KCNQ4和GJB2基因多態(tài)性與職業(yè)噪聲性聽力損失的相關(guān)性研究

談柯宏，于德財(cái)，張娟，*尹立紅，浦躍樸

（東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院環(huán)境醫(yī)學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京210009）

職業(yè)性噪聲導(dǎo)致的聽力損失是世界范圍內(nèi)普遍存在的職業(yè)損害之一，是由于長(zhǎng)期高水平接觸噪聲而發(fā)生的一種進(jìn)行性感音性聽力損傷。職業(yè)噪聲性聽力損失占全球范圍內(nèi)成人聽力損失的16%，僅次于老年性耳聾，其中發(fā)展中國(guó)家明顯高于發(fā)達(dá)國(guó)家[1]。人群流行病學(xué)研究表明，暴露于相同噪聲環(huán)境下，工人出現(xiàn)噪聲性聽力損失存在個(gè)體差異，噪聲性聽力損失(noise-induced hearing loss，NIHL)的發(fā)生是噪聲暴露與遺傳因素共同作用的結(jié)果，其中遺傳性因素對(duì)于發(fā)生聽力損失的作用超過(guò)50%[2]。目前噪聲性聽力損失機(jī)制假說(shuō)較多，主要包括局部缺血、神經(jīng)因子缺乏、鉀鈣離子平衡失調(diào)、過(guò)量自由基的產(chǎn)生、螺旋器細(xì)胞間連接功能的中斷以及縫隙連接蛋白的結(jié)構(gòu)改變等[3]。由于內(nèi)耳離子穩(wěn)態(tài)平衡對(duì)于維持聽覺和平衡具有重要影響，因而與離子平衡相關(guān)的基因研究較為透徹[4]。內(nèi)耳淋巴循環(huán)含有較高濃度K+，參與電信號(hào)的傳導(dǎo)，如果K+通道及相關(guān)協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白發(fā)生改變，可以導(dǎo)致內(nèi)耳鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制紊亂進(jìn)而出現(xiàn)聽力損傷[5]。故本研究選取鉀離子通道蛋白基因KCNQ4 rs34287852和縫隙連接蛋白基因GJB2 rs3751385，探討其基因多態(tài)性與中國(guó)漢族人群噪聲性聽力損失的相關(guān)性。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象

1.1.1 病例選擇南京市某汽車制造廠及某軌道交通車輛廠發(fā)生噪聲性聽力損傷的工人103例。納入標(biāo)準(zhǔn)：依據(jù)《GBZ 49-2007 職業(yè)性聽力損失診斷標(biāo)準(zhǔn)》對(duì)職業(yè)性聽力損失進(jìn)行診斷，雙耳高頻(3000、4000、6000 Hz)平均聽閾≥40 dB(A)，且雙耳聽力曲線符合NIHL特點(diǎn)。同時(shí)符合下列條件：無(wú)耳毒性化學(xué)物接觸史，無(wú)爆震史、家族性耳聾史及耳毒性藥物使用史。

1.1.2 對(duì)照選擇與病例組工人相同作業(yè)崗位，雙耳高頻、語(yǔ)頻平均聽閾≤25 dB(A)的工人，按同性別、同年齡(±5歲)，同接噪工齡(±3年)的要求1∶1配對(duì)。

1.1.3 試劑和儀器基因組DNA提取試劑盒(DP319)，購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；引物設(shè)計(jì)與合成，上海捷瑞生物工程有限公司。凝膠成像分析系統(tǒng)(Multiphor II型)；基因?qū)W分析儀(ABI 3730)。

1.2 基因組DNA提取

對(duì)符合要求的研究對(duì)象，抽取其外周血2 mL。使用血液基因組提取試劑盒提取基因組DNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)量DNA濃度和純度，經(jīng)鑒定合格，進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.3 基因分型

1.3.1 引物序列KCNQ4基因：上游引物5′-CCCA AGTCCTAAGTCAGCTTTGTC-3′，下游引物5′-GAG TCTCAGAGATGCCCGGAAG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物287 bp。GJB2基因：上游引物5′-AGAAATAGACAGCATGAG AGGGATG-3′，下游引物5′-CTTTGTTTTGAGGCTT TAGGGGA-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物180 bp。

1.3.2 PCR擴(kuò)增擴(kuò)增體系：使用PCR kit(Takara Ex Taq)，總體積25 μL，其中TaqDNA聚合酶1 U(5 U/μL)，Buffer緩沖液(含Mg2+)4 μL，脫氧核苷三磷酸(dNTPs) 1.6 μL (2.5 mmol/L)，引物各0.4 μL (10 μmol/L)，模板50 ng。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。

1.3.3 基因型鑒定采用瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)Multiphor II型凝膠成像分析系統(tǒng)確認(rèn)擴(kuò)增目的片段。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行基因分析(華大基因)，鑒定目的位點(diǎn)基因型。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，對(duì)兩位點(diǎn)各基因型和等位基因在兩組人群中的分布頻率進(jìn)行χ2分析，使用Logistic回歸分析，計(jì)算突變基因型根據(jù)兩組突變比值比(odds ratio，OR)比較突變基因型噪聲性聽力損失發(fā)生的危險(xiǎn)度，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 病例組與對(duì)照組一般人口學(xué)特征

例組與對(duì)照組一般信息如表1所示，兩組工人年齡和接噪工齡差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＞0.05)。

表1 病例組與對(duì)照組年齡、性別、工齡、接噪工齡構(gòu)成情況

2.2 KCNQ4和GJB2基因型測(cè)序

基因型測(cè)序結(jié)果見圖1，KCNQ4 rs34287852經(jīng)正向測(cè)序，基因型包含野生純合型TT(A1)、突變雜合型GT(A2)、突變純合型GG(A3)。GJB2 rs3751385經(jīng)反向測(cè)序，其基因型包含野生純合TT(B1)、突變雜合型CT(B2)、突變純合型CC(B3)。

2.3 KCNQ4和GJB2基因型與噪聲性聽力損失

KCNQ4 rs34287852和GJB2 rs3751385基因型及等位基因頻率在病例和對(duì)照組間分布見表2。KCNQ4 rs34287852位點(diǎn)T、G等位基因在病例組中分布頻率分別為93.2%和6.8%，在對(duì)照組中分別為95.6%和4.4%，其中TT、GT、GG基因型在病例組和對(duì)照組的分布頻率分別為 88.3%、9.7%、1.9%和91.3%、8.7%、0。KCNQ4突變位點(diǎn)(rs34287852)基因型頻率和等位基因頻率在兩組之間的分布差別均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.479，P=0.394)。GJB2 rs3751385位點(diǎn)T、C等位基因在病例組中分布頻率分別為46.6%和53.4%，在對(duì)照組中分別為57.8%和42.2%，等位基因頻率在兩組之間分布差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.03)；TT、CT、CC 3種基因型在病例組和對(duì)照組的分布頻率分別為17.4%、58.3%、24.3%和31.1%、53.4%、15.5%；病例組GJB2 rs3751385突變基因型頻率更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.047)。工人GJB2 rs3751385突變純合型CC相比野生純合型TT發(fā)生噪聲性聽力損失的危險(xiǎn)性大(OR=2.78，95% CI=1.18～6.52)。

表2 KCNQ4和GJB2基因多態(tài)性與噪聲性聽力損失的相關(guān)分析

3 討論

參與調(diào)控內(nèi)耳淋巴液離子轉(zhuǎn)運(yùn)通道的蛋白主要包含KCNQ1，KCNQ4等K+通道蛋白，構(gòu)成電壓門控式通道，控制內(nèi)耳毛細(xì)胞內(nèi)外K+平衡。其中KCNQ4基因參與耳蝸外毛細(xì)胞和前庭器官毛細(xì)胞功能，其通道存在于內(nèi)耳外毛細(xì)胞膜外側(cè)，控制K+外流，維持細(xì)胞靜息電位[6-7]。其突變可導(dǎo)致常染色體顯性慢性進(jìn)行性聽力損傷，從高頻聽閾發(fā)展覆蓋各頻段聽閾[8-9]。因而其突變是否對(duì)于噪聲性聽力損傷的發(fā)生有貢獻(xiàn)，對(duì)于篩查噪聲作業(yè)易感基因具有重要意義。在瑞典和波蘭兩例噪聲作業(yè)工人病例對(duì)照研究中，KCNQ4 rs34287852位點(diǎn)突變與噪聲作業(yè)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[10-11]。但其最小等位基因頻率(minor allele frequency，MAF)為22.2%，說(shuō)明位點(diǎn)突變?cè)诎追N人群廣泛存在。在本研究中病例組和對(duì)照組中MAF分別為6.8%和4.4%，該位點(diǎn)突變可能存在種群差異。研究結(jié)果表明KCNQ4 rs34287852在兩組人群中突變基因型及等位基因頻率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其突變不影響噪聲性聽力損失的發(fā)生。

內(nèi)耳細(xì)胞間存在多聚體結(jié)構(gòu)的縫隙連接蛋白Connexins(Cx)，其對(duì)于維持內(nèi)耳淋巴液成分穩(wěn)定，特別是在K+傳遞中具有重要作用[12-13]。其家族蛋白基因包括GJB2和GJB6基因突變確認(rèn)與人聽力損失相關(guān)[14-15]。其中GJB2基因約有220個(gè)突變位點(diǎn)與聽力損傷存在相關(guān)，50%常染色體隱性非綜合性聽力損失(autosomal recessive non-syndromic hearing loss，ARNSHL)與其相關(guān)，且多為遲發(fā)型聽力損傷[16]。在對(duì)GJB2基因突變與噪聲性聽力損失的研究中，2006年瑞典噪聲暴露工人病例對(duì)照研究認(rèn)為選取GJB2基因兩個(gè)突變位點(diǎn)rs3751385，rs5030700的基因型與噪聲性聽力損失無(wú)相關(guān)性[10]，但在2009年波蘭噪聲作業(yè)工人配對(duì)病例研究中，發(fā)現(xiàn)rs3751385基因型與噪聲性聽力損失存在相關(guān)性[11]，這可能與該位點(diǎn)在兩人群中等位基因頻率不同及連鎖不平衡影響[17]。這一位點(diǎn)突變與ARNSHL的相關(guān)性在希臘人和葡萄牙人得到驗(yàn)證[18-19]。本研究中103例噪聲性聽力損失工人GJB2 rs3751385 突變的等位基因和基因型頻率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其雜合突變?cè)谠肼曌鳂I(yè)人群中的噪聲性聽力損失風(fēng)險(xiǎn)為野生型2.78倍，突變與噪聲性聽力損失存在相關(guān)性。現(xiàn)在已知基因的3′UTR區(qū)域?qū)τ谵D(zhuǎn)錄物斷裂、選擇性多腺苷酸化以及mRNA的出核起著重要調(diào)控作用[20]。rs3751385位于GJB2基因的3′UTR，有研究表明該突變可能通過(guò)調(diào)控GJB2基因的表達(dá)來(lái)影響聽力[21]。

綜上，KCNQ4 rs34287852位點(diǎn)突變較少，其突變與噪聲性聽力損失無(wú)相關(guān)性，這也可能受限于樣本量的比例。GJB2 rs3751385位點(diǎn)突變與噪聲性聽力損失可能存在相關(guān)性，可以進(jìn)一步從機(jī)制上去驗(yàn)證這一位點(diǎn)突變與噪聲性聽力損失的關(guān)系，從而為噪聲性聽力損失的預(yù)防提供科學(xué)依據(jù)。

[1] Nelson DI，Nelson RY，Concha-Barrientos M，et al. The global burden of occupational noise-induced hearing loss[J]. Am J Ind Med，2005，48(6)：446-458.

[2] Sliwinska-Kowalska M，Davis A. Noise-induced hearing loss[J]. Noise & Health，2012，14(61)：274-180.

[3] 曲騰飛，龔樹生. 噪聲性聾致病機(jī)制及其防護(hù)研究[J]. 國(guó)際耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2013，37(006)：318-320.

[4] 王秋菊，Mohamed A. 耳內(nèi)科疾病相關(guān)基礎(chǔ)研究與診治新進(jìn)展：上篇[J]. 中 華耳科學(xué)雜志，2012，10(2)：201-207.

[5] Wangemann P. K+cycling and the endocochlear potential[J].Hear Res，2002，165：1-9.

[6] Kubisch C，Schroeder BC，F(xiàn)riedrich T，et al. KCNQ4，a novel potassium channel expressed in sensory outer hair cells，is mutated in dominant deafness[J]. Cell，1999，96(3)：437-446.

[7] Kharkovets T，Harderlin JP，Safieddine S，et al. KCNQ4，a K+channel mutated in a form of dominant deafness，is expressed in the inner ear and the central auditory pathway[J].Proc Natl Acad Sci USA，2000，97(8)：4333-4338.

[8] Naito T，Nishio SY，Iwasa Y，et al. Comprehensive genetic screening of KCNQ4 in a large autosomal dominant nonsyndromic hearing loss cohort：genotype-phenotype correlations and a founder mutation[J]. PLoS One，2013，8(5)：e63231.

[9] Nie L. KCNQ4 mutations associated with nonsyndromic progressive sensorineural hearing loss[J]. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg，2008，16(5)：441-444.

[10] Van Laer L，Carlsson PI，Ottschytsch N，et al. The contribution of genes involved in potassium-recycling in the inner ear to noise-induced hearing loss[J]. Hum Muta，2006，27：786-795.

[11] Pawelczyk M，Van Laer L，F(xiàn)ransen E，et al. Analysis of gene polymorphisms associated with K on circulation in the inner ear of patients susceptible and resistant to noise-induced hearing loss[J]. Ann Hum Genet，2009，73(4)：411-421.

[12] Kikuchi T，Adams JC，Miyabe Y，et al. Potassium ion recycling pathway via gap junction systems in the mammalian cochlea and its interruption in hereditary nonsyndromic deafness[J]. Med Electron Microsc，2000，33(2)，51-56.

[13] Zhao，HB，Kikuchi T，Ngezahayo A，et al. Gap junctions and cochlear Homeostasis[J]. J Mem Biol，2006，209(2/3)，177-186.

[14] Richard G，White TW，Smith LE，et al. Functional defects of Cx26 resulting from a heterozygous missense mutation in a family with dominant deaf-mutism and palmoplantar keratoderma[J].Hum Genet，1998，103(4)：393-399.

[15] Grifa A，Wagner CA，D’Ambrosio L，et al. Mutations in GJB6 cause nonsyndromic autosomal dominant deafness at DFNA3 locus[J]. N at Genet，1999，23(1)：16-18.

[16] Zelante L，Gasparini P，Estivill X，et al. Connexin26 mutations associated with the most common form of nonsyndromic neurosensory autosomal recessive deafness(DFNB1) in Mediterraneans[J]. Hum Mol Genet，1997，6(9)：1605-1609.

[17] Sliwinska-Kowalska M，Pawelczyk M. Contribution of genetic factors to noise-induced hearing loss：a human studies review[J]. Mutat Res，2013，752(1)：61-65.

[18] Kokotas H，Van Laer L，Grigoriadou M，et al. Strong linkage disequilibrium for the frequent GJB235delG mutation in the Greek population[J]. Am J Med Genet，2008，146(22)：2879-2884.

[19] Grillo AP，de Oliveira FM，de Carvalho GQ，et al. Single nucleotide polymorphisms of the GJB2 and GJB6 genes are associated with autosomal recessive nonsyndromic hearing loss[J]. Biomed Res Int，2015. d oi：10.1155/2015/318727.

[20] Grzybowska EA，Wilczynska A，Siedlecki JA. Regulatory functions of 3′-UTRs[J]. Biochem Bioph Res Co，2001，288(2)：291-295.

[21] Matos TD，Sim?es-Teixeira H，Caria H，et al. Assessing noncoding sequence variants of GJB2 for hearing loss association[J]. Genet Res Int，2011. d oi：10.4061/2011/827469.