基因Ⅶ型新城疫病毒的免疫及生物學(xué)基礎(chǔ)

陳申秒，吳雪莉

（1.山東濱州沃華生物工程有限公司山東濱州256600；2.山東博萊威生物技術(shù)研究所山東濱州256606；3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院江蘇南京210095）

基因Ⅶ型新城疫病毒的免疫及生物學(xué)基礎(chǔ)

陳申秒1，2，吳雪莉3

（1.山東濱州沃華生物工程有限公司山東濱州256600；2.山東博萊威生物技術(shù)研究所山東濱州256606；3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院江蘇南京210095）

基因Ⅶ型新城疫已成為我國禽業(yè)養(yǎng)殖中的主要新城疫類別，在商品肉雞和蛋雞養(yǎng)殖臨床中成為防治重點(diǎn)，本文從基因Ⅶ型新城疫病毒的分子生物學(xué)基礎(chǔ)上進(jìn)行分析，結(jié)合生產(chǎn)實(shí)踐，為養(yǎng)殖一線制定切實(shí)可行的防治措施提供比較有價(jià)值的參考。

基因Ⅶ型；新城疫病毒；分子生物學(xué)

雞新城疫病毒(New castle disease virus,NDV)屬于副黏病毒科，腮腺炎病毒屬的單股負(fù)鏈RNA病毒，是危害養(yǎng)禽業(yè)最重要的傳染性病毒之一，被OIE列為A類疫病。受養(yǎng)殖環(huán)境、免疫壓力和生物安全措施等各種因素的影響，雞新城疫病毒成為最常見，同時(shí)也是防控難度最大、問題最多的疫病之一。全世界曾多次發(fā)生新城疫的大流行，研究認(rèn)為目前處于NDV的第四次大流行期，流行病學(xué)研究證實(shí)本次流行是由基因Ⅶ型NDV引起的，在亞洲、非洲和歐洲等地區(qū)的研究確定為基因Ⅶd亞型引起，雖然沒有出現(xiàn)世界性的全面大流行，但局部地區(qū)，特別是我國，出現(xiàn)大面積的免疫蛋雞群產(chǎn)蛋率下降，肉雞群高死亡率的情況，損失嚴(yán)重。

1 NDV毒力鑒定及基因型研究

根據(jù)對(duì)NDV全基因組的遺傳進(jìn)化分析，NDV只有一個(gè)血清型，但可以分為ClassⅠ和ClassⅡ2個(gè)不同分支。ClassⅠ型被認(rèn)為是無毒株或弱毒株，ClassⅡ型包括了基本所有的疫苗毒株，從臨床分離的致病毒株基本都是ClassⅡ型，按照F蛋白可將每個(gè)群分成9個(gè)不同的基因型。其中Ⅰ～Ⅳ型和Ⅴ～ⅤⅢ型基因組長度不同，分別為15 186 nt、15 192 nt。其中目前所用的疫苗毒株Lasota、clone30、N79等毒株均為基因Ⅱ型，當(dāng)前被國內(nèi)外學(xué)者認(rèn)為處于NDV的第四次大流行，其主要病原為基因Ⅶ型NDV。

判定NDV強(qiáng)、弱毒的有傳統(tǒng)的生物學(xué)特性鑒定法和分子生物學(xué)鑒定法。對(duì)NDV分離株測定，6周齡靜脈接種指數(shù)（IVPI）、1日齡腦內(nèi)接種指數(shù)（ICPI）、雞胚最小致死量（MDT）是用于判定NDV毒力的生物學(xué)指標(biāo)，孫靜等對(duì)山東分離株NDV強(qiáng)毒株測定的MDT、ICPI、IVPI分別為47.4h、1.975、2.85[1]。分子生物學(xué)方法研究證實(shí)，NDV的毒力與F蛋白的氨基酸序列直接相關(guān)，強(qiáng)、弱毒株在氨基酸裂解位點(diǎn)上截然不同，F(xiàn)蛋白 112-117氨基酸序列為112R-RQ-K/R-R-F117、112G-R/K-Q-G-R-L117兩種[2]，可作為判定分離毒株毒力的生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，目前國內(nèi)分離毒株強(qiáng)毒的確認(rèn)均采用F蛋白112-117氨基酸序列作為分子生物學(xué)判定方法。

很多學(xué)者建立了其他分子生物學(xué)診斷方法來區(qū)分NDV強(qiáng)、弱毒株，主要是RT-PCR、熒光RT-PCR鑒別技術(shù)。陳安莉等參照NDV強(qiáng)、弱毒株F基因序列及其F基因的保守序列設(shè)計(jì)了3套LAMP引物，可以根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果來區(qū)分NDV強(qiáng)、弱毒株[3]，可供參考使用；殷俊磊等利用F基因保守區(qū)建立了雛雞體內(nèi)NDV強(qiáng)毒的熒光定量RT-PCR檢測方法[4]。分子生物學(xué)方法可用于實(shí)驗(yàn)室檢測，但準(zhǔn)確率和可重復(fù)性需要進(jìn)一步驗(yàn)證，耗時(shí)長、技術(shù)和設(shè)備要求高，對(duì)臨床常規(guī)檢測意義不大，因此并不適合于養(yǎng)殖一線的普通實(shí)驗(yàn)室使用。建立快速簡便、準(zhǔn)確、可重復(fù)性高的檢測技方法，特別是應(yīng)當(dāng)開發(fā)易于操作的試劑盒，對(duì)基層獸醫(yī)服務(wù)有很大的幫助，對(duì)GeneⅦ的監(jiān)測和防治意義重大。

基因型的分類依據(jù)F基因的研究，研究發(fā)現(xiàn)在F基因334～1 682 nt之間限制性內(nèi)切酶HinfⅠ、BstoⅠ和RsaⅠ位點(diǎn)分布的不同，通過3種酶切位點(diǎn)的差異用于NDV基因型的鑒定[5]。根據(jù)F基因47～435 nt序列推導(dǎo)的核苷酸序列繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹，所反映的毒株之間的進(jìn)化關(guān)系與限制性酶切位點(diǎn)分布所分析得出的結(jié)論是一致的，所以酶切位點(diǎn)分布分析的方法和F基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹均可進(jìn)行NDV的基因型的鑒定。2002年至今，對(duì)國內(nèi)NDV的分子流行病學(xué)研究多是采用F序列的同源性及進(jìn)化關(guān)系，揚(yáng)州大學(xué)、國家新城疫參考實(shí)驗(yàn)室等公布的總計(jì)200多株強(qiáng)毒分離株96%以上屬于基因Ⅶ型。

2 基因Ⅶ新城疫病毒毒力變化的分子生物學(xué)研究

不同基因型NDV的基因組大小略有不同，Ⅴ～ⅤⅢ型基因組15 192 nt，由融合蛋白(F)、血凝素神經(jīng)氨酸酶(HN)、核衣殼蛋白（NP）、基質(zhì)蛋白(M)、磷蛋白(P)和大分子蛋白(L)6種結(jié)構(gòu)蛋白組成[6]，其結(jié)構(gòu)蛋白構(gòu)成模式為3′-NP-P-M-F-HN-L-5′。HN蛋白和F蛋白是研究最為深入的蛋白，研究認(rèn)為HN蛋白與受體結(jié)合，介導(dǎo)F蛋白與細(xì)胞膜的融合，兩者是和NDV毒力最為相關(guān)的結(jié)構(gòu)蛋白，是NDV主要的致病因子[7]。

對(duì)F蛋白多肽裂解位點(diǎn)的研究發(fā)現(xiàn)，基因Ⅶ型強(qiáng)毒株F蛋白序列出現(xiàn)不同的基因點(diǎn)突變，有些突變?yōu)楣餐耐蛔凕c(diǎn)，也出現(xiàn)了分離株不一致的突變點(diǎn)；強(qiáng)毒株的標(biāo)志為多肽裂解位點(diǎn)（F1和F2多肽裂解位點(diǎn)）的變化。據(jù)報(bào)道，從山東分離基因Ⅶ型強(qiáng)毒株，多肽裂解位點(diǎn)為112-RRQKRF-117，F(xiàn)基因核苷酸同源性與基因Ⅶ型雞源毒株同源性在93.5%～98.3%，而與經(jīng)典強(qiáng)毒株F48E9和Lasota株的核苷酸和氨基酸同源性卻都比較低[1]；張會(huì)娟等對(duì)2株分離株全基因序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，與Genbank公布的29株基因Ⅶ型強(qiáng)毒株核酸序列同源性為91%～97%，與中國標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒F48E8同源性僅85%[8]。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)了69、78兩個(gè)位置的不同點(diǎn)突變，這些點(diǎn)突變與分離株的生物學(xué)毒力有很大關(guān)系，對(duì)于基因Ⅶ型毒株新的變異方向也具有很大研究價(jià)值。根據(jù)F基因推導(dǎo)的氨基酸序列出現(xiàn)了特異的殘基替換，根據(jù)楊少華等研究，其推導(dǎo)的Ⅶ型F蛋白氨基酸序列發(fā)現(xiàn)了Ⅶd中Ⅰ52-V、Ⅶa、Ⅶc和Ⅶd中R101-K和A176-S氨基酸替換[9]；山東地區(qū)Ⅶd分離株的報(bào)道中也發(fā)現(xiàn)存在Q279-H和K387-R的氨基酸殘基替換；同時(shí)F蛋白功能區(qū)也存在高度保守的糖基化位點(diǎn)和氨基酸殘基，這與可能與F蛋白介導(dǎo)細(xì)胞膜融合，參與NDV對(duì)細(xì)胞的侵蝕性具有相關(guān)性，但保守的糖基化位點(diǎn)和氨基酸殘基及其功能需要進(jìn)一步確定，來自上海地區(qū)的研究報(bào)道了基因Ⅶ型強(qiáng)毒株之間RE位點(diǎn)分布的變化。需要注意的是基因Ⅶ型分離株在1 249 nt的RsaⅠ位點(diǎn)是其他亞型NDV沒有的，在鵝源NDV分離株的研究中常見該酶切位點(diǎn)的報(bào)道，楊少華等所分離的3個(gè)毒株基因Ⅶd型毒株與報(bào)道的鵝源及鴨源NDV分離株之間核苷酸序列具有非常高的同源性，揭示鴨源、鵝源NDV與雞源NDV在遺傳學(xué)和流行病學(xué)上密切相關(guān)[9]。這些提示對(duì)NDV的研究要重視不同來源的重組帶來的F基因的序列變化。

HN蛋白兼有血凝素和神經(jīng)氨酸酶的活性，負(fù)責(zé)病毒粒子與其細(xì)胞受體的起始吸附和受體破壞活性，在免疫反應(yīng)中作用極為突出。HN蛋白的球狀區(qū)分布了所有單克隆抗體能夠識(shí)別的神經(jīng)氨酸酶活性位點(diǎn)、受體結(jié)合位點(diǎn)和抗原位點(diǎn)[10]，對(duì)NDV侵蝕性和逃避免疫的影響重大。HN蛋白的七肽重復(fù)序列(Heptad repeat region,HR)，可以能形成α螺旋，進(jìn)而與F蛋白的相關(guān)區(qū)域形成的超螺旋具有改變F蛋白構(gòu)象的功能[9]。HN蛋白受體結(jié)合關(guān)鍵區(qū)域在193-201、494、513-521、569、345-353位氨基酸位點(diǎn)，這些區(qū)域或其相近區(qū)域的氨基酸序列變化對(duì)毒株與單抗的反應(yīng)性具有根本性的變化，疫苗株的203、342、394-395、508-509、514、570位氨基酸在基因Ⅶ型NDV分別突變?yōu)榻M氨酸（H）、天冬酰胺（N）、天冬氨酸和谷氨酸（E）、天冬酰胺和異亮氨酸、纈氨酸、精氨酸（R）。研究認(rèn)為關(guān)鍵性位點(diǎn)的改變決定了單克隆抗體抗原決定簇的空間構(gòu)象，從而導(dǎo)致了與單抗反應(yīng)性的改變[11]。國內(nèi)學(xué)者研究還發(fā)現(xiàn)在強(qiáng)毒株的HN蛋白線性表位345-352aa處，出現(xiàn)347位氨基酸由E-K（G）的變化，77位氨基酸由天冬酞胺（N）突變?yōu)榻z氨酸（S），這種變化導(dǎo)致了病毒與單抗的反應(yīng)性降低，對(duì)于病毒對(duì)免疫的逃避具有很大的作用，這與免疫壓力下的病毒變異應(yīng)當(dāng)具有很大的關(guān)系。

其他蛋白在NDV的毒力和生物學(xué)特性上的功能也在研究當(dāng)中，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)另外四種結(jié)構(gòu)蛋白、RNA編輯機(jī)制形成的W蛋白和V蛋白在NDV的致病機(jī)制中發(fā)揮了作用[12]，在NDV蛋白結(jié)構(gòu)及其相互作用機(jī)制方面還有很多有待于深入研究的地方，這些蛋白的變化、及相互協(xié)同性對(duì)NDV毒力的影響和遺傳變化需要進(jìn)一步核實(shí)。

3 基因Ⅶ新城疫防控的關(guān)鍵和前景

免疫壓力必然導(dǎo)致NDV的變異，出現(xiàn)的強(qiáng)毒株能夠逃避傳統(tǒng)疫苗的免疫，其物學(xué)特性、及分子生物學(xué)上的變化的研究是解決NDV免疫的關(guān)鍵，如上述病毒與單克隆抗體反應(yīng)性的降低，氨基酸序的替換等均能導(dǎo)致疫苗免疫后不能形成有效地保護(hù)[8]。從分子學(xué)角度，疫苗毒株均屬于基因Ⅱ型，與強(qiáng)毒基因Ⅶ型分離株遺傳關(guān)系遠(yuǎn)，基因組同源性僅82%左右?；颌餍蚇DV引起不同日齡產(chǎn)蛋雞群發(fā)生產(chǎn)蛋大幅下降的情況，肉雞群中同樣可以分離到大量的新城疫強(qiáng)毒株。流行病學(xué)調(diào)查顯示，這些雞群均經(jīng)新城疫油佐劑苗多次免疫，具有較高的HI抗體水平，抗體均一度良好。筆者在臨床中也多次發(fā)現(xiàn)產(chǎn)蛋雞群免疫NDV油佐劑滅活苗后雞群ND HI抗體水平達(dá)1∶64以上，仍不能有效抵抗ND強(qiáng)毒株的感染的情況。部分認(rèn)為雞群缺乏局部免疫抗體（黏膜免疫IgA）造成感染，但根據(jù)很多規(guī)?；u場系統(tǒng)的免疫程序和臨床監(jiān)測，可以確定NDV的變異造成了新城疫發(fā)生，即使很高的抗體，流行毒株和疫苗抗體之間的差異最終不能對(duì)基因Ⅶ型NDV形成有效防護(hù)。

不僅雞源NDV強(qiáng)毒的變化，水禽分離株變化同樣應(yīng)引起高度重視，國內(nèi)外報(bào)道的雞源NDV分離株、基因Ⅶ型NDV分離株中Ⅶa、b、c、d和e亞型之間也有很多不同的氨基酸替換或其他方面的突變，前面已經(jīng)詳述，而國內(nèi)的研究發(fā)現(xiàn)從鵝群分離到的基因Ⅶc亞型出現(xiàn)了1 249 nt RsaⅠ位點(diǎn)，這在其他NDV分離株上未見報(bào)道，所以懷疑新出現(xiàn)的很多具有較高致病力的NDV分離毒株很有可能來源于水禽，這些毒株與傳統(tǒng)的Clone30、Lasota、CS2和V4疫苗株相比發(fā)生了很大的遺傳改變，親緣關(guān)系也比較遠(yuǎn)。同時(shí)根據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)，在雞群免疫體系的壓力普遍高于水禽，即水禽有可能成為NDV逃避免疫并產(chǎn)生新城疫變異毒株棲身場所，因此，應(yīng)密切關(guān)注生產(chǎn)中NDV抗原性的變化，對(duì)基因Ⅶ型NDV做好病毒生物學(xué)的良好監(jiān)測。

在疫苗研究中Cho等用流行株F、HN替換Lasota已經(jīng)獲得了致弱的重組毒株，并制備了滅活疫苗，與Lasota滅活苗相比產(chǎn)蛋率提高10%[13]；我國農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病學(xué)實(shí)驗(yàn)室同樣獲得了基因Ⅶ型致弱毒株，毒力符合弱毒株標(biāo)準(zhǔn)，且不能造成細(xì)胞病變，致弱株制備活疫苗、滅活疫苗與Lasota相比均具有很大優(yōu)勢，能有效降低動(dòng)物排毒率，顯著減少泄殖腔病毒含量。從生產(chǎn)臨床中看，新城疫的排毒是需要解決的問題，各種致弱毒株的臨床效果需要進(jìn)一步的驗(yàn)證，同時(shí)解決抗體檢測中與Lasota的區(qū)別，對(duì)使用過程中病毒分子生物學(xué)的變化應(yīng)當(dāng)加以檢測，避免重組出現(xiàn)的返祖、不同來源病毒的重組和出現(xiàn)更強(qiáng)毒株等問題，同時(shí)考慮從流行的代表性毒株篩選候選疫苗株配合常規(guī)疫苗免疫，控制NDV的排毒，才能真正有效的控制強(qiáng)毒NDV的流行。

在現(xiàn)在NDV基因Ⅶ型發(fā)生率高的情況下，關(guān)鍵是做好NDV的基礎(chǔ)免疫，本實(shí)驗(yàn)室通過大量的田間試驗(yàn)，建議肉雞免疫以活疫苗免疫配合滅活苗免疫為主，有條件的可以通過母源抗體測定確定免疫日齡，選擇弱毒疫苗配合滅活疫苗注射；蛋雞免疫關(guān)鍵是建立系統(tǒng)的免疫程序，在1～60日齡以活疫苗做好基礎(chǔ)免疫，配合滅活疫苗提高抗體水平，同時(shí)關(guān)注法氏囊等免疫抑制病對(duì)NDV疫苗的影響，在開產(chǎn)強(qiáng)要高度重視滅活疫苗的使用，可選擇具有針對(duì)基因Ⅶ型防治的滅活疫苗，確保產(chǎn)蛋高峰期來臨之前具有很高的抗體水平，在開產(chǎn)以后定期補(bǔ)免新城疫、禽流感二聯(lián)滅活疫苗?！觯ň庉嫞旱一郏?/p>

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Immunological and Biological Basis of GenotypeⅦNewcastle Disease Virus

Chen Shenmiao1，2，Wu Xueli3
（1.Shandong Binzhou Wohua Biotech Co.,Ltd,Binzhou Shandong,256606; 2.Shandong Binzhou Bilaiwei Biological Technology Institute,Binzhou Shandong,256606；3.College of prataculture science,Nanjing Agricultural University,Nanjing Jiangsu,210095）

GenotypeⅦNewcastle disease has become the main Newcastle disease in China poultry breeding in the category,has become the focus in commercial broiler and laying hens in the clinical prevention,this paper carries on the analysis from the basis of molecular biology of Newcastle disease virus,combining with production practice,provide more valuable preventive measures for the breeding line.

GenotypeⅦ;Newcastle disease virus;Biological

10.3969/j.issn.1008-4754.2015.01.032

陳申秒，男，（1983-），山東菏澤鄆城人，助理研究員，碩士，從事動(dòng)物傳染病的診斷與防治工作，E-mail：csmiao.science@163.com。