胡桃醌對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U-87 MG遷移、侵襲能力的抑制作用☆

楊丹王麗李珠劉趙陽(yáng)孫燕郭麗付佳祁榮王俊平

·論 著·

胡桃醌對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U-87 MG遷移、侵襲能力的抑制作用☆

楊丹*王麗*李珠*劉趙陽(yáng)*孫燕*郭麗**付佳**祁榮**王俊平*

目的探討肽基脯酰胺順?lè)串悩?gòu)酶Pin1（peptidyl-prolyl isomerase 1）抑制劑胡桃醌（Juglone）對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U-87 MG遷移、侵襲能力的影響并探討相關(guān)機(jī)制。方法膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U-87 MG經(jīng)0、0.8、1.6和3.2 μmol·L-1胡桃醌處理后，以細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力，transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力，western blot法檢測(cè)β-鏈蛋白（β-catenin）、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）、基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）和基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示1.6 μmol·L-1和3.2 μmol·L-1胡桃醌組U-87 MG細(xì)胞劃痕創(chuàng)面愈合率分別為46.04%±6.25%和30.05%±13.35%，與0 μmol·L-1組比較明顯下降（P＜0.05）；transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示1.6 μmol·L-1和3.2 μmol·L-1胡桃醌組穿膜細(xì)胞數(shù)平均為（103.67±5.69）個(gè)和（77.33±7.77）個(gè)，與0 μmol·L-1組比較明顯減少（P＜0.05）；western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示胡桃醌可顯著下調(diào)U-87 MG細(xì)胞β-catenin、VEGF、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平，作用隨濃度增加而增大。結(jié)論胡桃醌可通過(guò)下調(diào)β-catenin及其下游MMP-2、MMP-9和VEGF的蛋白表達(dá)而抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移、侵襲能力。

胡桃醌 膠質(zhì)瘤 β-鏈蛋白 血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子 基質(zhì)金屬蛋白酶-2基質(zhì)金屬蛋白酶-9

胡桃醌（Juglone）屬于萘醌類(lèi)，分子量174.16，是肽基脯酰胺順?lè)串悩?gòu)酶Pin1（peptidyl-prolyl isomerase 1）的小分子抑制劑。目前研究表明胡桃醌具有顯著的抗腫瘤作用，但研究多為觀察其對(duì)瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響，關(guān)于其對(duì)腫瘤遷移、侵襲能力影響的報(bào)道較少見(jiàn)[1,2]。本研究擬采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell小室法檢測(cè)其對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移、侵襲能力的抑制作用，同時(shí)檢測(cè)胞內(nèi)β-鏈蛋白（β-catenin）、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（vas?cular endothelial growth factor,VEGF）、基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）和基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）蛋白含量的變化，從分子水平探討胡桃醌抑制人膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移、侵襲能力的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象人膠質(zhì)瘤U-87 MG細(xì)胞株由中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫(kù)提供，將細(xì)胞于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中，用DMEM高糖培養(yǎng)基+10%FBS培養(yǎng)（加入1%L-谷氨酰胺，1%青鏈霉素），1～2 d更換培養(yǎng)液1次,每2～3 d傳代一次，實(shí)驗(yàn)時(shí)選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。試劑與儀器：胡桃醌和溴化四氮唑藍(lán)（MTT）（Sigma公司）；DMEM高糖培養(yǎng)基及胰酶（Gibco公司）；新生牛血清（FBS）（杭州四季青公司）；化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒（Pierce公司）；Matrigel（BD公司）；Transwell小室（Costar公司）；VEGF、MM P-2、MMP-9抗體（Santa Cruz公司）；β-catenin抗體（CST公司）；PVDF膜（Millipore公司）。

1.2 MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖將U-87 MG細(xì)胞接種于96孔板中，細(xì)胞濃度為5×104mL-1細(xì)胞，體積為100 μL，于37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。加入胡桃醌培養(yǎng)液（終濃度分別為0、15.63、31.25、62.5、125和250 μmol·L-1）體外培養(yǎng)48h后，每孔加入20 μL MTT（終濃度5 g·L-1），37℃繼續(xù)孵育4 h，棄上清，每孔加入150 μLDMSO振蕩10 min，于490 nm測(cè)定吸光度值。

1.3 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)將U-87 MG細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至90%融合后用200 μL吸頭在6孔板內(nèi)垂直劃痕，用PBS清洗細(xì)胞3次后加入無(wú)血清培養(yǎng)基及終濃度0、0.8、1.6和3.2 μmol·L-1的胡桃醌繼續(xù)培養(yǎng)48 h后在倒置顯微鏡下拍照記錄。

1.4 Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)記述的方法[3]，加入終濃度0、0.8、1.6和3.2 μmol·L-1的胡桃醌繼續(xù)24 h后，每個(gè)小室取5個(gè)視野計(jì)穿膜細(xì)胞個(gè)數(shù)，以穿膜細(xì)胞的數(shù)目表示腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。

1.5 蛋白免疫印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá)分別以0、0.8、1.6和3.2 μmol·L-1的胡桃醌刺激細(xì)胞24 h后，收集細(xì)胞總蛋白，SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)印到NC膜上，用含5%脫脂奶粉的封閉液常溫封閉1 h，加入一抗，4℃反應(yīng)過(guò)夜，再用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫下反應(yīng)0.5 h，化學(xué)發(fā)光法顯影；利用Image J軟件對(duì)目的條帶進(jìn)行灰度值檢測(cè)，以actin為內(nèi)參照分析蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK檢驗(yàn)。檢測(cè)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 胡桃醌對(duì)U-87 MG細(xì)胞增殖抑制作用胡桃醌處理U-87 MG細(xì)胞48 h后采用MTT法檢測(cè)各組吸光度，計(jì)算胡桃醌對(duì)U-87 MG細(xì)胞的增殖抑制率。如圖1所示，與0 μmol·L-1組比較，15.63、31.25、62.5、125和250 μmol·L-1胡桃醌組U-87 MG細(xì)胞生存率明顯降低，細(xì)胞增殖抑制率隨濃度升高明顯增加，分別為7.46%±2.96%、24.95%± 3.33%、39.90%±2.67%、57.44%±1.89%和99.49%±

0.81%，提示當(dāng)胡桃醌濃度低于15.6μmol·L-1時(shí)其對(duì)U-87 MG細(xì)胞的增殖抑制作用弱，隨著胡桃醌濃度增加，其對(duì)U-87 MG細(xì)胞的增殖抑制作用逐漸增高。胡桃醌作用48 h的IC50值為（78.45± 12.99）μmol·L-1。

2.2 胡桃醌可抑制U-87 MG細(xì)胞的遷移能力 選取胡桃醌作用48 h的IC50值的1/25為考察其對(duì)U-87 MG細(xì)胞的遷移能力影響作用的最大濃度值，此濃度下胡桃醌作用48 h不會(huì)對(duì)U-87 MG細(xì)胞增殖產(chǎn)生影響。劃痕實(shí)驗(yàn)后分別于0 h和48 h時(shí)在倒置光學(xué)顯微鏡下觀察并測(cè)量劃痕傷口的寬度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2和表1所示：劃痕后48 h，各組創(chuàng)面愈合率隨胡桃醌濃度增加逐漸降低，0 μmol·L-1組為92.91%±1.41%、0.8 μmol· L-1組為87.46%±6.14%、1.6 μmol·L-1組為46.04%± 6.25%、3.2 μmol·L-1組為30.05%±13.35%。 與0 μmol·L-1組相比，1.6μmol·L-1和3.2 μmol·L-1胡桃醌組U-87 MG細(xì)胞的創(chuàng)面愈合率明顯下降（F= 44.53，P＜0.05），表明U-87 MG細(xì)胞的遷移能力隨著胡桃醌濃度的增高而降低。

2.3 胡桃醌可抑制U-87 MG細(xì)胞的侵襲能力采用Transwell小室法檢測(cè)胡桃醌對(duì)U-87 MG細(xì)胞侵襲能力的影響，結(jié)果如圖2和表1所示：加入0、 0.8、1.6和3.2 μmol·L-1胡桃醌組中穿過(guò)基膜的細(xì)胞數(shù)分別為（204.67±6.11）個(gè)、（192.00±12.17）個(gè)、（103.67±5.69）個(gè)和（77.33±7.77）個(gè)。與0 μmol·L-1組相比1.6 μml·L-1和3.2 μml·L-1胡桃醌組小室濾膜下表面的細(xì)胞個(gè)數(shù)明顯減少（F=173.45，P＜0.05），表明U-87 MG細(xì)胞的侵襲能力隨著胡桃醌濃度的增高而降低。

2.4 胡桃醌抑制U-87 MG細(xì)胞中β-catenin、VEGF、MMP-2和MMP-9的蛋白表達(dá)胡桃醌處理U-87 MG細(xì)胞后，western blot法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)β-catenin、VEGF、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果如圖3和表2所示：給予U-87 MG細(xì)胞0、0.8、1.6和3.2 μmol·L-1胡桃醌作用24 h后，與0 μmol·L-1組相比，1.6 μmol·L-1和3.2 μmol·L-1胡桃醌組細(xì)胞內(nèi)β-catenin（F=17.24）、VEGF（F= 33.76）、MMP-2（F=10.907）和MMP-9（F=354.79），的蛋白表達(dá)都明顯降低（P＜0.05），并且具有濃度依賴(lài)性。

表1 胡桃醌對(duì)U-87 MG細(xì)胞的遷移、侵襲能力的影響

表2 胡桃醌對(duì)膠質(zhì)瘤U-87 MG細(xì)胞β-catenin、VEGF、MMP-2和MMP-9蛋白相對(duì)表達(dá)的影響（±s，n=5）

表2 胡桃醌對(duì)膠質(zhì)瘤U-87 MG細(xì)胞β-catenin、VEGF、MMP-2和MMP-9蛋白相對(duì)表達(dá)的影響（±s，n=5）

1)與0μmol·L-1組比較，單因素方差分析，P＜0.05

胡桃醌（μmol·L-1）0 0.8 1.6 3.2 n 5 5 5 5 β-catenin 0.68±0.03 0.61±0.201)0.46±0.281)0.22±0.131)VEGF 0.73±0.42 0.47±0.15 0.44±0.171)0.31±0.091)MMP-2 0.70±0.34 0.56±0.09 0.53±0.061)0.32±0.011)MMP-9 1.79±0.13 1.71±0.07 0.50±0.131)0.28±0.071)

圖2 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)各組細(xì)胞侵襲能力（×100）和遷移能力（×40）

圖3 western blot法檢測(cè)加入胡桃醌24 h后細(xì)胞內(nèi)β-catenin、VEGF、MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)

3 討論

胡桃醌存在于胡桃科植物的所有部分，在我國(guó)胡桃科植物資源豐富，因此胡桃醌作為抗腫瘤活性單體具有較大的開(kāi)發(fā)潛力[4]。

膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和侵襲是膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)以及治療失敗的重要原因。Pin1在膠質(zhì)瘤的過(guò)量表達(dá)與腫瘤高轉(zhuǎn)移性有著密不可分的聯(lián)系。胡桃醌是Pin1的小分子抑制劑，本研究通過(guò)transwell侵襲實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)胡桃醌對(duì)膠質(zhì)瘤U-87 MG細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響，結(jié)果顯示較低濃度（1.6 μmol·L-1）胡桃醌即可明顯抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移、侵襲能力，并且由于此濃度遠(yuǎn)低于其產(chǎn)生較明顯抑制細(xì)胞增殖的濃度（15.63 μmol·L-1），證明其對(duì)細(xì)胞遷移和侵襲能力的抑制率高于生長(zhǎng)抑制率，說(shuō)明大量細(xì)胞在死亡之前就已經(jīng)喪失遷移、侵襲能力，因此胡桃醌在膠質(zhì)瘤惡性侵襲方面可能發(fā)揮有效的治療作用。

Pin1活性與Wnt信號(hào)途徑中的關(guān)鍵因子β-catenin功能有關(guān)，Pin1可上調(diào)細(xì)胞中β-catenin蛋白的水平并促進(jìn)其活性。β-catenin異常表達(dá)及活化可以導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲性增強(qiáng)[5]，故為了進(jìn)一步探討胡桃醌抑制膠質(zhì)瘤遷移、侵襲作用的分子機(jī)制，本研究選擇β-catenin為研究的切入點(diǎn)。本研究中western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，胡桃醌能顯著降低膠質(zhì)瘤U-87 MG細(xì)胞β-catenin蛋白表達(dá)，說(shuō)明胡桃醌抑制細(xì)胞的遷移和侵襲作用可能與其抑制Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路活性有關(guān)。

Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路可通過(guò)激活多種下游分子促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲，如MMP-2、MMP-9和VEGF蛋白。MMP-2、MMP-9是人體內(nèi)分布最廣泛的基質(zhì)金屬蛋白酶，體外研究顯示抑制MMP-2、MMP-9的活性可以阻滯膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移、侵襲[6,7]。VEGF具有通過(guò)活化多種蛋白酶降解周?chē)|(zhì)而促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的作用。已有多項(xiàng)研究表明Wnt/β-catenin信號(hào)通路活化可提高M(jìn)MP-2、MMP-9和VEGF表達(dá)[8-9]。為進(jìn)一步研究

胡桃醌對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路活性的抑制作用與其抑制細(xì)胞的遷移和侵襲作用相關(guān)性，本研究以western blot法檢測(cè)胡桃醌對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路下游與腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移關(guān)系密切的MMP-2、MMP-9和VEGF蛋白表達(dá)水平的影響，研究結(jié)果顯示胡桃醌能顯著降低膠質(zhì)瘤U-87 MG細(xì)胞MMP-2、MMP-9和VEGF蛋白表達(dá)水平，提示胡桃醌抑制細(xì)胞的遷移和侵襲作用可能與其抑制Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路活性進(jìn)而下調(diào)其下游MMP-2、MMP-9和VEGF的蛋白表達(dá)有關(guān)。

綜上，本研究表明胡桃醌可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U-87 MG遷移、侵襲能力，其作用機(jī)制與通過(guò)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路活性進(jìn)而下調(diào)其下游腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲相關(guān)的重要調(diào)節(jié)因子MMP-2、MMP-9和VEGF的蛋白表達(dá)相關(guān)。

[1]Zhang W，Liu A，Li Y，et al.Anticancer activity and mecha?nism of juglone on human cervical carcinoma HeLa cells[J]．Can J Physiol Pharmacol，2012，90（11）：1553-1558．

[2]Xu HL，Yu XF，Qu SC，et al.Juglone，from Juglans mand?shruica Maxim，inhibits growth and induces apoptosis in hu?man leukemia cell HL-60 through a reactive oxygen species-de?pendent mechanism[J]．Food Chem Toxicol，2012，50（3-4）：590-596．

[3]劉志峰，楊學(xué)軍，劉彬，等.Arp2/3復(fù)合物表達(dá)沉默對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲和遷移的影響[J]．中國(guó)神經(jīng)精神疾病雜志，2013，39（3）：129-131．

[4]Vardhini SR.Exploring the antiviral activity of juglone by com?putational method[J].J Recept Signal Transduct Res，2014，5（20）：1-2．

[5]Torre C，Benhamouche S，Mitchell C，et al． The transform?ing growth factor-α and cyclin D1 genes are direct targets of β-catenin signaling in hepatocyte proliferation[J].J Hepatol，2011，55（1）：86-95．

[6]Liska V，Sutnar A，Jr LH，et al． Matrix metalloproteinases and their inhibitors in correlation to proliferative and classical tumour markers during surgical therapy of colorectal liver metas?tases[J]．Bratisl Lek Listy，2012，113（2）：108-113．

[7]Klotzsche-von Ameln A，Muschter A，Heimesaat MM，et al．HIF prolylhydroxylase-2 inhibition diminishes tumor growth through matrix metalloproteinase-induced TGFβ activation[J]. Cancer Biol Ther，2012，13（4）：216-223．

[8]Liu D，Guo H，Li Y，et al.Association between polymor?phisms in the promoter regions of matrix metalloproteinases（MMPs）and risk of cancer metastasis：a meta-analysis[J]. PLoS one，2012，7（2）：e31251．

[9]劉宣，王炎，李丹光，等.丹參酮ⅡA對(duì)COX-2激活Wnt/ β-catenin信號(hào)通路介導(dǎo)的人腸癌細(xì)胞VEGF表達(dá)的調(diào)控作用[J].中華中醫(yī)藥雜志，2013，28（1）：108-112．

Inhibitory effect of juglone on migration and invasion of glioma cell line U-87 MG.

YANG Dan，WANG Li，LIZhu，LIU Zhaoyang，SUN Yan，GUO Li，F(xiàn)U Jia，QI Rong，WANG Junping.Department of Pharmacology,Shenyang Medi?cal College,No.146,North Huanghe Street,Huanggu District,Shenyang 110034,China.Tel：024-62215689.

ObjectiveTo investigate the effects and mechanisms of pin1(peptidyl-prolyl isomerase 1)inhibitor ju?glone on migration and invasion in glioma cell line U-87 MG.MethodsGlioma cells were treated with juglone at 0,0.8, 1.6 and 3.2 μmol·L-1.Wound-healing assay and invasion assay were performed to examine the inhibitory activity of ju?glone on glioma cell line U-87 MG.Western blot was used to analyze the protein expression of β-catenin,VEGF, MMP-2 and MMP-9.ResultsThe wound-healing assay showed that the wound-healing rate in juglone-treated groups was 46.04%±6.25%and 30.05%±13.35%at concentrations of 1.6 μmol·L-1and 3.2 μmol·L-1,repectively.Juglone treat?ment significantly reduced the wound-healing rate compared with controls(P＜0.05).Transwell invasion assay showed that the number of invaded cells in juglone-treated groups was 103.67±5.69 and 77.33±7.77 at the concentrations of 1.6 μmol·L-1and 3.2 μmol·L-1,respectively.Juglone treatment significantly reduced cell invasion compared with con?trols(P＜0.05).Treatment with juglone significantly down-regulated the expression levels of β-catenin,VEGF,MMP-2 and MMP-9 in U-87 MG cells in a dose-dependent manner.ConclusionThe present data suggests that juglone has a

Juglone Glioma β-catenin VEGF MMP-2 MMP-9

R979.1

A

2015-01-14）

（責(zé)任編輯:甘章平）

10.3936/j.issn.1002-0152.2015.04.010

☆ 沈陽(yáng)市科技計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：F10-191-8-00）

* 沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室（沈陽(yáng) 110034）

** 沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心

significant inhibitory action on cell migration and invasion through down-regulation of the β-catenin and its downstream VEGF,MMP-2 and MMP-9 protein expressions in glioma cell line U-87 MG.