電致化學(xué)發(fā)光適體傳感器的研究進(jìn)展

歸國風(fēng)，宋 鵬

（貴州工程應(yīng)用技術(shù)學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，貴州畢節(jié)551700）

電致化學(xué)發(fā)光適體傳感器的研究進(jìn)展

歸國風(fēng)*，宋 鵬

（貴州工程應(yīng)用技術(shù)學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，貴州畢節(jié)551700）

適體是一類體外篩選的RNA或DNA寡核苷酸片段，其可與目標(biāo)分子高效、高特異性親合。與抗體相比，適體具有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)-耙分子范圍廣，適體可以與低分子量的有機(jī)或無機(jī)物質(zhì)以及大分子（如酶、蛋白質(zhì)）等多種目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行特異性結(jié)合。該文基于電致化學(xué)發(fā)光適體傳感器的近期進(jìn)展作簡要評述，包括適體概述以及幾大類電化學(xué)適體傳感器的構(gòu)造、方法原理等內(nèi)容。

適體；傳感器；電致化學(xué)發(fā)光檢測；識別分子

0 引言

電致化學(xué)發(fā)光（ECL），也稱之為電化學(xué)發(fā)光，是將化學(xué)發(fā)光技術(shù)和電化學(xué)技術(shù)結(jié)合起來構(gòu)建的一種分析方法。通過電化學(xué)的方法在電極表面生產(chǎn)了一些特殊的物質(zhì)，這些物質(zhì)之間或與其他組分之間通過電子傳遞形成激發(fā)態(tài)，當(dāng)激發(fā)態(tài)物質(zhì)回到穩(wěn)定的基態(tài)時，伴隨著產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光[1-2]。在某種程度上講，電致化學(xué)發(fā)光類似于光激發(fā)，比如熒光，但又具有熒光不具備的優(yōu)點(diǎn)，不需要光源，可以避免光散射和雜質(zhì)的發(fā)光干擾。電致化學(xué)發(fā)光技術(shù)是電化學(xué)與化學(xué)發(fā)光的結(jié)合，其既集成了發(fā)光與電化學(xué)分析技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，又結(jié)合二者產(chǎn)生了新的優(yōu)勢[3]，具有靈敏度高，操作簡便，易于控制，重現(xiàn)性和選擇性好等優(yōu)點(diǎn)[4-5]。

適體是從核酸文庫中篩選出來的與配體具有高效和專一結(jié)合的DNA或RNA片段[6-7]。這些寡核苷酸片段通常是一段長度為25~80個堿基的單鏈寡核苷酸，不同的適體其可以與蛋白質(zhì)、有機(jī)物、小分子、金屬離子、多肽等各種配體具有特異性結(jié)合能力[8-10]。近幾年來，以適體作為識別元件構(gòu)建的電致化學(xué)發(fā)光適體傳感器受到廣大研究者的關(guān)注[11-12]。篩選出來的不同的核酸適體對某種多肽、蛋白、金屬或者有機(jī)物具有高特異性和高親和性的結(jié)合特性。將適體作為電致化學(xué)發(fā)光傳感器的分子識別元件，與其它分子識別元件相比具有以下的優(yōu)點(diǎn)[13-14]：(1)與目標(biāo)物結(jié)合具有高的特異性和親和性。適體只能識別與其互補(bǔ)的分子結(jié)構(gòu)，從而避免非特異性結(jié)合；(2)體外篩選，具有可修飾性：適體的篩選過程不依

賴于動物或細(xì)胞培養(yǎng)，是通過SELEX技術(shù)進(jìn)行體外篩選產(chǎn)生的，具有簡單、快速和低成本的優(yōu)勢，此外，適體作為一段核苷酸片段，在不影響其生物活性的情況下方便對其兩端進(jìn)行修飾，如巰基、生物素、氨基等基團(tuán)，也可修飾一些電活性物質(zhì)、光活性物質(zhì)或酶等，修飾后的適體更利于目標(biāo)物的檢測；(3)靶分子范圍廣：適體不僅可以作用于蛋白質(zhì)與核酸，還適用于酶、細(xì)胞粘附分子、病毒顆粒、生長因子、抗體、病原菌等生物大分子，也可以用來檢測小分子目標(biāo)物如金屬離子、有機(jī)染料、氨基酸、藥物、抗生素、核苷酸、生物輔因子等；(4)穩(wěn)定性好，可反復(fù)變性、復(fù)性，利于長期保存：抗體的蛋白質(zhì)本質(zhì)決定了它容易變性，保存時間短，而核酸適體凍成干粉后可以在室溫下保存數(shù)年。與抗體相比，適體具有更好的穩(wěn)定性和選擇性。

該文主要介紹電致化學(xué)發(fā)光適體傳感器，根據(jù)不同電致化學(xué)發(fā)光適體傳感器的構(gòu)造、工作原理等內(nèi)容進(jìn)行全面的評述。

1 根據(jù)電致化學(xué)發(fā)光適體傳感器的構(gòu)建原理分類

圖1 單鏈核酸構(gòu)建的電致化學(xué)發(fā)光適體傳感器原理示意圖[15]Fig.1 Schematic diagram of the principle for a single-strand based electrochemiluminescence aptasensor. Copyright 2008 Elesive

按照電致化學(xué)發(fā)光適體傳感器的構(gòu)建原理，將其分為三類：以單鏈核酸適體構(gòu)建的電致化學(xué)發(fā)光適體傳感器、以適體及其互補(bǔ)鏈共同構(gòu)建的電致化學(xué)發(fā)光適體傳感器、以兩條單鏈核酸適體構(gòu)建的夾心型電致化學(xué)發(fā)光適體傳感器。

1.1 以單鏈核酸適體構(gòu)建的電致化學(xué)發(fā)光適體傳感器

單鏈核酸適體構(gòu)建的電致化學(xué)發(fā)光適體傳感器是將單鏈的核酸適體固載到電極表面，目標(biāo)物與核酸適體直接結(jié)合，通過檢測目標(biāo)物與核酸適體結(jié)合前后電極表面的電致化學(xué)發(fā)光信號的變化來直接對目標(biāo)物進(jìn)行檢測。Chen等[15]報(bào)道了一種利用標(biāo)記有[Ru(bpy)3]2+的環(huán)糊精主客體識別作用結(jié)合適體構(gòu)建的電致化學(xué)發(fā)光適體傳感器用于檢測三磷酸腺苷的方法，如圖1所示，用電聚合的方法先將鄰氨基苯甲酸聚合在玻碳電極表面，然后用N-羥基琥珀酰亞胺和N-(3-二甲基氨基丙基)-N-乙烯碳二亞胺-鹽酸鹽作為交聯(lián)劑將5端帶–NH的適體連在電極上，通過主客體識別作用可以將標(biāo)記了[Ru(bpy)3]2+的環(huán)糊精修飾在電極上，得到了很強(qiáng)的電致化學(xué)發(fā)光信號。當(dāng)有三磷酸腺苷存在時，由于適體的特異性識別作用，會優(yōu)先和目標(biāo)物結(jié)合，從而減少了標(biāo)記了[Ru(bpy)3]2+環(huán)糊精的量，得到了較低的信號。

結(jié)合前后電致化學(xué)發(fā)光信號的減小值就可以完成對目標(biāo)分析物三磷酸腺苷的定量檢測。這類傳感器的優(yōu)點(diǎn)是構(gòu)建過程簡單，便于實(shí)時監(jiān)測。

1.2 以適體及其互補(bǔ)鏈共同構(gòu)建的電致化學(xué)發(fā)光適體傳感器

適體及其互補(bǔ)鏈共同構(gòu)建的電致化學(xué)發(fā)光適體傳感器是將標(biāo)記有發(fā)光試劑或者猝滅劑探針的適體及其互補(bǔ)鏈形成的雙鏈結(jié)構(gòu)固載到電極表面，此時獲得一個確定的電致化學(xué)發(fā)光信號，當(dāng)適體與目標(biāo)物結(jié)合后，雙鏈中的適體或其互補(bǔ)鏈部分或完全脫離電極表面，從而引起原有的電致化學(xué)發(fā)光信號的改變，通過檢測電極表面電致化學(xué)發(fā)光信號的變化值來實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)物的檢測。

Zhang等[16]首先將發(fā)光物質(zhì)聯(lián)吡啶釕修飾在納米金上，將復(fù)合物修飾到金電極表面，通過Au-S鍵將捕獲探針修飾在電極表面，當(dāng)15-堿基對的凝血酶適體和標(biāo)記有二茂鐵的DNA短鏈存在時，在電極表面3條DNA鏈可以形成一個“Y”結(jié)構(gòu)的DNA雜交鏈，由于二茂鐵對釕的發(fā)光有猝滅作用，得到一個低的電化學(xué)信號。當(dāng)目標(biāo)物凝血酶存在時，其與適體特異性結(jié)合，破壞了“Y”結(jié)構(gòu)的DNA雜交鏈，使得標(biāo)記了二茂鐵的短鏈從電極表面脫離，使電致化學(xué)發(fā)光信號增加，根據(jù)電致化學(xué)發(fā)光信號的變化值就可以完成對目標(biāo)物凝血酶的定量檢測(圖2)。

圖2 適體及其互補(bǔ)鏈構(gòu)建的電致化學(xué)發(fā)光適體傳感器原理示意圖[16]Fig.2 Schematic diagram of the principle for a double-strand based electrochemiluminescence aptasensor. Copyright 2011 Elesive

1.3 夾心型電致化學(xué)發(fā)光適體傳感器

兩條單鏈核酸適體構(gòu)建的電致化學(xué)發(fā)光適體傳感器是基于固載適體—目標(biāo)檢測物—標(biāo)記適體的“三明治”模型構(gòu)建的，主要適用于表面至少具有兩個適體結(jié)合位點(diǎn)的目標(biāo)物的檢測。首先將其中一條適體作為捕獲探針固定到電極表面，當(dāng)其與目標(biāo)分析物結(jié)合后，再將另一條標(biāo)記有發(fā)光物質(zhì)、納米粒子、猝滅劑或共反應(yīng)試劑等的檢測適體與電極表面的目標(biāo)檢測物進(jìn)行結(jié)合，形成捕獲適體-目標(biāo)檢測物-標(biāo)記適體的夾心結(jié)構(gòu)。通過標(biāo)記適體所引起的電致化學(xué)發(fā)光信號的改變來實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)分析物的檢測。Hong等[17]用丙烯酸、Ru(bpy)3Cl26H2O和聚乙烯亞胺聚合反應(yīng)得到一種聚合物作為電極的基底，得到一個強(qiáng)的電致化學(xué)發(fā)光信號，然后滴加納米金作為適體1的捕獲探針，與目標(biāo)分析物凝血酶發(fā)生特異性識別后，再與hemin/TBA 2/Au@CeO2適體2結(jié)合形成夾心結(jié)構(gòu)。由于hemin和CeO2對Ru的發(fā)光具有猝滅作用，其修飾量隨著凝血酶濃度的增加而增加，從而致使傳感器的電致化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度隨之降低，從而實(shí)現(xiàn)對凝血酶濃度的檢測(圖3)。這類傳感器檢測靈敏度較高，具有很強(qiáng)的抗干擾能力。

2 根據(jù)傳感器構(gòu)建過程中適體是否被標(biāo)記進(jìn)行分類

在傳感器的構(gòu)建過程中，根據(jù)傳感器的構(gòu)建需求對適體是否需要標(biāo)記活性物質(zhì)有不同的要求，從而將電致化學(xué)發(fā)光適體傳感器分為免標(biāo)記型和標(biāo)記型兩類：

圖3 夾心型電致化學(xué)發(fā)光適體傳感器的原理示意圖[17]Fig.3 Schematic diagram of the principle for a double-strand based electrochemiluminescence aptasensor. Copyright 2008 ACS

2.1 免標(biāo)記型電致化學(xué)發(fā)光適體傳感器

免標(biāo)記型電致化學(xué)發(fā)光適體傳感器不需要對適體進(jìn)行標(biāo)記，可以直接根據(jù)適體與目標(biāo)檢測物結(jié)合前后所引起的電致化學(xué)發(fā)光信號的改變來進(jìn)行檢測。對于免標(biāo)記的傳感器來說，根據(jù)發(fā)光試劑的存在形式又有兩種分類：一種是通過靜電吸附作用將發(fā)光試劑直接吸附在適體鏈上；一種是將發(fā)光試劑直接修飾在電極表面。

將發(fā)光試劑通過靜電吸附直接修飾到核苷酸鏈上。Li等[18]將巰基端的凝血酶適體鏈固定到金電極表面，通過靜電吸附作用與發(fā)光試劑[Ru(bpy)3]2+作用，將發(fā)光試劑修飾到凝血酶適體上，獲得一個可檢測的電致化學(xué)發(fā)光信號，當(dāng)目標(biāo)分析物凝血酶存在時，與凝血酶結(jié)合后，目標(biāo)物與適體結(jié)合脫離電極表面，使得電極表面[Ru(bpy)3]2+的量減少，發(fā)光信號減小，通過電化學(xué)信號的減少值就可以對凝血酶定量檢測 (圖4)。Jin等[19]基于樹枝狀滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)構(gòu)建了一個凝血酶適體傳感器。該傳感器先用一個單鏈DNA固載到金電極上，然后雜交凝血酶適體，使適體也固定在電極表面，當(dāng)凝血酶存在時，適體-凝血酶結(jié)合脫離電極表面。此時，在大腸桿菌DNA的作用下，電極表面裸露的單鏈DNA與掛鎖探針雜交環(huán)化。隨后，掛鎖探針擔(dān)任樹枝狀滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)的引發(fā)模板，和大量的雙鏈DNA在電極表面雜交成樹枝狀。Ru(phen)32+(作為電致化學(xué)發(fā)光信號探針)嵌入雙鏈DNA(dsDNA)的凹槽中，以產(chǎn)生電致化學(xué)發(fā)光信號，實(shí)現(xiàn)了對目標(biāo)物的檢測。

圖4 發(fā)光試劑吸附在適體鏈上的免標(biāo)記型電致化學(xué)發(fā)光適體傳感器的原理示意圖[18]Fig.4 Schematic diagram of the principle for a label-free electrochemiluminescence aptasensor with luminescent substance adsorption on aptamer.Copyright 2011 Elesive

將發(fā)光試劑直接修飾在電極表面。Dang等[20]通過將發(fā)光試劑[Ru(bpy)3]2+摻雜在殼聚糖和二氧化硅復(fù)合納米材料中，然后用修飾了Nafion的玻碳電極吸附含有發(fā)光試劑的復(fù)合納米材料，再

將富含G-結(jié)構(gòu)的DNA適體鏈修飾在電極表面，這時電極可以顯示比較高的發(fā)光信號。當(dāng)檢測物K+存在時，適體與目標(biāo)物形成G-四分體結(jié)構(gòu)，從而得到了低的發(fā)光信號(圖5)。這類發(fā)光試劑直接修飾在電極表面的電致化學(xué)發(fā)光適體傳感器具有無需標(biāo)記、穩(wěn)定性好、操作簡單、成本低且不損傷適體的活性等優(yōu)點(diǎn)，但是檢測的靈敏度相對比較低。

圖5 發(fā)光試劑修飾在電極表面的免標(biāo)記型電致化學(xué)發(fā)光適體傳感器的原理示意圖[20]Fig.5 Schematic diagram of the principle for a label-free electrochemiluminescence aptasensor with[Ru(bpy)3]2+modified on the electrode surface.Copyright 2014 ACS

2.2 標(biāo)記型電化學(xué)適體傳感器

標(biāo)記型電化學(xué)適體傳感器通常是用共價(jià)鍵將發(fā)光試劑(如釕配合物、魯米諾)、納米粒子(如量子點(diǎn)、納米金、納米鉑等)、共反應(yīng)試劑、發(fā)光試劑猝滅劑等與適體標(biāo)記起來[21-22]，然后根據(jù)被標(biāo)記的適體與目標(biāo)分析物特異性結(jié)合前后所產(chǎn)生的電致化學(xué)發(fā)光信號的改變來實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)物濃度的定量檢測。這類方法受到廣大的關(guān)注。標(biāo)記方法可以直接在篩選適體時標(biāo)記，也可以用各種納米材料做媒介將適體與其他物質(zhì)標(biāo)記在一起。Gan等[23]將Ru-Pt復(fù)合納米材料修飾在電極基底，然后將一段共反應(yīng)試劑4-(二甲基氨基)丁酸標(biāo)記的適體修飾到金電極表面，在沒有目標(biāo)物茶樹堿分子存在時，共反應(yīng)試劑4-(二甲基氨基)丁酸的存在可以增強(qiáng)釕的發(fā)光，從而得到強(qiáng)的電致化學(xué)發(fā)光信號，當(dāng)凝血酶與其適體特異性結(jié)合后，共反應(yīng)試劑4-(二甲基氨基)丁酸標(biāo)記的適體脫離電極，從而減低了發(fā)光信號(圖6)。

3 根據(jù)適體與目標(biāo)分析物結(jié)合前后信號的變化分類

電致化學(xué)發(fā)光適體傳感器按照適體與目標(biāo)分析物特異性識別前后電致化學(xué)發(fā)光信號的改變可以分為信號衰減 (signal-off)型和信號增強(qiáng)(signal-on)型兩類：

3.1 Signal-off型電致化學(xué)發(fā)光適體傳感器

Signal-off型電致化學(xué)發(fā)光適體傳感器是以目標(biāo)分析物與適體結(jié)合后所導(dǎo)致的傳感器電致化學(xué)發(fā)光信號的衰減程度作為定量分析的信號。Yu等[24]通過DNA互補(bǔ)方法用凝血酶適體的互補(bǔ)鏈將適體固定于電極表面，再與凝血酶結(jié)合，沒有結(jié)合的凝血酶適體與N-(氨基乙基)-N-(乙基異魯米諾)可以產(chǎn)生一個電致化學(xué)發(fā)光信號，并且這個信號隨著凝血酶量的增加而遞減。Liu等[25]利用多巴胺黑色素納米球作為信號放大標(biāo)簽，作為發(fā)光試劑[Ru(bpy)3]2+的載體，將其修飾在電極上制備了一種signal-off型電致化學(xué)發(fā)光適體傳感器，首先將納米復(fù)合物通過自組裝修飾到玻碳電極表面，然后吸附一層納米金在電極上，利用Au-S鍵將凝血酶適體修飾到電極上，當(dāng)目標(biāo)物與對應(yīng)的適體特異性結(jié)合后，由于目標(biāo)蛋白對于電子傳遞的阻礙作用，使得發(fā)光響應(yīng)信號減小(圖7)。從而成功制得了signal-off型電化學(xué)適體傳感器。這類電致化學(xué)發(fā)光適體傳感器是根據(jù)適體與目標(biāo)分析物結(jié)合后導(dǎo)致發(fā)光信號降低來完成對目標(biāo)分析物的定量檢測。該方法本身有

一定的局限性，由于信號是降低的，所以需要有較大的背景信號，容易受其他干擾物質(zhì)的影響產(chǎn)生的“假信號”與目標(biāo)物所產(chǎn)生的信號不容易區(qū)別，從而限制了傳感器的靈敏度。

圖6 標(biāo)記型電致化學(xué)發(fā)光適體傳感器的原理示意圖[23]Fig.6 Schematic diagram of the principle for the coreactant-labeled electrochemiluminescence aptasensor. Copyright 2012 Elesive

圖7 信號衰減型電致化學(xué)發(fā)光適體傳感器的原理示意圖[25]Fig.7 Schematic diagram of the principle for the signal-off electrochemiluminescence aptasensor.Copyright 2014 Elesive

3.2 Signal-on型電致化學(xué)發(fā)光適體傳感器

Signal-on型電致化學(xué)發(fā)光適體傳感器是以目標(biāo)分析物與適體結(jié)合后所導(dǎo)致的電致化學(xué)發(fā)光信號的增強(qiáng)程度作為定量分析的依據(jù)。該方法克服了signal-off型電致化學(xué)發(fā)光適體傳感器的背景信號高、假信號等缺點(diǎn)，能夠準(zhǔn)確、快速的實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物分析，提高檢測對象的靈敏度。Su等[26]將金合石墨烯復(fù)合物固定到玻碳電極表面，然后將刀豆A修飾到電極表面用來捕獲MCF-7癌細(xì)胞，MUCI適體標(biāo)記在有碳量子點(diǎn)的多空硅納米球上，當(dāng)MUCI適體與MCF-7癌細(xì)胞作用后，將發(fā)光試劑碳量子點(diǎn)固載在電極表面，MCF-7癌細(xì)

胞的濃度的越大，結(jié)合到電極表面的碳量子點(diǎn)標(biāo)記的MUCI適體越多，電致化學(xué)發(fā)光信號增強(qiáng)，從而成功構(gòu)建了一種signal-on型電致化學(xué)發(fā)光適體傳感器(圖8)。

圖8 信號增強(qiáng)型電致化學(xué)發(fā)光適體傳感器的原理示意圖[26]Fig.8 Schematic diagram of the principle for the signal-on electrochemiluminescence aptasensor.Copyright 2014 Elesive

4 展望

近年來，電致化學(xué)發(fā)光適體傳感器的研究得到了飛速的發(fā)展，在電致化學(xué)發(fā)光適體傳感器的設(shè)計(jì)、分析特性如靈敏度、線性范圍和穩(wěn)定性的改善，以及應(yīng)用范圍等研究方面取得了顯著的進(jìn)展。目前，電致化學(xué)發(fā)光適體傳感器的研究仍然是一個十分活躍的研究領(lǐng)域。尋找新的目標(biāo)物適體、設(shè)計(jì)新穎的傳感器模式以及進(jìn)一步提高電致化學(xué)發(fā)光適體傳感器的靈敏度和穩(wěn)定性，尤其是在臨床醫(yī)學(xué)診斷和藥物篩選上的實(shí)際應(yīng)用等方面的研究更是目前電致化學(xué)發(fā)光適體傳感器發(fā)展的方向。

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Electrochemiluminescence aptasensors-recent achievements

Gui Guo-feng*,Song Peng
(College of Chemistry and Chemical Engineering,Guizhou University of Engineering Science,Bijie 551700,China)

Aptamers are DNA or RNA oligonucleotides selected in vitro that can bind their target with high affinity and high specificity.Their specificity is comparable and in certain case even higher than those of antibodies. Aptamers can selectively bind to low-molecular-weight organic or inorganic substrates or to macromolecules such as proteins.In this view,we briefly summarize the recent progress of electrochemiluminescence aptasensors,involving introduction of aptamer and the main aptasensors about their configuration and some detection technologies.

aptamers;sensors;electrochemiluminescence;recognition molecules

貴州省教育廳自然科學(xué)重點(diǎn)項(xiàng)目（黔教合KY字[2015]388）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)（XDJK2014C001）；貴州省教育廳自然科學(xué)青年項(xiàng)目（黔教合KY字[2015]450）；貴州省煤基新材料工程中心（黔教合KY字[2012]026號）

*通信聯(lián)系人，E-mail：ggfok@21cn.com