重金屬脅迫對(duì)Pseudomonasalcaligenes LH7抗生素抗性的影響

溫麗華, 許燕濱, 周 艷, 阮晶晶, 侯毛宇, 孫 浩, 屈毛毛, 袁保紅, 鄭 莉

1 廣東工業(yè)大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院, 廣州 510006 2 廣東藥學(xué)院基礎(chǔ)部, 廣州 510006

重金屬脅迫對(duì)PseudomonasalcaligenesLH7抗生素抗性的影響

溫麗華1, 許燕濱1,*, 周 艷1, 阮晶晶1, 侯毛宇1, 孫 浩1, 屈毛毛1, 袁保紅2, 鄭 莉1

1 廣東工業(yè)大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院, 廣州 510006 2 廣東藥學(xué)院基礎(chǔ)部, 廣州 510006

從廣州某養(yǎng)豬場(chǎng)廢水處理系統(tǒng)中篩選出1株優(yōu)勢(shì)菌PseudomonasalcaligenesLH7。為了研究重金屬脅迫對(duì)細(xì)菌抗生素抗性響應(yīng)的影響，采用瓊脂稀釋法和K-B紙片擴(kuò)散法，測(cè)定了重金屬(Cu2+、Zn2+、Cr6+)的最小抑制濃度(MIC)，及不同重金屬種類和濃度脅迫下，四種抗生素(紅霉素、阿莫西林、頭孢拉定、四環(huán)素)的抑菌圈直徑。結(jié)果表明：菌體對(duì)Cu2+、Zn2+、Cr6+的MIC分別為125、125、100 mg/L，并且具有四環(huán)素、阿莫西林、紅霉素和頭孢拉定多重抗性。重金屬與抗生素之間的交互作用對(duì)細(xì)菌的抗性有顯著影響(P<0.05)。重金屬和抗生素間的交互作用隨重金屬種類和濃度的不同而改變，可分為三類：低濃度重金屬與抗生素共存時(shí)表現(xiàn)為協(xié)同抗性，高濃度時(shí)則表現(xiàn)為協(xié)同殺菌，如Cr6+或Zn2+與紅霉素，Cu2+與頭孢拉定；低濃度重金屬與抗生素共存時(shí)表現(xiàn)為協(xié)同殺菌，高濃度時(shí)則表現(xiàn)為協(xié)同抗性，如Cr6+或Zn2+與阿莫西林；只與共存重金屬種類相關(guān)的抗性組合有Cu2+與四環(huán)素或阿莫西林或紅霉素，Cr6+與頭孢拉定。環(huán)境中重金屬離子的共存將改變抗生素污染物的生態(tài)危害和環(huán)境行為，并最終影響對(duì)應(yīng)的污染防治技術(shù)的開發(fā)和應(yīng)用。

養(yǎng)豬場(chǎng)廢水;PseudomonasalcaligenesLH7; 重金屬脅迫; 抗生素; 協(xié)同抗性; 協(xié)同殺菌

在我國(guó)每年用作飼料添加劑的抗生素已超過(guò)8000t[1]，養(yǎng)殖業(yè)通常利用抗生素提高飼料利用率、牲畜的增重率以及預(yù)防和治療牲畜疾病[2]，因?yàn)檫^(guò)量添加，大部分抗生素不能被動(dòng)物吸收，最終以母藥的形式隨糞便和尿液排出[3]?？股氐臑E用、過(guò)量使用，甚至人藥獸用，使得抗生素的環(huán)境危害和生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)越來(lái)越大。研究者已從浙江、廣西、杭州、北京、濟(jì)南等多個(gè)省市的養(yǎng)殖場(chǎng)畜禽糞便中檢測(cè)出抗生素[4- 7]。此外，市政污水、河流水、湖泊水、沉積物和土壤，甚至地下水中均檢測(cè)出抗生素殘留[8- 9]。抗生素抗性基因作為抗生素污染的次生污染物，已在包括河流、污水廠排水等多個(gè)水體中檢測(cè)出來(lái)[10- 11]，由于其可能通過(guò)水平遷移等途徑實(shí)現(xiàn)生物間傳遞，而人們對(duì)其具體的環(huán)境行為仍有非常多未知的領(lǐng)域，也吸引了越來(lái)越多學(xué)者的關(guān)注。目前主要的研究集中在抗生素對(duì)環(huán)境受體的影響[12]及抗生素在水環(huán)境、土壤環(huán)境以及污染治理設(shè)施中的降解情況研究等[13- 16]。

重金屬污染由于來(lái)源廣泛，且具有生物累積性、長(zhǎng)期性和不可逆性，一直以來(lái)備受關(guān)注。作為兩種備受關(guān)注的污染物，重金屬和抗生素復(fù)合污染的現(xiàn)象也越來(lái)越普遍，如畜禽養(yǎng)殖的固廢和廢水、施用糞肥的土壤環(huán)境等[4,17]。目前，有關(guān)重金屬和抗生素復(fù)合污染的研究主要集中在重金屬和抗生素在環(huán)境中的分布、含量上的分析及對(duì)污水處理的影響[17- 18]，而重金屬對(duì)抗生素抗性的影響未做系統(tǒng)性研究，隨著人們從環(huán)境中篩選出越來(lái)越多同時(shí)具有重金屬抗性和抗生素抗性的菌種，如從魚、蝦體內(nèi)及沉積物中分離的氣單胞菌屬(Aeromonasspp.)等[19- 20]，及從南極海水中分離的莫拉氏菌屬(Moraxella)、產(chǎn)堿桿菌(Alcaligens)和假單胞菌(Pseudomonas)等嗜冷菌[21]，重金屬和抗生素抗性間的相關(guān)性也引起了學(xué)者的關(guān)注，研究發(fā)現(xiàn)重金屬和抗生素的聯(lián)合毒性表現(xiàn)為拮抗作用和相加作用[18]。

養(yǎng)殖廢水作為一種典型的重金屬和抗生素復(fù)合污染環(huán)境，其抗生素濃度范圍多為μg/L級(jí)，有些可達(dá)到1—6mg/L，而重金屬以Cu2+、Zn2+最高，在豬糞中可達(dá)幾百mg/kg[4,22- 23]，為了準(zhǔn)確了解重金屬脅迫對(duì)菌體抗生素抗性的響應(yīng)特點(diǎn)，本試驗(yàn)從中篩選獲得1株優(yōu)勢(shì)菌PseudomonasalcaligenesLH7，研究3種典型重金屬(Cu2+、Zn2+、Cr6+)在不同濃度下對(duì)菌株抗生素(紅霉素、阿莫西林、頭孢拉定、四環(huán)素)抗性的影響，從而為微生物法治理重金屬和抗生素復(fù)合污染提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

本實(shí)驗(yàn)菌株從廣州某養(yǎng)豬場(chǎng)廢水處理系統(tǒng)中分離獲得，為1株革蘭氏陰性桿菌，細(xì)桿狀，無(wú)芽孢，能運(yùn)動(dòng)，菌落呈圓形，無(wú)色，光滑不透明，色氨酸脫氫酶、V-P測(cè)定、硝酸鹽還原、接觸酶、氧化酶反應(yīng)呈陽(yáng)性，不能利用葡萄糖、蔗糖、果糖，經(jīng)鑒定為產(chǎn)堿假單胞菌(PseudomonasalcaligenesLH7)。對(duì)照菌株為大腸桿菌K- 12，質(zhì)控菌株為大腸桿菌ATCC 25922、銅綠假單胞菌ATCC 27853和大腸桿菌ATCC 35218。

1.1.2 培養(yǎng)基

(1)菌種的活化和培養(yǎng)、菌懸液的制備、抗生素敏感實(shí)驗(yàn)分別采用牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基、MH瓊脂培養(yǎng)基。

(2)試驗(yàn)培養(yǎng)基：分別稱取定量的分析純CuSO4·5H2O、ZnSO4和K2Cr2O7，以無(wú)菌去離子水定容,再用0.22 μm膜過(guò)濾，配制成濃度為1×104mg/L的重金屬標(biāo)準(zhǔn)溶液，作為儲(chǔ)備液，用于調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中重金屬濃度。將滅菌(121 ℃，1.0 MPa)后的MH瓊脂培養(yǎng)基冷卻至50 ℃左右，加入不同量的重金屬儲(chǔ)備液，調(diào)節(jié)重金屬濃度。搖勻后，倒入培養(yǎng)皿待凝固，用于菌體的重金屬M(fèi)IC測(cè)定及重金屬對(duì)菌株抗生素抗性影響研究。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌懸液制備

挑取冰箱中甘油保存的菌種，接種于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，在生化培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h活化，從平板上挑取單菌落接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液中，于37 ℃恒溫振蕩器培養(yǎng)16—18 h獲得種子培養(yǎng)液；按照5%的接種量，接種到新鮮培養(yǎng)液中，繼續(xù)37 ℃恒溫振蕩器培養(yǎng)16—18 h，獲得濃度為108CFU/mL的菌懸液，用于重金屬最小抑制濃度MIC測(cè)定及抗生素抗性研究。

1.2.2 重金屬最小抑制濃度(MIC)確定

采用瓊脂稀釋法，用涂布棒將100 μL菌懸液涂布到含重金屬溶液的試驗(yàn)培養(yǎng)基上，Cu2+、Zn2+、Cr6+的濃度變化范圍為0—200 mg/L,置于生化培養(yǎng)箱恒溫37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌的生長(zhǎng)情況。以大腸桿菌K- 12為對(duì)照菌株，MIC的終點(diǎn)判斷標(biāo)準(zhǔn)為抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低濃度。

1.2.3 抗生素抗性實(shí)驗(yàn)

采用K-B紙片擴(kuò)散法做抗生素耐藥試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)規(guī)程按美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行操作。由于該菌株為革蘭氏陰性菌，本實(shí)驗(yàn)選用四種常見并針對(duì)革蘭氏陰性菌的抗生素，分別為紅霉素(15 μg/片)、阿莫西林(20 μg/片)、頭孢拉定(30 μg/片)、四環(huán)素(30 μg/片)，藥敏紙片購(gòu)于杭州天和微生物試劑有限公司，直徑為6 mm，于-20 ℃保存。以大腸桿菌ATCC 25922，銅綠假單胞菌ATCC 27853, 大腸桿菌ATCC 35218為質(zhì)控菌株。

1.2.4 重金屬對(duì)抗生素抗性影響實(shí)驗(yàn)

本試驗(yàn)設(shè)計(jì)抗生素濃度一定時(shí)，即紅霉素(15 μg/片)、阿莫西林(20 μg/片)、頭孢拉定(30 μg/片)、四環(huán)素(30 μg/片)，不同濃度的重金屬對(duì)菌株的抗生素抗性的影響。移取100 μL菌懸液滴加至含重金屬的試驗(yàn)培養(yǎng)基上，涂布均勻。15 min后，用小鑷子夾取藥敏紙片貼在涂好菌液的培養(yǎng)基上，每個(gè)平板上貼3片，每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行樣，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16—18 h，測(cè)量抑菌圈直徑。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 17.0軟件，以抗生素種類、重金屬種類和重金屬濃度為固定因子，抑菌圈直徑為因變量，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單變量多因素方差分析，顯著性水平為0.05。抑菌圈直徑變化率k=(b-a)/a(a為未添加重金屬時(shí)抑菌圈直徑，b為添加重金屬后抑菌圈直徑)。采用Origin 8.1軟件繪制不同濃度Cu2+、Zn2+、Cr6+對(duì)四種抗生素抗性影響的柱形圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 重金屬最小抑制濃度確定

本研究采用最小二分法確定Cu2+、Zn2+、Cr6+的最小抑制濃度分別為125、125、100 mg/L。根據(jù)重金屬的MIC值，重金屬和抗生素交叉抗性試驗(yàn)中選取重金屬Cu2+和Zn2+的濃度梯度為0、0.1、2、10、50、100 mg/L，Cr6+的濃度梯度為0、0.1、2、20、50、80 mg/L。

2.2 藥敏結(jié)果

根據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)中藥敏試驗(yàn)紙片法的抑菌范圍解釋標(biāo)準(zhǔn)，以R(耐藥)、I(中介)、S(敏感)表示，該菌株對(duì)紅霉素、阿莫西林、頭孢拉定和四環(huán)素4種抗生素的敏感程度見表1，發(fā)現(xiàn)該菌株對(duì)阿莫西林和四環(huán)素有抗性，而對(duì)頭孢拉定敏感。

表1 Pseudomonas alcaligenes LH7的抗生素敏感性Table 1 Susceptibility of Pseudomonas alcaligenes LH7 to antibiotics

2.3 重金屬對(duì)菌體抗生素抗性的影響

2.3.1 重金屬種類和濃度與抗生素抗性的相關(guān)性分析

方差分析發(fā)現(xiàn)重金屬種類和濃度對(duì)抑菌圈直徑影響顯著(F種類=18.370，P種類<0.05；F濃度=47.335，P濃度<0.05)。另外，抗生素種類×重金屬種類、抗生素種類×重金屬濃度、重金屬種類×重金屬濃度之間的二維交互效應(yīng)對(duì)抑菌圈直徑也有極為顯著的影響(P<0.05)，甚至抗生素種類×重金屬種類×重金屬濃度之間的三維交互效應(yīng)對(duì)抑菌圈直徑也有極為顯著的影響(F=32.605，P<0.05)(表2)。這表明對(duì)于菌株的抗性影響因素，除抗生素種類、重金屬種類和重金屬濃度主因子外，抗生素種類×重金屬種類、抗生素種類×重金屬濃度、重金屬種類×重金屬濃度之間的二維交互效應(yīng)以及抗生素種類×重金屬種類×重金屬濃度之間的三維交互效應(yīng)也不可忽略，重金屬和抗生素存在交互作用，即重金屬脅迫對(duì)細(xì)菌抗生素抗性響應(yīng)有影響。

表2 主效應(yīng)方差分析Table 2 Tests of Between-Subjects effects

2.3.2 重金屬濃度對(duì)抗生素抗性的影響

由圖1—圖3可知，重金屬的加入對(duì)細(xì)菌的抗生素抗性有不同程度的影響。從抑菌圈直徑相對(duì)變化率來(lái)看，重金屬的加入對(duì)菌體四環(huán)素抗性的影響最為明顯，而對(duì)頭孢拉定的影響最不明顯。隨著共存Cu2+濃度升高，四環(huán)素抑菌圈直徑與空白相比，變化率也不斷增大，分別為115.32%(0.1 mg/L Cu2+)，161.56%(2 mg/L Cu2+)，162.14%(10 mg/L Cu2+)，171.97%(50 mg/L Cu2+)，174.28%(100 mg/L Cu2+)，而頭孢拉定抑菌圈直徑變化率范圍在 -16.80% — +11.26%；Zn2+共存時(shí)，菌體四環(huán)素抑菌圈直徑變化率分別為170.81%(0.1 mg/L Zn2+)，-100.00%(2 mg/L Zn2+)，-100.00%(10 mg/L Zn2+)，134.54%(50 mg/L Zn2+)，140.03%(100 mg/L Zn2+)，而頭孢拉定抑菌圈直徑變化率范圍很小，在 -9.12% — 34.65%之間； Cr6+共存使得菌體四環(huán)素抑菌圈直徑的變化率分別為 -100.00%(0.1 mg/L Cr6+)，7.80%(2 mg/L Cr6+)，-100.00%(20 mg/L Cr6+)，-100.00%(50 mg/L Cr6+)，-100.00%(80 mg/L Cr6+)，而頭孢拉定抑菌圈直徑的變化率明顯隨著Cr6+濃度的升高而逐漸增大，分別為1.26%(0.1 mg/L Cr6+)，15.65%(2 mg/L Cr6+)，22.30%(20 mg/L Cr6+)，40.91%(50 mg/L Cr6+)，53.32%(80 mg/L Cr6+)。

圖1 Cu2+對(duì)抗生素抗性的影響

圖2 Zn2+對(duì)抗生素抗性的影響

圖3 Cr6+對(duì)抗生素抗性的影響

重金屬對(duì)細(xì)菌抗生素抗性的影響主要表現(xiàn)為促進(jìn)作用和抑制作用，即重金屬和抗生素間的交互作用表現(xiàn)為協(xié)同抗性和協(xié)同殺菌，且隨重金屬種類和濃度的不同而改變，可將交叉抗性組合分為3種類型。第1種，低濃度的重金屬離子與抗生素共存表現(xiàn)為協(xié)同抗性，而高濃度重金屬離子與抗生素共存表現(xiàn)為協(xié)同殺菌，如Cr6+或Zn2+與紅霉素，Cu2+與頭孢拉定。低濃度的Cr6+或Zn2+與紅霉素共存時(shí)，測(cè)得的抑菌圈直徑均小于空白組的抑菌圈直徑15.41mm，即低濃度的Cr6+和Zn2+使得菌株紅霉素抗性增強(qiáng)，Cr6+或Zn2+與紅霉素之間表現(xiàn)為協(xié)同抗性；而高濃度的Cr6+或Zn2+與紅霉素共存時(shí)，菌株紅霉素抗性減弱，此時(shí)Cr6+或Zn2+與紅霉素之間表現(xiàn)為協(xié)同殺菌。第2種，與第1種類型相反，即高濃度的重金屬離子與抗生素共存表現(xiàn)為協(xié)同抗性，而低濃度重金屬離子與抗生素共存表現(xiàn)為協(xié)同殺菌，如Cr6+或Zn2+與阿莫西林。低濃度的Cr6+或Zn2+與阿莫西林共存時(shí)，測(cè)得抑菌圈直徑均大于空白組的抑菌圈直徑7.95 mm，即低濃度Cr6+或Zn2+使得PseudomonasalcaligenesLH7對(duì)阿莫西林的抗性減弱，Cr6+或Zn2+與阿莫西林之間表現(xiàn)為協(xié)同殺菌；而高濃度的Cr6+或Zn2+與阿莫西林共存時(shí)，菌株對(duì)阿莫西林的抗性增強(qiáng)，此時(shí)Cr6+或Zn2+與阿莫西林之間表現(xiàn)為協(xié)同抗性。這兩類抗性組合都存在重金屬折點(diǎn)濃度，且因抗性組合而異。如與阿莫西林共存時(shí)，Cu2+、Cr6+的折點(diǎn)濃度50 mg/L，而Zn2+的折點(diǎn)濃度為10mg/L。第3種，菌體的抗生素抗性變化只與重金屬種類相關(guān)，如Cu2+的共存導(dǎo)致菌體的四環(huán)素抗性減弱，敏感性從R變成S，類似的還有Cu2+與阿莫西林及Cr6+與頭孢拉定，而Cu2+的共存導(dǎo)致菌體的紅霉素抗性明顯增強(qiáng)，敏感性從I變成R(表3)。

表3 重金屬共存對(duì)抗生素敏感性的影響Table 3 Effect of heavy metals on susceptibility of Pseudomonas alcaligenes LH7

3 討論

從養(yǎng)殖廢水中篩選出的菌株P(guān)seudomonasalcaligenesLH7具有重金屬(Cu2+、Zn2+、Cr6+)抗性和抗生素(紅霉素、阿莫西林、頭孢拉定、四環(huán)素)抗性，菌體的重金屬抗性強(qiáng)弱順序?yàn)镃u2+= Zn2+> Cr6+。Matyar等[23]也從海水及沉積物中分離得到具有重金屬和抗生素抗性的假單胞菌，發(fā)現(xiàn)菌體的重金屬抗性強(qiáng)弱順序?yàn)镃u > Cd > Mn > Zn > Cr > Pb，且同時(shí)對(duì)多種抗生素表現(xiàn)出抗性[24]。對(duì)于菌體同時(shí)具有重金屬和抗生素抗性的原因，可能是與許多抗生素和重金屬抗性基因位于相同的移動(dòng)遺傳元件(MGEs)，如質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子和整合子有關(guān)[2]。

重金屬種類和濃度對(duì)菌株的抗生素抗性有很大影響(P<0.05)。重金屬和抗生素的交互作用主要表現(xiàn)在協(xié)同抗性和協(xié)同殺菌。具有協(xié)同抗性的抗性組合有Cu2+與紅霉素，低濃度的Cr6+、Zn2+與紅霉素及高濃度的Cr6+、Zn2+與阿莫西林。孫建平等[18]研究了抗生素和重金屬聯(lián)合毒性作用下對(duì)發(fā)光細(xì)菌的影響，發(fā)現(xiàn)金霉素與Cu(Ⅱ)存在拮抗作用，金霉素的抑制作用隨Cu(Ⅱ)濃度的增加而減小。協(xié)同抗性是指重金屬抗性基因和抗生素抗性基因定位于同一個(gè)遺傳元件上，如質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子或整合子，通過(guò)轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒消除和質(zhì)粒測(cè)序方法已經(jīng)證明重金屬和抗生素抗性基因常常定位于質(zhì)粒上[25- 26]。除了基因上的聯(lián)系，重金屬與抗生素之間的吸附作用、絡(luò)合作用也可能是其協(xié)同抗性的原因。Jia等[27]研究發(fā)現(xiàn)重金屬銅和四環(huán)素共存時(shí)，會(huì)影響它們?cè)谕寥郎系奈叫袨?，四環(huán)素增加了Cu在兩種土壤上的吸附量。H?lzel等[28]研究發(fā)現(xiàn)鋅離子與四環(huán)素會(huì)形成穩(wěn)定的絡(luò)合物，鋅離子會(huì)抑制腸道對(duì)四環(huán)素的吸收，使得瞬時(shí)腸道(及排泄的)中的四環(huán)素濃度瞬時(shí)增大。而這種螯合作用對(duì)母藥的抑菌效力的影響還有待進(jìn)一步研究。

而具有協(xié)同殺菌作用的抗性組合有Cu2+與四環(huán)素或阿莫西林，Cr6+與頭孢拉定，低濃度的Zn2+與阿莫西林以及高濃度的Cu2+與頭孢拉定， Zn2+與四環(huán)素。相類似地，孫建平等研究發(fā)現(xiàn)金霉素與Zn(Ⅱ)之間為相加作用[18]。在重金屬、外源性化合物、有機(jī)溶劑的選擇壓力下，細(xì)菌的抗生素抗性基因會(huì)受到影響[29]。某些金屬(例如Ca、Co、Cr、Cu、Fe、K、Mg、Mn、Na、Ni和Zn)是必要的，作為微量營(yíng)養(yǎng)素，用于氧化還原過(guò)程，以通過(guò)靜電作用穩(wěn)定分子，作為多種酶的組成部分和調(diào)節(jié)滲透壓[30]。有研究表明重金屬會(huì)引起亞致死損傷，這可能會(huì)增加細(xì)菌對(duì)抗生素的敏感性[28]。另外，同一交叉抗性組合在低濃度和高濃度的表現(xiàn)出的作用類型有所不同，可能有3種原因，第一，不同濃度重金屬的毒性不同，低濃度的重金屬可作為微量營(yíng)養(yǎng)素刺激微生物生長(zhǎng)，高濃度的重金屬與酶或DNA結(jié)合，或產(chǎn)生氧自由基發(fā)生Fenton反應(yīng)，表現(xiàn)為毒性增強(qiáng)，抑制微生物的生長(zhǎng)繁殖，延長(zhǎng)微生物的增代時(shí)間，如0.5 mM的Zn2+可以抑制大腸桿菌的生長(zhǎng)，10 mM濃度的Zn2+可以減少大腸桿菌的存活[31- 32]。所以，在低濃度表現(xiàn)為協(xié)同抗性，高濃度表現(xiàn)為協(xié)同殺菌。然而，某些重金屬既有毒性，又有致突變性，如Cr6+會(huì)引起細(xì)菌DNA碼組錯(cuò)位突變和堿基對(duì)替換[33]，這就使得高濃度的Cr6+與阿莫西林表現(xiàn)為協(xié)同抗性。第二，重金屬與抗生素間的絡(luò)合作用，如重金屬陽(yáng)離子與四環(huán)素類抗生素間的配合作用[34]，銅(Ⅱ)，鎳(Ⅱ)，鈷(Ⅱ)與頭孢拉定的氨基和羰基形成絡(luò)合物[35]。由于形成的絡(luò)合物對(duì)細(xì)菌的影響還不明確，有以下3種可能：(1)絡(luò)合物無(wú)毒性；(2)絡(luò)合物低毒性；(3)絡(luò)合物高毒性。四環(huán)素與Zn2+共存時(shí)，四環(huán)素抗性隨Zn2+濃度的增大表現(xiàn)為先減弱后增強(qiáng)再減弱，可能是由于Zn2+與四環(huán)素形成的絡(luò)合物無(wú)毒或低毒，在低濃度時(shí)，以抗生素和重金屬的毒性為主，在一定范圍的高濃度，以絡(luò)合作用后四環(huán)素或重金屬的毒性為主，超過(guò)臨界濃度時(shí)，則以重金屬的毒性為主。第三，與抗生素的種類有關(guān)，種類不同，抗菌作用機(jī)制也不同。紅霉素和四環(huán)素主要抑制蛋白質(zhì)的形成，阿莫西林和頭孢拉定則抑制細(xì)胞壁的合成。細(xì)菌的耐藥作用可能需要某些重金屬的參與，如Zn2+與阿莫西林共存時(shí)，阿莫西林屬β-內(nèi)酰胺青霉素類抗生素，產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶是細(xì)菌耐藥的重要機(jī)制之一，其中金屬β-內(nèi)酰胺酶為β-內(nèi)酰胺酶中的一類，需要金屬離子Zn2+作輔因子[36]。此外，微生物的不同發(fā)育階段對(duì)重金屬敏感性不同[32]，失活的菌體對(duì)某些重金屬還具有一定的吸附作用或還原作用，如Cr6+，有研究發(fā)現(xiàn)用失活的黑曲霉吸附水體中的Cr6+時(shí)，發(fā)現(xiàn)吸附在菌體上的鉻大部分以Cr3+存在，說(shuō)明失活菌體對(duì)在吸附Cr6+的過(guò)程中還有較好的還原作用[37]。因此，重金屬的濃度與抗生素抗性之間有著很復(fù)雜的關(guān)系。

4 結(jié)論

(1)從養(yǎng)殖廢水分離出的革蘭氏陰性桿菌PseudomonasalcaligenesLH7具有3種重金屬抗性和4種抗生素抗性，對(duì)重金屬抗性強(qiáng)弱順序?yàn)镃u2+= Zn2+> Cr6+。

(2)重金屬作用下，對(duì)菌株的抗生素抗性有顯著影響。抗生素種類、重金屬種類和重金屬濃度、抗生素種類×重金屬種類、抗生素種類×重金屬濃度、重金屬種類×重金屬濃度之間的二維交互效應(yīng)以及抗生素種類×重金屬種類×重金屬濃度之間的三維交互效應(yīng)對(duì)抑菌圈直徑有極為顯著的影響(P<0.05)。重金屬的加入對(duì)四環(huán)素抗性的影響最為明顯，而對(duì)頭孢拉定的影響最不明顯。

(3) 重金屬和抗生素的交互作用主要表現(xiàn)為協(xié)同抗性和協(xié)同殺菌，濃度對(duì)交叉抗性組合的影響主要分為3種類型。在低濃度表現(xiàn)為協(xié)同抗性，高濃度表現(xiàn)為協(xié)同殺菌的抗性組合有Cr6+或Zn2+與紅霉素，Cu2+與頭孢拉定；在低濃度表現(xiàn)協(xié)同殺菌，高濃度表現(xiàn)為協(xié)同抗性的抗性組合有Cr6+或Zn2+與阿莫西林；菌體的抗生素抗性變化只與重金屬種類相關(guān)的抗性組合有Cu2+與四環(huán)素或阿莫西林或紅霉素，Cr6+與頭孢拉定。

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Effects of heavy metal stress on antibiotics resistance ofPseudomonasalcaligenesLH7

WEN Lihua1, XU Yanbin1,*, ZHOU Yan1, RUAN Jingjing1, HOU Maoyu1, SUN Hao1, QU Maomao1, YUAN Baohong2, ZHENG Li1

1SchoolofEnvironmentalScienceandEngineering,GuangdongUniversityofTechnology,Guangzhou510006,China2SchoolofBasicCourses,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China

To study the effect of heavy metal stress on bacterial antibiotic resistance, a Gram-negative bacteria isolated from swine wastewater in Guangzhou was characterized and identified asPseudomonasalcaligenesLH7. The minimal inhibition concentration (MIC) of heavy metals (Cu2+, Zn2+and Cr6+) and antibiotic susceptibility test were determined by the methods of Kirby-Bauer disk diffusion and agar dilution. Furthermore, with the joint effect of type and concentration of heavy metals, the inhibition zone diameter of the tested antibiotics (erythromycin, amoxicillin, cephradine and tetracycline) was measured by vernier caliper. The results showed that the MICs of Cu2+, Zn2+and Cr6+were 125 mg/L,125 mg/L and 100 mg/L, respectively. Multiple antibiotic resistance was also observed. ThePseudomonasalcaligenesLH7 showed resistance to erythromycin, amoxicillin, cephradine and tetracycline. The interaction of antibiotics and heavy metals significantly affected bacterial resistance (P﹤0.05). There were three kinds of cross-effects between antibiotics and heavy metals according to the types and concentrations of heavy metals. Firstly, the effect of heavy metals on antibiotic resistance could be co-resistance at low concentrations but synergic germicidal at high concentrations, such as Cr6+and erythromycin, Zn2+and erythromycin, Cu2+and cephradine. Secondly, the effect of heavy metals on antibiotic resistance could be synergic germicidal at low concentrations but co-resistance at high concentrations, such as Cr6+and amoxicillin, Zn2+and amoxicillin. Finally, the antibiotic resistance was only associated with the types of heavy metal, such as Cu2+and tetracycline or amoxicillin or erythromycin, Cr6+and cephradine. Co-existence of heavy metals in environment will change the ecological harm and environmental behavior of antibiotics, and affect the development and application of relative pollution prevention techniques, so this is a field worthy of attention.

swine wastewater;PseudomonasalcaligenesLH7; heavy metal stress; antibiotics; co-resistance; synergic germicidal

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(40801194); 中山市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013A3FC0243)

2013- 06- 24;

2014- 05- 30

10.5846/stxb201306241772

*通訊作者Corresponding author.E-mail: hopeybxu@163.com

溫麗華, 許燕濱, 周艷, 阮晶晶, 侯毛宇, 孫浩, 屈毛毛, 袁保紅, 鄭莉.重金屬脅迫對(duì)PseudomonasalcaligenesLH7抗生素抗性的影響.生態(tài)學(xué)報(bào),2015,35(10):3411- 3418.

Wen L H, Xu Y B, Zhou Y, Ruan J J, Hou M Y, Sun H, Qu M M, Yuan B H, Zheng L.Effects of heavy metal stress on antibiotics resistance ofPseudomonasalcaligenesLH7.Acta Ecologica Sinica,2015,35(10):3411- 3418.