低氧誘導(dǎo)因子對軟骨細(xì)胞的作用

胡偉全綜述，張 雷，趙建寧審校

0 引 言

關(guān)節(jié)軟骨缺乏血管，其氧與營養(yǎng)物質(zhì)只能從關(guān)節(jié)滑液及軟骨下骨中獲得。正常情況下，關(guān)節(jié)滑液及軟骨細(xì)胞含氧量較低，在軟骨深層，氧含量可以降低至1%，當(dāng)出現(xiàn)骨關(guān)節(jié)炎等病變時，關(guān)節(jié)滑液中的含氧量將進(jìn)一步降低［1］。由于關(guān)節(jié)軟骨不同程度的暴露于低氧環(huán)境中，氧分壓直接影響關(guān)節(jié)軟骨的代謝及生長發(fā)育。體外培養(yǎng)下，當(dāng)氧分壓發(fā)生改變時，不同層次不同表型的軟骨細(xì)胞特異標(biāo)志物亦發(fā)生改變［2］。低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factors，HIFs)是關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞適應(yīng)低氧環(huán)境的重要細(xì)胞因子，研究HIFs 有助于了解軟骨損傷的發(fā)生機(jī)制及為軟骨損傷修復(fù)提供理論指導(dǎo)。HIFs 包括HIF-1、HIF-2 和HIF-3 等3 種亞型，目前主要研究HIF-1、HIF-2 對于軟骨細(xì)胞的作用?，F(xiàn)就HIFs 對關(guān)節(jié)軟骨的代謝及生長發(fā)育的進(jìn)展作一綜述。

1 HIFs 對軟骨細(xì)胞代謝的作用

Ⅱ型膠原和蛋白多糖是軟骨基質(zhì)的主要組成成分。正常情況下，軟骨基質(zhì)的合成與分解處于動態(tài)平衡中，當(dāng)Ⅱ型膠原蛋白，蛋白聚糖等合成增加時，軟骨缺損將得以修復(fù)，當(dāng)基質(zhì)金屬蛋白酶3(matrix metalloproteinases 3，MMP3)等合成增加時，軟骨分解代謝增強(qiáng)，進(jìn)而損傷軟骨組織。既往研究表明哺乳動物軟骨細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)量稀少，耗氧量主要是通過糖酵解獲取能量，而HIFs 是關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞適應(yīng)低氧環(huán)境的重要細(xì)胞因子，這表明HIFs 可能在軟骨細(xì)胞代謝中發(fā)揮重要作用?，F(xiàn)研究主要針對Ⅱ型膠原蛋白、蛋白聚糖、MMP3 等進(jìn)行檢測，進(jìn)而了解HIFs 對軟骨代謝的作用。

1.1 HIFs 可以促進(jìn)軟骨細(xì)胞合成代謝 體外培養(yǎng)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞時，與20%氧濃度的常氧環(huán)境相比，2%氧濃度環(huán)境中，HIF-1α、HIF-2α 早期明顯升高，Ⅱ型膠原、蛋白聚糖、硫酸化黏多糖合成增加，同時X 型膠原、Ⅰ型膠原、MMP1、MMP2、MMP3、MMP13 合成下降，所以低氧可以通過HIF-1α、HIF-2α 促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成，同時降低退變相關(guān)酶的基因表達(dá)［3］。進(jìn)一步研究表明HIFs 促進(jìn)軟骨細(xì)胞合成代謝是通過直接作用于SOX9 的啟動子，進(jìn)而促進(jìn)Ⅱ型膠原、蛋白聚糖等合成增加，且HIFs 與Ⅱ型膠原、蛋白聚糖等的合成存在劑量正相關(guān)效應(yīng)［4］。

1.2 HIFs 可以抑制軟骨細(xì)胞合成代謝 低氧環(huán)境亦可能抑制軟骨細(xì)胞的合成代謝，從而損傷軟骨。淺表層蛋白和蛋白多糖4 是關(guān)節(jié)軟骨潤滑液的重要組成成分，由關(guān)節(jié)軟骨的表層軟骨細(xì)胞和滑膜細(xì)胞分泌，在減少軟骨與軟骨面的摩擦，保護(hù)軟骨方面起著重要作用，增強(qiáng)關(guān)節(jié)軟骨的潤滑劑分泌可能有益于減緩骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展。將牛關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞分別培養(yǎng)于21%，5%和1%的氧濃度中，顯示5%和1%氧濃度的淺表層蛋白和蛋白多糖4 分泌較21%氧濃度明顯降低，但當(dāng)HIF-1α 基因沉默時，淺表層蛋白和蛋白多糖4 基因表達(dá)在不同氧濃度下無明顯改變，所以低氧可能激活HIF-1α，繼而抑制淺表層蛋白和蛋白多糖4 的產(chǎn)生［5］。

1.3 HIFs 可以促進(jìn)軟骨細(xì)胞分解代謝 關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞不同程度暴露于低氧環(huán)境中，低氧環(huán)境除了影響關(guān)節(jié)軟骨的合成代謝外，同樣可以影響關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的分解代謝。將關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞培養(yǎng)于低氧環(huán)境中，同時對分解代謝相關(guān)介質(zhì)進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)在低氧環(huán)境中，HIF-1α、HIF-2α 和分解代謝相關(guān)介質(zhì)如:白細(xì)胞介素-1β(interleukin 1β，IL-1β)、IL-6、IL-8、腫瘤壞死因子α、MMP-3、MMP-13 及氧自由基表達(dá)均明顯升高［6-7］。當(dāng)將編碼HIF-2α 的腺病毒直接轉(zhuǎn)染關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞或在具有編碼Epas1 的轉(zhuǎn)基因老鼠體內(nèi)，MMP-3、MMP-12 和MMP-13 的表達(dá)亦明顯增加［8-9］。

目前研究表明，HIFs 對關(guān)節(jié)軟骨的綜合代謝作用的影響尚不明確，不同實(shí)驗(yàn)得出的結(jié)論不一致。HIFs 盡管在結(jié)構(gòu)及調(diào)控機(jī)制具有相似之處，但其對病理、生理狀態(tài)下的關(guān)節(jié)軟骨作用不盡相同。HIFs對關(guān)節(jié)軟骨的代謝作用的不確定或許是不同HIFs亞型共同作用的結(jié)果。明確各HIFs 亞型對關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞亞型的作用，有助于選擇性的利用HIFs 促進(jìn)軟骨合成代謝，抑制分解代謝，促進(jìn)軟骨愈合。

2 HIFs 對軟骨修復(fù)的作用

關(guān)節(jié)軟骨位于長骨兩端，它可以分散關(guān)節(jié)面的壓力負(fù)荷、減輕震蕩、降低關(guān)節(jié)面摩擦系數(shù)，但由于其自身修復(fù)能力有限，一旦關(guān)節(jié)軟骨破壞，常造成關(guān)節(jié)軟骨永久性損傷。組織工程用于軟骨修復(fù)是目前的研究熱點(diǎn)［10-11］?？紤]關(guān)節(jié)腔處于一種低氧環(huán)境中，HIFs 有可能對于軟骨的生存及修復(fù)發(fā)揮重要作用。既往研究也表明，在HIF-1α 缺乏的情況下，可見大量軟骨細(xì)胞死亡，而低氧環(huán)境可以促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖及Ⅱ型膠原蛋白合成增加［12-13］。研究HIFs對軟骨修復(fù)的作用并用于組織工程修復(fù)軟骨是當(dāng)前的研究重點(diǎn)。

將人骨髓間充質(zhì)干(bone mesenchylmal stem cells，BMSCs)細(xì)胞培養(yǎng)于低氧或過度表達(dá)HIF-1α的環(huán)境中，Ⅱ型膠原蛋白，蛋白聚糖的基因表達(dá)及蛋白合成均明顯增加，而X 型膠原的合成明顯減少。當(dāng)HIF-1α 功能被阻斷時，X 型膠原的合成明顯增加而Ⅱ型膠原蛋白、蛋白聚糖、SOX9 的基因表達(dá)明顯下降。進(jìn)一步將經(jīng)HIF-1α 誘導(dǎo)的人BMSCs 經(jīng)皮植入無胸腺小鼠體內(nèi)時，可見明顯透明軟骨樣基質(zhì)產(chǎn)生。所以在低氧環(huán)境中，HIF-1α 可能刺激SOX9 表達(dá)，從而促進(jìn)軟骨源性相關(guān)標(biāo)記物合成［14］。低氧除了可以促進(jìn)細(xì)胞基質(zhì)合成外，亦可以通過HIF-1α或HIF-2α 作用于間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchylmal stem cells，MSCs)，促進(jìn)MSCs 增殖并向軟骨分化，同時抑制其成脂、成骨分化能力［15-17］。低氧也可以通過HIFs 作用軟骨細(xì)胞，促進(jìn)軟骨形成或抑制軟骨組織損傷。將正常軟骨細(xì)胞培養(yǎng)于低氧環(huán)境中，發(fā)現(xiàn)在低氧環(huán)境中，HIF-2α 可以直接或間接作用于SOX9，進(jìn)而誘導(dǎo)軟骨組織產(chǎn)生，同時HIF-1α 可以抑制軟骨組織自發(fā)性或誘導(dǎo)性損傷［18-19］。

盡管HIFs 對關(guān)節(jié)軟骨代謝的作用尚不明確，但目前研究傾向于認(rèn)為在低氧環(huán)境中，HIFs 可以促進(jìn)軟骨修復(fù)。

3 HIFs 對軟骨內(nèi)成骨的作用

隨著病程發(fā)展，骨關(guān)節(jié)晚期患者常表現(xiàn)為軟骨硬化、增生、骨贅形成?？紤]關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞屬于低氧感應(yīng)細(xì)胞，HIFs 可能在軟骨內(nèi)成骨中扮演重要作用。

當(dāng)抑制HIF-1α 表達(dá)，軟骨內(nèi)成骨及軟骨細(xì)胞增殖相關(guān)的重要生長因子如骨形態(tài)蛋白2 表達(dá)受到抑制，在缺乏HIF-2α 時，軟骨內(nèi)成骨亦暫時性的延緩。進(jìn)一步研究表明，HIF-2α 很可能通過誘導(dǎo)C/EBPb表達(dá)而發(fā)揮作用［20-22］。血管生成可以為軟骨內(nèi)骨形成提供氧、營養(yǎng)物質(zhì)和成骨細(xì)胞，是軟骨內(nèi)成骨的重要標(biāo)志，而血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是目前公認(rèn)最強(qiáng)的促血管形成因子，檢測關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中HIFs 與VEGF 蛋白表達(dá)，有助于了解HIFs 在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病中的作用。實(shí)驗(yàn)研究證明，在低氧環(huán)境中，HIF-1α 表現(xiàn)為持續(xù)升高，而VEGF 在第12 小時達(dá)到高峰［23］。當(dāng)抑制HIF-1α功能時，VEGF 表達(dá)也受到抑制，因而作者認(rèn)為低氧可能通過HIF-1α 促進(jìn)VEGF 表達(dá)［24］。

成骨細(xì)胞活性在關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)成骨中亦非常重要，HIFs 在實(shí)驗(yàn)中證實(shí)可以促進(jìn)VEGF 表達(dá)，同時也證明其可以抑制成骨細(xì)胞活性。在低氧環(huán)境下，成骨細(xì)胞中Wnt 信號通路拮抗劑硬化蛋白(sclerostin，Sost)表達(dá)升高，當(dāng)加入HIF-1α 激活劑去鐵敏時，Sost 表達(dá)進(jìn)一步增加，而HIF-1α 表達(dá)受到抑制時，成骨細(xì)胞中Sost 表達(dá)下降，這表明HIF-1α 可以通過激活Sost 抑制成骨細(xì)胞活性，從而抑制軟骨內(nèi)成骨［25］。

HIFs 既表現(xiàn)為促進(jìn)VEGF 表達(dá)，繼而促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)成骨;亦表現(xiàn)為抑制成骨細(xì)胞活性，繼而抑制關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)成骨。其在軟骨內(nèi)成骨的不同階段作用不一，在骨關(guān)節(jié)炎不同時期的作用亦可能并不一致。繼續(xù)研究HIFs 在不同低氧濃度、不同時期對關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)成骨的作用，抑制血管形成、成骨細(xì)胞活性，有助于延緩骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)展。

4 HIFs 對軟骨細(xì)胞凋亡的影響

軟骨細(xì)胞凋亡是骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制的重要環(huán)節(jié)之一，減少軟骨細(xì)胞凋亡可能有助于減緩骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展。實(shí)驗(yàn)室研究表明，不同的HIFs 亞型對軟骨細(xì)胞凋亡的影響不一。在低氧環(huán)境中，HIF-1α 可以促進(jìn)熱休克蛋白70 表達(dá)升高，也可以通過避免DNA 損傷，繼而促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成增加和提高細(xì)胞生存能力，保護(hù)細(xì)胞免于凋亡，但當(dāng)HIF-1α 功能受到抑制時，該作用被明顯抑制［26-27］。在骨關(guān)節(jié)炎時，炎癥介質(zhì)如IL-1b 等升高，亦可以促使HIF-1α表達(dá)升高，表達(dá)在骨關(guān)節(jié)時，HIF-1α 對軟骨細(xì)胞具有保護(hù)作用［28］。而當(dāng)軟骨細(xì)胞中HIF-2α 升高時，軟骨細(xì)胞的凋亡明顯增加。但單純HIF-2α 過度表達(dá)或敲出HIF-2α 基因并不會出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡，當(dāng)出現(xiàn)抗Fas 抗體時，HIF-2α 可以明顯促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡。在動物實(shí)驗(yàn)中，關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射負(fù)載Epas-1的慢病毒或在表達(dá)HIF-2α 的轉(zhuǎn)基因小鼠中，可見明顯軟骨細(xì)胞凋亡及軟骨破壞，當(dāng)Epas-1 基因敲除后，軟骨細(xì)胞凋亡及軟骨破壞明顯較少，而且在Fas基因缺失的小鼠關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射負(fù)載Epas-1 的慢病毒，亦無明顯的軟骨細(xì)胞凋亡及軟骨破壞表型，所以HIF-2α 可以加強(qiáng)Fas 介導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡及軟骨破壞［29］。

HIF-1α 在低氧環(huán)境中可以抑制軟骨細(xì)胞凋亡，而HIF-2α 在低氧環(huán)境中卻可以促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡，表明不同HIFs 亞型在低氧環(huán)境中對軟骨細(xì)胞凋亡的作用不一致，進(jìn)一步研究各HIFs 亞型對軟骨細(xì)胞的作用，選擇性的利用HIFs 抑制軟骨細(xì)胞凋亡有助于延緩軟骨退變，延緩骨關(guān)節(jié)的發(fā)生。

5 展 望

由于缺乏血管，軟骨損傷后自行修復(fù)能力有限，尋找有效的軟骨修復(fù)方法是醫(yī)學(xué)界研究的熱點(diǎn)。關(guān)節(jié)軟骨在關(guān)節(jié)腔內(nèi)受多種因素影響，在低氧環(huán)境中，HIFs 對關(guān)節(jié)軟骨的新陳代謝、生長凋亡等均有重要作用。如今隨著對HIFs 研究的進(jìn)展，HIFs 關(guān)節(jié)軟骨的新陳代謝、生長凋亡等的作用也越來越清晰，但HIFs 對軟骨的作用還有待于進(jìn)一步探索:①在不同的氧濃度下，不同層次的軟骨細(xì)胞對氧濃度的反應(yīng)不一，因此應(yīng)探索適當(dāng)?shù)难鯘舛扔糜诖龠M(jìn)不同層次的軟骨修復(fù);②軟骨修復(fù)是受多種因素影響的復(fù)雜過程，應(yīng)進(jìn)一步研究低氧誘導(dǎo)因子與其他生長因子聯(lián)合使用促進(jìn)軟骨修復(fù);③不同低氧誘導(dǎo)因子亞型在低氧環(huán)境中對軟骨細(xì)胞的作用不同，應(yīng)進(jìn)一步探索各亞型在軟骨修復(fù)中的作用;④HIFs 在骨關(guān)節(jié)炎的不同時期作用亦可能不一致，在疾病發(fā)生的各期應(yīng)選擇性的利用HIFs 各亞型用于延緩骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)展;⑤當(dāng)飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生轉(zhuǎn)變時，體內(nèi)HIF-1α 表達(dá)亦發(fā)生轉(zhuǎn)變，或許將來可以通過改變飲食或口服藥物調(diào)控人體內(nèi)HIFs 的表達(dá)，促進(jìn)軟骨修復(fù)，延緩關(guān)節(jié)炎的發(fā)展［30］。展望未來，隨著不同氧濃度、各低氧誘導(dǎo)因子亞型及聯(lián)合使用各種生長因子在軟骨修復(fù)中的作用越來越清晰，這將給組織工程臨床修復(fù)軟骨帶來新的希望。

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