上皮細胞黏附分子與腫瘤診斷及治療的研究進展

張敏娜 楊永平 貌盼勇

上皮細胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)，按白細胞分化抗原命名為CD326，是最早在結(jié)腸癌中發(fā)現(xiàn)的一種跨膜糖蛋白，也是第1 個用單克隆抗體技術(shù)鑒定出來的人腫瘤相關(guān)抗原。Ep-CAM 除了在健康個體的上皮細胞表達，還在大多數(shù)人類腫瘤中不同程度地過表達。并被多項研究證實與腫瘤的診斷和預(yù)后判斷密切相關(guān)。而且，EpCAM的過表達已在EpCAM 抗體及以疫苗為基礎(chǔ)的多種腫瘤的臨床實驗中被開發(fā)和應(yīng)用。本文就EpCAM與腫瘤相關(guān)性的研究進展綜述如下。

一、分子結(jié)構(gòu)

EpCAM 是細胞膜表面的一種跨膜糖蛋白。由位于4q 染色體上的GA733 -2 基因編碼。也有報道認為EpCAM 由位于人染色體2p21 上的TACSTD1(tumor-associated calcium signal transducer protein 1-precursor)編碼。其實，這兩個基因在基因庫中的序列完全一致，為同一個基因編碼。EpCAM 的基因長度為14kbp，成熟的mRNA 為1.5kbp，人和鼠的EpCAM 核苷酸80%同源，氨基酸序列82%同源，說明EpCAM 在進化中高度保守。EpCAM 的相對分子質(zhì)量為40kDa，由314 個氨基酸構(gòu)成。其分子由胞外段結(jié)構(gòu)域(EpEX)、單次跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)段結(jié)構(gòu)域(EpICD)構(gòu)成［1］。EpEX(N 端)由242 個氨基酸構(gòu)成，其所包含的表皮生長因子樣重復(fù)序列和甲狀腺球蛋白結(jié)構(gòu)域是同型分子間黏附的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)?？缒ざ谓Y(jié)構(gòu)域由23 個氨基酸殘基構(gòu)成，C 端的胞內(nèi)段結(jié)構(gòu)域由26 個氨基酸殘基構(gòu)成，具有2 個α -輔肌動蛋白結(jié)合位點，可以與肌動蛋白結(jié)合，從而和細胞骨架相互作用。而且EpICD 對于EpCAM 依賴的由漿膜至胞核的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)也至關(guān)重要，EpICD 通過膜內(nèi)蛋白水解，起到部分轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的作用，誘導(dǎo)c -myc、細胞周期蛋白A 和E 的表達［2］。

二、EpCAM 的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

1.調(diào)節(jié)的膜內(nèi)蛋白水解作用:EpCAM 的寡聚化形式是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的啟動子，使EpCAM 被蛋白酶水解，釋放其細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。2009 年，Munz 等的研究顯示，細胞質(zhì)、核周和核內(nèi)存在點樣EpICD 染色，而在細胞黏附部位的EpCAM 常丟失胞內(nèi)域，說明細胞間的接觸部位存在調(diào)節(jié)的膜內(nèi)蛋白水解(regulated intramembrane proteolysis，RIP)作用誘導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。RIP 包括配基誘導(dǎo)的EpEX 的脫落和EpICD 的釋放。脫落的EpEX 和(或)EpICD 能夠活化信號事件，誘導(dǎo)腫瘤細胞增生，而EpCAM 裂解也可引發(fā)對于自身表達的正反饋循環(huán)。在甲狀腺癌、乳腺癌中，EpICD 核表達被認為與侵襲性的腫瘤類型、生存期縮短等不良預(yù)后有關(guān)［3～5］。另外，最近研究證實，EpCAM 的胞外域還存在另外幾個裂解位點，這提示EpCAM 信號被不同的蛋白水解通路調(diào)節(jié)，可能涉及控制EpCAM 的多種功能［6］。

2.EpCAM 與Wnt-β -catenin 信號通路:Wnt -β- catenin 信號通路為經(jīng)典的腫瘤信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。Yamashita 等［7］研究顯示，EpCAM 為Wnt -β -catenin 通路的直接轉(zhuǎn)錄靶點，通過RNA 干擾沉默Ep-CAM 表達或抑制β-catenin，可導(dǎo)致EpCAM 表達陽性的肝癌細胞死亡。而激活Wnt -β -catenin 信號通路則會使EpCAM 陽性的肝癌細胞數(shù)量增加。

3.EpCAM 與PI3K 通路:2007 年，Litvinov 等通過對乳腺上皮細胞HBL100 的研究顯示，3 -磷脂酰肌醇激酶(phosphatidylinositol 3 -kinase，PI3K)可調(diào)節(jié)P85 亞基在EpCAM 與N - 鈣黏素間的穿梭。Ep-CAM/p85 復(fù)合體具備激酶活性，而PI3K 的激活可促使細胞進入DNA 合成期，使細胞發(fā)生癌前轉(zhuǎn)化的特征性改變，PI3K 活化也是誘導(dǎo)細胞增生和細胞間黏附所必需的。以上結(jié)果表明，EpCAM 可能通過PI3K通路發(fā)揮對細胞增生的部分調(diào)節(jié)作用［8］。

三、EpCAM 表達譜

EpCAM 在生理條件下廣泛表達于上皮源性的正常組織(包括胃囊、結(jié)腸、胰腺、膀胱、前列腺、乳腺、卵巢、皮膚汗腺等)的基底外側(cè)膜。而神經(jīng)內(nèi)分泌組織、間葉組織及部分上皮來源的腺上皮(如肝細胞、胃壁細胞、上皮角化細胞、肌上皮)則不表達EpCAM。在病理情況下，EpCAM 在部分發(fā)生癌前病變的上皮組織表達轉(zhuǎn)為陽性(如不典型增生的口腔黏膜、食管化生上皮、急慢性活動性肝炎、子宮頸不典型增生)或表達明顯增強(如結(jié)腸腺瘤)［1］。EpCAM 在頭頸部腫瘤、乳腺癌、胃癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、肺鱗狀細胞癌及皮膚基底細胞癌等上皮源性腫瘤中高水平表達，而在間質(zhì)或外胚層來源的腫瘤(肉瘤、黑素瘤、淋巴瘤)不表達［1］。

四、生物學(xué)功能

1.調(diào)節(jié)細胞間黏附及遷移、調(diào)控細胞形態(tài):Ep-CAM 主要介導(dǎo)非鈣離子依賴性的同源細胞之間的黏附，這種黏附作用較E -鈣黏蛋白(E -cadherin)松散。在生理條件下，EpCAM 通過重排細胞肌動蛋白骨架來實現(xiàn)對細胞運動的調(diào)節(jié)，可能有促進細胞遷移的作用。另外，EpCAM 還通過對細胞形態(tài)的調(diào)控參與上皮組織的發(fā)生、發(fā)展及腫瘤的成瘤及進展。

2.調(diào)節(jié)細胞周期和細胞增生:EpCAM 對細胞周期和細胞增生均有影響［9］。當(dāng)把EpCAM 的全長cDNA 轉(zhuǎn)染到EpCAM 陰性的HEK293 細胞后，HEK293細胞表達EpCAM，細胞周期調(diào)節(jié)基因cyclin A/E 及其蛋白、c-myc 基因快速上調(diào)表達而促進細胞的代謝及增生。EpCAM 也通過Wnt 信號通路參與細胞增生過程［10］。而且，EpICD 的蛋白水解裂縫(proteolytic cleavage)被證實提供有絲分裂信號。另外，EpCAM還可通過在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)細胞周期蛋白D1(cyclin D1)表達并通過與FHL2(four and half LIM domains-2)作用的能力來直接影響細胞周期［11］。

3.參與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展:EpCAM 過表達可能激活與腫瘤發(fā)生有關(guān)的Wnt 信號途徑。另外，Ep-CAM 通過促進Th2 分化阻斷樹突狀細胞的MHCⅡ限制性抗原遞呈，產(chǎn)生的CD4+T 細胞部分功能缺陷，使腫瘤細胞逃逸CD4+T 細胞依賴性的免疫反應(yīng)而促成腫瘤進展［12，13］。在宮頸鱗狀上皮及前列腺中，EpCAM 的表達從正常上皮、經(jīng)由上皮內(nèi)瘤形成到癌形成均顯著增加。在胃癌、乳腺癌、肝癌、舌鱗狀細胞癌中，過表達EpCAM 的腫瘤細胞具有增生活性高及侵襲性強的特點，通過RNA 干擾下調(diào)EpCAM 表達能夠降低細胞的增生、遷移和侵襲能力［14，15］。這些結(jié)果進一步證實了EpCAM 促進腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲方面的作用。但是，有些研究卻顯示EpCAM 的表達在某些情況下對抗腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。鼠結(jié)直腸癌細胞轉(zhuǎn)染EpCAM cDNA 后，增加了細胞間黏附，減弱了腫瘤細胞在基質(zhì)膠的侵襲，當(dāng)預(yù)先注入鼠的脾臟時減少了腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移［16］。此外，EpCAM 在不同腫瘤的預(yù)后判斷中起到不同的提示作用。在膀胱癌、膽囊癌、胰腺癌、低分化乳腺癌、肺鱗癌中，EpCAM 高表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期晚和低分化等不良預(yù)后因素有關(guān)［17］。而在口腔鱗癌、食管癌、低分化甲狀腺癌、腎透明細胞癌中，EpCAM 則是腫瘤預(yù)后良好的標(biāo)志，與患者生存期延長相關(guān)［18］。EpCAM 擔(dān)當(dāng)抑癌基因或致癌基因的角色可能取決于微環(huán)境。由于外在的調(diào)節(jié)與EpCAM 的異常表達有關(guān)，根據(jù)腫瘤類型上調(diào)或下調(diào)EpCAM 的表達，可能成為新的、有潛力的腫瘤治療方法。

五、EpCAM 與腫瘤的診斷

1.EpCAM 為腫瘤干細胞標(biāo)記:EpCAM 于2008年被鑒定為人胚胎干細胞標(biāo)記。其后多項研究證實了EpCAM 為鼠及人胚胎干細胞的多能性及增生性的標(biāo)記。近年來，直結(jié)腸癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌等的研究結(jié)果均證實EpCAM 可作為腫瘤干細胞的標(biāo)志［19］。在肝癌的研究中，EpCAM+的肝癌細胞也同時表達其他肝干細胞標(biāo)記，具備自我更新和分化能力及較高的侵襲性，能夠在NOD/SCID 小鼠(非肥胖糖尿病聯(lián)合免疫缺陷小鼠)中有效誘生高侵襲性的肝癌。2008 年Yamashita 等［20］依據(jù)EpCAM 及AFP 的表達情況將肝細胞癌分為具有預(yù)后提示信息的4 型，即膽管上皮樣肝癌(EpCAM+AFP-)、肝干細胞樣肝癌(EpCAM+AFP+)、肝祖細胞樣肝癌(EpCAMAFP+)、成熟肝細胞樣肝癌(EpCAM-AFP-)。其中，肝干細胞樣肝癌具備肝癌干細胞樣特性，患者年齡小，TNM 分期晚，伴門脈受侵，預(yù)后差。

2.EpCAM 陽性的循環(huán)腫瘤細胞檢測技術(shù):Ep-CAM+的循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cells，CTC)擁有干細胞特性，能夠在原發(fā)組織重新種植或轉(zhuǎn)移至遠處臟器，與總的CTC 相比能夠提供更多的臨床預(yù)后信息［21］。目前EpCAM+的CTC 的檢測技術(shù)包括以整個細胞為基礎(chǔ)的技術(shù)方法(免疫組織化學(xué)、免疫磁性分離、流式細胞術(shù)等)和以核酸為基礎(chǔ)的技術(shù)方法。其中基于免疫磁性分離原理發(fā)展起來的Cell Search 系統(tǒng)，只需應(yīng)用7.5ml 血液樣本即可從400 多億的血細胞中檢測到1 個CTC，敏感度較高。已被美國FDA 批準應(yīng)用于臨床，目前主要應(yīng)用于預(yù)測轉(zhuǎn)移性乳腺癌、結(jié)直腸癌或前列腺癌的無病生存期和總生存期。臨床應(yīng)用結(jié)果表明，通過Cell Search 系統(tǒng)檢測CTC 可判斷療效及評估患者預(yù)后，并具備無創(chuàng)、簡便、易行的特點，可對同一患者進行連續(xù)監(jiān)測。2012年，Sun 等［22］首次應(yīng)用Cell Search 系統(tǒng)對肝癌患者CTC 進行檢測，結(jié)果顯示CTC 在HCC 患者中檢出率為66.67%。術(shù)前CTC7.5≥2 為腫瘤復(fù)發(fā)的獨立預(yù)后因素。EpCAM 陽性CTC 作為肝細胞癌的不良預(yù)后因素也被Schulze 等［23］的研究證實。之后在此基礎(chǔ)上發(fā)展起來的微流體芯片分離技術(shù)較Cell Search系統(tǒng)更敏感。Cell Search 系統(tǒng)和微流體芯片技術(shù)因其檢驗對象是血液標(biāo)本，無需通過有創(chuàng)手段取得實體腫瘤組織就可進行組織病理學(xué)檢查，故又被稱為“液體活檢”(liquid biopsy)，有望在臨床上普及使用［24］。以核酸為基礎(chǔ)的技術(shù)方法主要通過多聚酶鏈反應(yīng)法(PCR)在外周血標(biāo)本中檢測癌細胞EpCAM 的mRNA來間接提示EpCAM+CTC 的存在。該研究方法檢測的敏感度較高，但特異性略差。且不能進行細胞形態(tài)學(xué)及功能等方面的研究［25］。

六、EpCAM 抗體的治療應(yīng)用

目前，已開發(fā)的EpCAM 抗體主要應(yīng)用于上皮源性腫瘤治療的探索。

1.單克隆抗體:包括鼠源性IgG2a 抗體(edrecolomab)、1 個鼠嵌合IgG1 抗體和全人源IgG1 抗體(3622W94，ING -1，adecatumumab - MT201)。其中edrecolomab(ED)是第1 個用于治療人類胃腸道腫瘤的單克隆抗體，并顯示出延長整體生存期的臨床療效，已在德國上市。但隨著臨床治療的應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)ED對實體瘤的治療效果有限，而對術(shù)后輔助治療有一定的幫助。其安全性良好，但存在半衰期短、鼠抗人單克隆抗體快速中和反應(yīng)和臨床作用不明確等缺陷。adecatumumab(MT201)介導(dǎo)補體依賴和抗體依賴的細胞毒性反應(yīng)。與ED 相比，此抗體具有不良反應(yīng)較小、體外試驗顯示更強的抗體依賴性細胞毒性反應(yīng)的特點。在轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的Ⅱ期臨床試驗中，MT201 顯示出劑量及靶點依賴性的臨床效應(yīng)，并且使新的轉(zhuǎn)移灶發(fā)生減少。EpCAM 表達陽性的卵巢癌細胞株對MT201 介導(dǎo)的ADCC(抗體依賴細胞介導(dǎo)的細胞毒性作用)高度敏感，白細胞介素-2 能增強MT201 對EpCAM+卵巢癌的細胞毒性作用。

2.雙特異性三功能抗體:catumaxomab 能夠同時特異性識別并結(jié)合EpCAM 陽性腫瘤細胞及CD3+T細胞，并通過其Fc 段形成ADCC 效應(yīng)細胞、腫瘤細胞、T 細胞復(fù)合體，觸發(fā)誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的多種免疫機制。2009 年4 月，catumaxomab 被歐盟委員會批準應(yīng)用于EpCAM 表達陽性腫瘤患者的惡性腹腔積液的治療，顯示出僅次于上皮癌的臨床獲益。Strohlein 等應(yīng)用catumaxomab 治療消化道源性的腹腔腫瘤，隨訪2 年結(jié)果顯示，65%患者無進展生存，1例完全緩解，3 例部分緩解，取得了延緩疾病進展、延長生存時間的療效。卵巢癌及胃癌并惡性腹腔積液的臨床Ⅲ期實驗顯示其有效減少腹腔積液產(chǎn)生、延長整體存活時間的確切的臨床效果。近期，Jagern 等分析治療后的腹腔液體樣本結(jié)果顯示，治療組腫瘤細胞數(shù)目和VEGF 水平均降低，激活CD4+和CD8+T 細胞群數(shù)量增高2 倍，值得關(guān)注的是，治療組樣本中CD133+和EpCAM+腫瘤干細胞消失。

3.EpCAM 的其他治療應(yīng)用:在肝癌的靶向治療方面，Ogawa 等新近的研究顯示，以EpCAM 為靶點的抗毒素VB4 -845 與5 -FU 聯(lián)用在肝癌細胞系中顯示出強效的細胞毒性，而且VB4 -845 顯著抑制肝癌細胞的克隆形成能力及肝干細胞標(biāo)記(CD133、CD13)的表達。體內(nèi)試驗顯示，5 -FU 與VB4 -845聯(lián)用顯著縮小肝原位移植物模型的腫瘤體積。說明EpCAM 靶向治療有望成為預(yù)后較差的肝細胞癌的新的治療方式。

4.治療策略中的相關(guān)問題:以EpCAM 為基礎(chǔ)的腫瘤治療策略是否影響正常上皮組織和干細胞?正常上皮組織和干細胞與腫瘤細胞EpCAM 表達水平及表達形式的差異又是否允許抗EpCAM 靶向治療?基于EpCAM 的靶向治療之所以可行，考慮與以下因素有關(guān)。(1)抗體親和力:edrecolomab 和adecatumumab 及中等親和力的人源型抗體MT201 的治療耐受性良好。而親和力最高的抗體，如3622W94 和ING-1 即使在低濃度(1mg/kg 體重)下也誘發(fā)急性胰腺炎。說明適宜的抗體親和力為靶向治療可行的因素之一。(2)EpCAM 的表達部位:EpCAM 低水平表達于大多數(shù)正常的人上皮組織的基底外側(cè)膜，但在癌細胞則高水平地表達于膜頂部，更容易被抗體接近。這種亞細胞水平的分布差異使EpCAM 成為非常合適的腫瘤治療靶點。(3)正常組織與腫瘤組織EpCAM 表達形式的差異:如糖基化、甲基化、共表達蛋白等。在正常組織，EpCAM 與CD9、CD44 和Claudin -7 同在一個復(fù)合體內(nèi)，并位于基外膜。這樣，EpCAM 結(jié)合抗體的親和力在正常細胞就比腫瘤細胞低。而且，在治療性抗體的生產(chǎn)過程中能夠發(fā)生與細胞毒性有關(guān)的糖類物質(zhì)成分的變化，可以解釋抗Ep-CAM 抗體治療的安全范圍內(nèi)的不良反應(yīng)。但治療性抗EpCAM 抗體仍存在較多的不良反應(yīng)，甚至誘發(fā)胰腺炎等嚴重并發(fā)癥。因此，目前臨床上保守地局部應(yīng)用抗EpCAM 抗體治療，不失為最大限度地限制系統(tǒng)性不良反應(yīng)的方法之一。

雖然EpCAM 分子相關(guān)的腫瘤免疫治療發(fā)展很快，但臨床應(yīng)用仍很局限。如何將EpCAM 與腫瘤的分子靶向治療結(jié)合，并最大限度降低藥物不良反應(yīng)使其臨床可行，有待于今后進一步研究和探討。

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