生物樣本庫(kù)冷凍樣本的質(zhì)量控制新進(jìn)展

嵇承棟， 章佳英 綜述， 于德華 審校

(同濟(jì)大學(xué)附屬楊浦醫(yī)院科研管理科，上海 200090)

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·綜 述·

生物樣本庫(kù)冷凍樣本的質(zhì)量控制新進(jìn)展

嵇承棟， 章佳英 綜述， 于德華 審校

(同濟(jì)大學(xué)附屬楊浦醫(yī)院科研管理科，上海 200090)

生物樣本庫(kù)作為基礎(chǔ)研究成果向臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化的平臺(tái),在疾病診斷、新藥研發(fā)、疾病相關(guān)基因檢測(cè)及流行病學(xué)研究中均有重要作用。對(duì)生物樣本庫(kù)全程進(jìn)行質(zhì)量管理和控制，制定標(biāo)準(zhǔn)化操作流程，收取臨床資料及隨訪資料完整的患者血清、血漿、血細(xì)胞、組織等樣本，并按照各自的標(biāo)準(zhǔn)化操作流程進(jìn)行處理、分裝、儲(chǔ)存和使用。質(zhì)量管理既是樣本庫(kù)建設(shè)的關(guān)鍵，也是樣本庫(kù)運(yùn)轉(zhuǎn)的中心環(huán)節(jié)，還是高質(zhì)量規(guī)范化醫(yī)學(xué)研究的基礎(chǔ)保障。本文旨在探討生物樣本庫(kù)冷凍樣本質(zhì)量管理體系的構(gòu)建。

生物樣本庫(kù)； 質(zhì)量控制； 冷凍樣本； 綜述

標(biāo)準(zhǔn)化、高質(zhì)量的生物樣本庫(kù)是重大疾病或罕見(jiàn)疾病基礎(chǔ)與臨床研究、先進(jìn)臨床診療技術(shù)及藥物靶點(diǎn)研發(fā)、健康預(yù)防研究，即實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的重要源頭與關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，毫無(wú)疑問(wèn)也是當(dāng)今生命科學(xué)原創(chuàng)性研究、生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)自主創(chuàng)新體系中至關(guān)重要的環(huán)節(jié)與保證。因此，生物樣本庫(kù)被認(rèn)為是連接基礎(chǔ)研究與臨床應(yīng)用的橋梁。

1 生物樣本庫(kù)冷凍樣本的質(zhì)量控制

1.1 生物樣本庫(kù)的定義

廣義的生物樣本庫(kù)按照經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織2001年的定義可稱為生物資源中心。具體定義為： 生物資源中心是支撐生命科學(xué)和生物科技的基礎(chǔ)設(shè)施，包括眾多儲(chǔ)存和供應(yīng)機(jī)構(gòu)，提供活細(xì)胞、有機(jī)體基因組以及與生物系統(tǒng)的遺傳和功能相關(guān)的信息。生物資源中心收集可培養(yǎng)的生物體(如微生物、植物、動(dòng)物以及人類細(xì)胞)及其中可復(fù)制的成分(如基因組、質(zhì)粒、病毒、cDNA)、有活性但是不能培養(yǎng)的有機(jī)體、細(xì)胞和組織與含有這些收集物的分子、生理、結(jié)構(gòu)信息以及相關(guān)生物信息學(xué)的數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.2 生物樣本庫(kù)冷凍樣本的種類

生物樣本庫(kù)收集的生物樣本包括體液樣本和組織樣本。體液樣本又分為唾液、血液、尿液、精液、乳汁、糞便等；組織樣本分為組織、毛發(fā)、指甲等；而從血液樣本中又可分離出血漿、血清、紅細(xì)胞、PBMCs(外周血單個(gè)核細(xì)胞)、DNA和RNA等；以及與這些生物樣本相關(guān)的知情同意、病理、臨床、治療和隨訪等資料及其質(zhì)量控制與信息管理系統(tǒng)。

1.3 生物樣本庫(kù)質(zhì)量控制的定義

生物樣本庫(kù)質(zhì)量控制是在質(zhì)量方面指揮和控制生物樣本庫(kù)的過(guò)程，也是在質(zhì)量方面指揮和控制生物樣本庫(kù)建立方針和目標(biāo)并為實(shí)現(xiàn)這些目標(biāo)而相互關(guān)聯(lián)或相互作用的一組要素。這里的要素包括： 組織結(jié)構(gòu)、程序、過(guò)程和資源，涉及生物樣本庫(kù)在收集樣本過(guò)程中的標(biāo)準(zhǔn)化操作規(guī)程和相應(yīng)的保存條件和在診斷分析過(guò)程中的可行性和準(zhǔn)確性的質(zhì)量控制。

1.4 生物樣本庫(kù)質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)

迄今為止，國(guó)際上尚無(wú)統(tǒng)一的生物樣本庫(kù)質(zhì)量管理標(biāo)準(zhǔn)體系，用于不同下游實(shí)驗(yàn)的樣本都有最適的收集方法，放置時(shí)間、固定方法及相應(yīng)的儲(chǔ)存條件和時(shí)間。相應(yīng)的質(zhì)量控制范圍主要包括： 血清和血漿樣本用于測(cè)定K+、白介素類、維生素E、金屬蛋白酶類、腎上腺皮質(zhì)激素等指標(biāo)時(shí)對(duì)樣本離心前后的放置時(shí)間，存儲(chǔ)時(shí)間、存儲(chǔ)溫度、存儲(chǔ)條件等都做了相應(yīng)規(guī)定；尿液樣本用于測(cè)定腫瘤壞死因子、腎上腺素、抗胰蛋白酶等指標(biāo)時(shí)對(duì)離心前放置時(shí)間、儲(chǔ)存條件、凍融方式等做了相應(yīng)規(guī)定；腦脊液用于測(cè)定半胱氨酸蛋白酶抑制劑對(duì)樣本的儲(chǔ)存條件做了具體要求；固體組織樣本用于測(cè)定次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、肌動(dòng)蛋白等指標(biāo)時(shí)對(duì)組織的缺血時(shí)間做了具體要求。

2 生物樣本庫(kù)冷凍樣本的質(zhì)量控制情況分析

從Pubmed數(shù)據(jù)庫(kù)用檢索式(biobank*) AND quality control，收集文獻(xiàn)共108篇，Biopreserv Biobank雜志收錄最多，其次是Clin Biochem雜志。其中在2010—2014年，挑選了30篇關(guān)于生物樣本庫(kù)冷凍樣本質(zhì)量控制的文章，涉及蛋白質(zhì)、DNA、RNA和組織樣本等[1-4]。

2.1 生物樣本庫(kù)冷凍樣本的質(zhì)量控制研究工作的排名

關(guān)于全球的生物樣本庫(kù)冷凍樣本的質(zhì)量控制工作機(jī)構(gòu)，西方國(guó)家在生物樣本庫(kù)質(zhì)量控制方面的研究機(jī)構(gòu)較多，排名前幾位的主要集中在歐洲： 意大利(15.29%)、瑞典(15.14%)、挪威(14.08%)、英國(guó)(13.57%)，這可能與建設(shè)生物樣本庫(kù)起步早有關(guān)，此外法國(guó)所占比例為11.10%、加拿大為10.63%。近年來(lái)，亞洲的韓國(guó)(10.91%)和中國(guó)(9.28%)也開(kāi)始重視這方面的研究，逐漸在生物樣本庫(kù)冷凍樣本的研究機(jī)構(gòu)中占有一席之地。

2.2 生物樣本庫(kù)冷凍樣本的質(zhì)量控制研究所關(guān)注的方向

生物樣本庫(kù)冷凍樣本的質(zhì)量控制工作，研究最多的是蛋白質(zhì)(58.62%)、RNA(25.00%)，其次是維生素(4.74%)、肽(2.37%)、激素(2.59%)。

收集的樣本類型主要集中在組織樣本(25.65%)，其次為血漿樣本(19.07%)(包括EDTA、檸檬酸鈉、肝素抗凝的血樣本)、PBMCs(18.97%)(包括檸檬酸鈉、ACD、EDTA抗凝的血液樣本)、血清(16.92%)、尿液(14.22%)，另外，也有收集腦脊液(5.17%)樣本的樣本庫(kù)。

3 生物樣本庫(kù)冷凍樣本的質(zhì)量控制特點(diǎn)

3.1 DNA樣本的質(zhì)量控制

全血中提取的DNA，可以用于全基因測(cè)序、SNP基因?qū)嶒?yàn)和其他的DNA實(shí)驗(yàn)。DNA的質(zhì)量涉及濃度、純度和序列等方面內(nèi)容[5]。一般情況下，光譜分析法通常用于核苷酸濃度及純度的評(píng)估(包括DNA或RNA)。因?yàn)镈NA和RNA在260nm附近有最大吸收峰，蛋白質(zhì)的最強(qiáng)吸收峰在280nm附近。而一些雜質(zhì)，如EDTA、碳水化合物、酚等物質(zhì)在230nm處有吸收峰。因此，A260/A280和A260/A230的比值即可代表核苷酸的純度。如DNA樣品的A260/A280比值在1.8～2.0之間，A260/A230>2.0，說(shuō)明純度高。然而，DNA樣品的A260/A230比值在1.7～2.0之間，也能用于分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。DNA濃度(μg/ml)的計(jì)算公式： 50×OD260。熒光染料，如PicoGreen、Hoechest 33258和SYBR Green Ⅰ一直被用來(lái)評(píng)價(jià)DNA雙鏈的數(shù)量。其中，PicoGreen(激發(fā)波長(zhǎng)是480nm，發(fā)射波長(zhǎng)是520nm)，測(cè)定DNA最敏感、最方便。DNA的完整性則采用兩種方法分析，凝膠電泳和PCR。微量的DNA降解即可以從凝膠電泳中看出，同時(shí)還能估算DNA濃度。DNA的完整性采用凝膠電泳分析，DNA的純度規(guī)定為A260/A230比值≥1.8，1.8≤A260/A280比值≤2.0。如果凝膠電泳發(fā)現(xiàn)DNA有降解，則進(jìn)一步作PicoGreen分析。

Ruan L[5]等人選擇了小牛胸腺作為DNA參考材料，DNA濃度測(cè)定采用光譜分析法(NanoDrop 2000 Spectrophotometer與Eppendorf BioSpectro-meter)，評(píng)價(jià)了兩種儀器的精密度、準(zhǔn)確性和線性，同時(shí)也作了批內(nèi)和批間調(diào)查。期間，利用了West-gard’s規(guī)則來(lái)控制樣本的DNA質(zhì)量。結(jié)果，NanoDrop 2000 Spectrophotometer更能準(zhǔn)確表達(dá)DNA的濃度。

3.2 RNA樣本的質(zhì)量控制

與DNA相比，RNA較難保存，因此有人使用特殊的采血管收集血液，提取RNA。Zhang[7]等比較了EDTA-K2和PAXgene Blood RNA Tubes兩種血液采集管中mRNA的變化，以及各個(gè)時(shí)間點(diǎn)和不同的保存溫度對(duì)mRNA的影響。實(shí)驗(yàn)篩選出40個(gè)基因，PAXgene Blood RNA Tubes采血管選出了16個(gè)最有質(zhì)控意義的基因；而EDTA-K2采血管中，選出了24個(gè)最有意義的候選質(zhì)控基因，其中8個(gè)顯著低表達(dá)和16個(gè)顯著高表達(dá)。這些生物標(biāo)志物得到了SPIDIA-RNA的進(jìn)一步驗(yàn)證，證明了這些生物標(biāo)記物可以作為質(zhì)量控制工具分析血液樣本中mRNA的變化。

在Erasmus MC tissue bank中，每年隨機(jī)抽取庫(kù)存樣本的2%，提取RNA測(cè)定其完整性(RIN)。評(píng)價(jià)了保存20年的癌組織樣本，15年的肝臟樣本(-80℃)，13年的病理活檢組織(液氮保存)，認(rèn)為不同的保存方法及溫度和時(shí)間之間并無(wú)差別。一般來(lái)說(shuō)，RIN低的組織樣本，其脂肪、纖維和壞死組織含量往往較高，當(dāng)樣本的RIN≥6.5時(shí)，其受檢樣本腫瘤部分≥90%。而Le Page C等人[2]認(rèn)為RIN數(shù)量≥7即是好的RNA。

冷凍干燥法能夠保存組織形態(tài)、DNA、蛋白質(zhì)，但RNA在1～2年后出現(xiàn)緩慢降解。最近，有研究人員嘗試了生物樣本的新保存技術(shù)[8-9]。

3.3 新鮮冷凍組織質(zhì)量控制

福爾馬林固定石蠟包埋組織有很大的實(shí)用價(jià)值，但是用途受到限制。保存良好的組織樣本是基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組研究的前提，為研究者提供高品質(zhì)的生物樣本及相關(guān)信息是生物樣本庫(kù)的使命。在NBK[10]中，隨機(jī)抽檢儲(chǔ)存樣本的3%，測(cè)定組織中提取的RNA，其質(zhì)量評(píng)估包括兩個(gè)方面，即濃度和純度。RNA的濃度采用分光光度法測(cè)定，RNA的完整性采用凝膠電泳法鑒定。研究結(jié)果表明，組織形態(tài)學(xué)和蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性得到了很好的保護(hù)。事實(shí)上，從真空冷藏系統(tǒng)保存組織中提取的RNA可以用于基因擴(kuò)增，但是需要采用更高敏感性的檢測(cè)方法，如RT-PCR。從上述研究結(jié)果可以得出，該真空冷藏系統(tǒng)適合于生物樣本的短期保存[8-9]。

磷酸化蛋白是一種不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，生物樣本處理過(guò)程將會(huì)影響其穩(wěn)定性。Kofanova[11]等人研究了關(guān)于磷酸化蛋白的組織穩(wěn)定性和蛋白質(zhì)提取方法，比較了heat stabilization和snap-freezing兩種方法，和兩種蛋白質(zhì)提取方法(兩種不同的提取緩沖液： 一種是8M尿素；另一種是Bio-Rad緩沖液，不含尿素)。對(duì)于snap-freezing樣本，兩種緩沖液得到的蛋白質(zhì)產(chǎn)量無(wú)差別。而對(duì)于heat stabilization樣本，用尿素緩沖液提取的蛋白質(zhì)總量明顯低于不含尿素的緩沖液。然而，用heat stabilization樣本的特異磷酸化蛋白濃度明顯高于速凍樣本。用BioPlex分析了磷酸化蛋白Akt、p-ERK 1/2、p-lkBa、p-JNK和p38 MAPK，得出用作磷酸化蛋白分析的組織樣本，可以采用heat stabilization的方法，同時(shí)，BioPlex磷酸化蛋白分析可以作為評(píng)估組織樣本完整性的質(zhì)控方法。

如果尚未獲得組織對(duì)缺血耐受程度的資料，權(quán)宜之計(jì)，可以采用在20min內(nèi)速凍的方法。組織樣本的反復(fù)凍融次數(shù)也因組織類型而異，組織樣本保存在-80℃中時(shí)，DNA和蛋白質(zhì)可以穩(wěn)定數(shù)年，而RNA則只能保存5年。RNA可以借助RNAlater或其他RNA穩(wěn)定液，放置-80℃能夠適當(dāng)延長(zhǎng)保存期。-150℃的保存效果是否比-80℃好，尚未得到證實(shí)。

3.4 液氮罐微生物污染控制

微生物的污染情況與生物樣本的來(lái)源有關(guān)，一定程度上取決于樣本捐獻(xiàn)者的健康狀況。而微生物的污染情況可以用特殊引物(16S rRNA)結(jié)合PCR的方法證實(shí)。NBK等[10]研究了保存6～35年液氮罐中胚胎凍存管中的微生物污染情況，隨機(jī)抽樣發(fā)現(xiàn)了32種細(xì)菌和一種真菌。被檢出的細(xì)菌有大腸埃希菌，即自然界中廣泛存在的正常菌群；其中，最常見(jiàn)的是嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌，這種細(xì)菌在體外可以嚴(yán)重影響土壤肥沃程度及胚胎發(fā)育，進(jìn)一步用脈沖場(chǎng)凝膠電泳分析發(fā)現(xiàn)這種細(xì)菌并非由于液氮與胚胎的交叉污染引起。

3.5 淋巴母細(xì)胞樣細(xì)胞系(LCLs)的質(zhì)量控制

淋巴母細(xì)胞樣細(xì)胞系是一種細(xì)胞株，廣泛應(yīng)用于各種研究。在生物樣本庫(kù)建設(shè)中，主要作為大量DNA的來(lái)源，用于質(zhì)量控制研究。一般來(lái)說(shuō)，細(xì)胞的質(zhì)量評(píng)估涉及細(xì)胞活力、細(xì)胞的鑒定和微生物污染情況等方面。細(xì)胞活力代表細(xì)胞的增殖能力；細(xì)胞的鑒定主要看是否有交叉污染，可以借助形態(tài)學(xué)工具檢測(cè)、DNA染色或免疫表型分析[12]。

4 結(jié)語(yǔ)與展望

總之，在質(zhì)量控制過(guò)程中，除了標(biāo)準(zhǔn)化操作規(guī)程與保存方法，還有人試圖尋找監(jiān)測(cè)生物樣本穩(wěn)定性的標(biāo)記物。然而，目前只有少數(shù)標(biāo)志物符合這些標(biāo)準(zhǔn)，如ProGRP可以用于血清/血漿樣本的處理和儲(chǔ)存的候選指標(biāo)[1]；如CD40L用于評(píng)估血清在高溫中暴露的時(shí)間；VEGF用來(lái)評(píng)價(jià)樣本凍融的次數(shù)。不過(guò)，穩(wěn)定標(biāo)記物隨著生物樣本的使用目的而異[13]，不能一概而論，至今尚無(wú)統(tǒng)一的穩(wěn)定標(biāo)記物，質(zhì)量評(píng)估方法也應(yīng)該根據(jù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)而調(diào)整，最理想的方法是那些有已知預(yù)分析標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)控分析物的參考范圍。因此，制定生物樣本質(zhì)量的全面評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)和研制多項(xiàng)質(zhì)量控制標(biāo)記物已迫在眉睫。

[1] Brimo F, Aprikian A, Latour M, et al. Strategies for Biochemical and Pathologic Quality Assurance in a Large Multi-Institutional Biorepository; The Experience of the PROCURE Quebec Prostate Cancer Biobank[J]. Biopreservation and biobanking, 2013,11(5)： 285-290.

[2] Le Page C, K?bel M, De Ladurantaye M, et al. Specimen quality evaluation in Canadian biobanks participating in the COEUR repository[J]. Biopre-servation and biobanking, 2013,11(2)： 83-93.

[3] Shabihkhani M, Lucey G M, Wei B, et al. The procurement, storage, and quality assurance of frozen blood and tissue biospecimens in pathology, biorepository, and biobank settings[J]. Clinical biochemistry, 2014,47(4)： 258-266.

[4] Wei B-R, Simpson R M. Digital pathology and image analysis augment biospecimen annotation and biobank quality assurance harmonization[J]. Clinical bioc-hemistry, 2014,47(4)： 274-279.

[5] Ruan L, Song Y, Fan J, et al. The Shanghai Biobanking DNA Quality Control Program[J]. Biopreservation and biobanking, 2014,12(4)： 259- 264.

[6] Yin P, Peter A, Franken H, et al. Preanalytical aspects and sample quality assessment in metabolomics studies of human blood[J]. Clinical chemistry, 2013,59(5)： 833-845.

[7] Zhang H, KorenkovV, Sj?back R, et al. Biomarkers for Monitoring Pre-Analytical Quality Variation of mRNA in Blood Samples[J]. PloS one, 2014,9(11)： e111644.

[8] Lou J J, Mirsadraei L, Sanchez D E, et al. A review of room temperature storage of biospecimen tissue and nucleic acids for anatomic pathology laboratories and biorepositories[J]. Clinical biochemistry, 2014,47(4)： 267-273.

[9] Condelli V, Lettini G, Patitucci G, et al. Validation of Vacuum-Based Refrigerated System for Biobanking Tissue Preservation： Analysis of Cellular Morphology, Protein Stability, and RNA Quality[J]. Bioprese-rvation and biobanking, 2014,12(1)： 35- 45.

[10] Lee JE, Kim JH, Hong EJ, et al. National biobank of Korea： quality control programs of collected-human biospecimens[J]. Osong Public Health and Research Perspectives, 2012,3(3)： 185-189.

[11] Kofanova OA, Fack F, Niclou S P, et al. Combined effect of tissue stabilization and protein extraction methods on phosphoprotein analysis[J]. Biopr-eservation and biobanking, 2013,11(3)： 161-165.

[12] 桂馨,錢潔,許潔,等.細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中支原體污染的檢測(cè)及預(yù)防[J].同濟(jì)大學(xué)學(xué)報(bào)： 醫(yī)學(xué)版,2013,34(3)： 24-27.

[13] Teunissen CE, Tumani H, Engelborghs S, et al. Biobanking of CSF： International standardization to optimize biomarker development[J]. Clinical bioc-hemistry, 2014,47(4)： 288-292.

Recent progress in quality management system of biobank frozen samples

JICheng-dong，ZHANGJia-ying，YUDe-hua

(Yangpu Hospital， Tongji University School of medicine， Shanghai 200090， China)

Biobank is the fundamental platform for translational research, it also plays a crucial role in disease diagnosis, new drug development, disease-related gene detection and epidemiological studies. Biobank quality management system is the entire process of quality management and control, including standard operation procedure for processing, packaging, storage and use of serum, plasma, blood cells and tissue samples from patients with complete clinical and follow-up data. Quality management is essential for biobank operation and the guarantee for high quality and standardization of medical research. This article reviews the recent progress in establishment of quality management system for biobank frozen samples.

biobank; quality management; frozen samples; summarize

10.16118/j.1008-0392.2015.06.028

2015-02-03

上海市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)科研項(xiàng)目(12692108700)；上海市衛(wèi)生局面上科研項(xiàng)目(090092)

嵇承棟(1976—)，男，碩士.E-mail：15800397667@163.com

于德華.E-mail： ydh1404@sina.com

R 446

A

1008-0392(2015)06-0133-04