%以上,未達到半數(shù)致死劑量,均可供進一步實驗。但通過胚胎發(fā)育情況圖2B結(jié)果表明,高濃度(25、30 mmol/L)AAPH對斑馬魚胚胎發(fā)育造成嚴重損傷,正常發(fā)育率過低(40.77%、28.32%),且結(jié)合圖2C可知,3 dpf斑馬魚正常發(fā)育狀態(tài)如圖2C(f)所示,非正常發(fā)育狀態(tài)則如圖2C(a)～圖2C(e)所示,表現(xiàn)出發(fā)育遲緩、著色淺、卵黃囊腫大、尾部彎折、畸形等形態(tài),因此,較低的正常發(fā)育率不利于后續(xù)體內(nèi)熒光指標檢測,而低、中濃度(10、15、20 mmol/L)AAPH對斑馬魚胚胎損傷較為適宜,均可滿足后續(xù)檢測。

2.2.2 AAPH誘導(dǎo)濃度對斑馬魚幼魚體內(nèi)氧化應(yīng)激水平的影響 斑馬魚幼魚在低、中濃度AAPH誘導(dǎo)后的熒光檢測結(jié)果如圖3和圖4。結(jié)果表明,15 mmol/L AAPH誘導(dǎo)斑馬魚胚胎可顯著提高其幼魚體內(nèi)過氧化應(yīng)激水平(p<0.05),與空白組相比,其活性氧產(chǎn)生率能達109.37%,細胞死亡率可達121.43%,高于10、20 mmol/L AAPH誘導(dǎo)引起的過氧化應(yīng)激水平。因此,后續(xù)實驗選擇最優(yōu)15 mmol/L AAPH誘導(dǎo)濃度進行造模誘導(dǎo)。此最優(yōu)濃度與Kim等[22]、Lee等[28]的AAPH誘導(dǎo)濃度相同,實驗結(jié)果可取。

圖3 AAPH誘導(dǎo)濃度對斑馬魚體內(nèi)活性氧生成率的影響Fig.3 Effect of AAPH-induced concentration on the reactive oxygen species production rate in vivo

圖4 AAPH誘導(dǎo)濃度對斑馬魚體內(nèi)細胞死亡率的影響Fig.4 Effect of AAPH-induced concentration on the cell death rate in vivo

2.3 AOS毒性評價

2.3.1 不同濃度AOS對斑馬魚胚胎存活發(fā)育的影響 選擇較大濃度梯度(50、100、200、400 μg/mL)AOS進行毒性評價的結(jié)果如圖5所示。50、100、200 μg/mL AOS對斑馬魚胚胎均無致畸、致死毒性,而高濃度400 μg/mL AOS對斑馬魚胚胎有較低的毒性,與空白對照組相比差異顯著(p<0.05),其存活率降低至93.33%。

圖5 AOS濃度對斑馬魚胚胎的存活率的影響Fig.5 Effect of AOS concentration on survival rate of zebrafish embryos

2.3.2 不同濃度AOS對斑馬魚幼魚體內(nèi)氧化應(yīng)激水平的影響 如圖6、圖7,與空白組以及低濃度AOS組(≤200 μg/mL)相比,400 μg/mL AOS顯著提高了斑馬魚幼魚體內(nèi)的細胞死亡率(113.94%)和活性氧自由基產(chǎn)率(123.09%，p<0.05)。此外,200 μg/mL AOS對斑馬魚胚胎雖無致畸、致死作用(圖5),但與空白組相比(圖6),該濃度下斑馬魚幼魚體內(nèi)活性氧自由基水平表現(xiàn)出非顯著性的升高(103.93%),表現(xiàn)出極弱的氧化刺激作用。因此可推測,低于200 μg/mL濃度的AOS對斑馬魚無胚胎損傷和氧化刺激,可作為活性評價的安全濃度。

圖6 AOS濃度對斑馬魚幼魚體內(nèi)活性氧生成率的影響Fig.6 Effect of AOS concentration on the reactive oxygen species production rate in vivo

圖7 AOS濃度對斑馬魚幼魚體內(nèi)細胞死亡率的影響Fig.7 Effect of AOS concentration on the cell death rate in vivo

Wijesinghe等[29]發(fā)現(xiàn)紅藻江蘺屬(Laurenciasnackeyi)藻中活性物質(zhì)5-Hydroxypalisadin B對斑馬魚幼魚的氧化應(yīng)激毒性,研究表明濃度為5 μg/mL時時可顯著提高斑馬魚幼魚體內(nèi)的細胞死亡率,發(fā)生過氧化應(yīng)激反應(yīng),而本實驗中400 μg/mL AOS才顯著提高幼魚體內(nèi)的細胞死亡率(p<0.05),表明AOS的氧化應(yīng)激毒性較弱,應(yīng)用前景更廣。

2.4 AOS活性評價

2.4.1 不同濃度AOS對AAPH誘導(dǎo)的斑馬魚胚胎存活率的影響 由圖8可知,與對照組相比,各濃度組AOS對AAPH誘導(dǎo)的斑馬魚氧化損傷均表現(xiàn)出顯著?；钭饔?p<0.05),其中25、50、100 μg/mL AOS預(yù)孵育后,斑馬魚存活率由70%劑量依賴性地分別提高至80.00%、90.00%、96.88%。其最優(yōu)AOS濃度為100 μg/mL,經(jīng)該濃度AOS預(yù)孵育后,斑馬魚存活率與空白組無顯著差異(p>0.05)。

圖8 AOS對AAPH誘導(dǎo)的斑馬魚胚胎的存活率的影響Fig.8 Effect of AOS on survival rate of AAPH-induced zebrafish embryos 注:+即前期給藥;-即前期未給藥,圖9～圖10同。

2.4.2 不同濃度AOS對AAPH誘導(dǎo)的斑馬魚幼魚體內(nèi)氧化應(yīng)激水平的影響 前期15 mmol/L AAPH給藥刺激斑馬魚胚胎,使斑馬魚氧化損傷死亡率達30%左右。由圖9知,受AAPH誘導(dǎo)刺激存活的胚胎發(fā)育到3 dpf幼魚出膜時期,其體內(nèi)的活性氧自由基產(chǎn)生率較未受AAPH誘導(dǎo)的空白組而言顯著升高(108.87%,p<0.05);而預(yù)孵育AOS(25、50、100 μg/mL)后,其體內(nèi)的活性氧自由基生成率劑量依賴性的下降(106.62%、102.81%、100.53%),且當(dāng)AOS濃度為100 μg/mL時,其體內(nèi)的活性氧自由基生成率同空白組無顯著性差異(100.53%,p>0.05)。預(yù)孵育150 μg/mL AOS時,不能降低AAPH誘導(dǎo)引起產(chǎn)生的過多活性氧,且此情況下斑馬魚幼魚體內(nèi)活性氧生成率為109.28%,略高于僅AAPH誘導(dǎo)組,為108.87%。由此可見,100 μg/mL AOS為最優(yōu)抗氧化濃度。

圖9 AOS對AAPH誘導(dǎo)的斑馬魚 幼魚體內(nèi)活性氧生成率的影響Fig.9 Effect of AOS on the reactive oxygen species production rate of AAPH-induced zebrafish in vivo

斑馬魚3 dpf時期用吖啶橙對存活幼魚進行細胞死亡特異性染色如圖10。與空白組相比,僅AAPH誘導(dǎo)組其細胞死亡率顯著性升高(120.37%,p<0.05),實驗中預(yù)孵育各濃度AOS(25、50、100、150 μg/mL)均降低了由AAPH氧化損傷引起的細胞死亡率。此外,用25、50、100 μg/mLAOS預(yù)孵育斑馬魚胚胎,能劑量依賴性地降低由AAPH引起的高細胞死亡率,且預(yù)孵育濃度為100 μg/mL時斑馬魚幼魚體內(nèi)死亡率與空白組無顯著性差異(p>0.05)。而預(yù)孵育150 μg/mL AOS時,斑馬魚幼魚體內(nèi)細胞死亡率較100 μg/mL濃度組(101.69%)非顯著性的升高(107.94%)。此實驗結(jié)果進一步表明100 μg/mL AOS為最優(yōu)抗氧化濃度。

圖10 AOS對AAPH誘導(dǎo)的斑馬魚 幼魚體內(nèi)細胞死亡率的影響Fig.10 Effect of AOS on cell death rate of AAPH-induced zebrafish in vivo

以上實驗結(jié)果均表明了一定濃度的AOS具有良好的抗氧化活性,且其最優(yōu)抗氧化濃度為100 μg/mL,這一結(jié)果優(yōu)于Kim等[23]利用同一模型研究的褐藻糖膠的最優(yōu)抗氧化濃度(200 μg/mL)。由此可見,AOS的抗氧化活性較高,具有極大的利用價值和市場前景。

3 結(jié)論與討論

本研究優(yōu)化了AAPH誘導(dǎo)斑馬魚氧化應(yīng)激模型,并利用該模型首次評價了AOS的抗氧化活性。實驗結(jié)果顯示,在最優(yōu)AAPH誘導(dǎo)濃度(15 mmol/L)下,斑馬魚幼魚體內(nèi)氧化應(yīng)激達到最高水平,低于200 μg/mL濃度瓊膠寡糖對斑馬魚胚胎無明顯氧化損傷。一定濃度瓊膠寡糖(25、50、100 μg/mL)劑量依賴性的減小斑馬魚體內(nèi)氧化應(yīng)激水平,100 μg/mL瓊膠寡糖不僅顯著提高AAPH誘導(dǎo)引起的低存活率(p<0.05),而且顯著降低AAPH誘導(dǎo)引起的斑馬魚幼魚體內(nèi)高活性氧生成率和細胞死亡率(p<0.05),且實驗中使用的瓊膠寡糖抗氧化效果優(yōu)于已報道的褐藻糖膠[23]。

已報道的AOS抗氧化作用機理有多種,宋香凝等[5]的體外自由基清除實驗已證明AOS對自由基清除能力強弱為:羥自由基的清除能力>ABTS自由基清除能力>DPPH自由基清除能力;Chen等[12,16]利用H2O2誘導(dǎo)損傷的人肝臟細胞氧化模型研究了不同聚合度AOS通過清除胞內(nèi)活性氧自由基(ROS)表現(xiàn)出不同的抗氧化活性;薛長湖等[14]、陳海敏[15]通過對肝損傷的鼠氧化模型灌胃AOS的研究表明,AOS可以提高小鼠體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽酶(GSH)等抗氧化酶的活性清除多余自由基,最終達到抗氧化的目的。本研究結(jié)果則表明了AOS的又一抗氧化機理,即一定濃度AOS(25、50、100 μg/mL)可通過直接清除AAPH誘導(dǎo)的斑馬魚幼魚體內(nèi)ROS,和減少細胞死亡率實現(xiàn)其抗氧化活性,不僅佐證了AOS的潛在抗氧化活性,而且為AOS作為天然抗氧化資源的開發(fā)利用提供了又一理論依據(jù)。而瓊二糖、瓊四糖和瓊六糖的混合物,其混合協(xié)同作用及在機體內(nèi)的作用機制還需進一步研究。