溫控輔助離子液體分散液液微萃取-高效液相色譜檢測(cè)果汁中殺菌劑殘留

張 琰，趙其陽(yáng)，張耀海,5，焦必寧,3,4,5,*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所/西南大學(xué)柑桔研究所，重慶 400712；2.西南大學(xué)園藝園林學(xué)院，重慶 400715；3.農(nóng)業(yè)部柑橘產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室，重慶 400712；4.農(nóng)業(yè)部柑桔及苗木質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，重慶 400712；5.國(guó)家柑桔工程技術(shù)研究中心，重慶 400712）

殺菌劑廣泛用于防治作物、蔬菜和水果種植和采后貯運(yùn)銷過程中由病原微生物引起的植物病害。目前常用有機(jī)殺菌劑種類主要有酰胺類、三唑類、咪唑類、甲氧基丙烯酸酯類、嘧啶類、抗生素類等。如新型殺菌劑嘧菌酯和咯菌腈分屬甲氧基丙烯酸酯類和吡咯類，三唑酮、氯苯嘧啶醇、嘧菌環(huán)胺、咪鮮胺和烯唑醇涵蓋三唑類、嘧啶類和咪唑類。這5 類殺菌劑在蘋果、梨、葡萄、柑橘等果樹中主要用于防治由子囊菌亞門和擔(dān)子菌亞門真菌引起的植物病害，如白粉病、黑星病、銹病、黑粉病等。隨著這些殺菌劑的廣泛使用及新型復(fù)配藥劑的問世，其在世界農(nóng)藥市場(chǎng)的領(lǐng)域逐步擴(kuò)大，也帶來了由于農(nóng)藥不合理使用引起的一系列危害，造成果蔬及相關(guān)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留超標(biāo)，威脅人類健康及環(huán)境安全[1-2]。為此，食品法典委員會(huì)（Codex Alimentarius Commission，CAC）、歐盟（European Union Legislation，EU）及各國(guó)政府都制定了更為嚴(yán)格的農(nóng)藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)，其中GB 2763—2014《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》[3]規(guī)定嘧菌酯在柑橘中最大殘留限量（maximum residue limit，MRL）為1 mg/kg，在葡萄中為5 mg/kg；三唑酮在柑橘和蘋果中MRL為1 mg/kg，在梨中為0.5 mg/kg；氯苯嘧啶醇在蘋果、梨和葡萄中MRL為0.3 mg/kg，在桃中為0.5 mg/kg；嘧菌環(huán)胺在梨中MRL為1 mg/kg；咪鮮胺在柑橘類水果中MRL為10 mg/kg，柑橘中為5 mg/kg，在蘋果和葡萄中為2 mg/kg；烯唑醇在柑橘中MRL為1 mg/kg，在蘋果和葡萄中為0.2 mg/kg，梨中為0.1 mg/kg，但均未針對(duì)果汁飲料產(chǎn)品制定其最大殘留限量。因此，亟需建立更簡(jiǎn)單、快速、高效、靈敏的農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法。

檢測(cè)殺菌劑殘留的方法主要有高效液相色譜法[4]、氣相色譜法[5]和色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)[6-7]。樣品前處理在農(nóng)藥殘留分析檢測(cè)中起到關(guān)鍵作用，傳統(tǒng)的前處理方法如液液萃?。╨iquid-liquid extraction，LLE）和固相萃取等，需消耗大量有毒試劑、操作繁瑣、處理時(shí)間長(zhǎng)且成本高。近年來一些微型化樣品前處理方法被成功應(yīng)用于食品或環(huán)境中農(nóng)藥殘留的檢測(cè)，如單滴微萃取[8]，該方法成本低，溶劑消耗少，但微滴不易控制，操作耗時(shí)；中空纖維液相微萃取[9]具有靈敏度高、選擇性好的優(yōu)點(diǎn)，但其較低的遷移速率導(dǎo)致操作耗時(shí)較長(zhǎng)；固相微萃取[10]由于其樣品用量少，使用方便、快捷已被廣泛應(yīng)用于環(huán)境及食品中農(nóng)藥殘留檢測(cè)，但目前可供其使用的固定相涂層種類不多，限制了該方法的應(yīng)用范圍及聯(lián)用技術(shù)；攪拌棒吸附萃取[11]是一種新型的固相微萃取技術(shù)，萃取容量高、固定相體積大，但涂層的制備和使用多需要手動(dòng)操作，對(duì)操作者技術(shù)水平要求高；超分子化學(xué)范疇的分子印跡技術(shù)[12]具有高親和性和選擇性，對(duì)惡劣環(huán)境的耐受能力強(qiáng)，越來越引起科研工作者的興趣，但是分子印跡聚合物的合成較為復(fù)雜且該方法多用于快速檢測(cè)。

本研究利用溫控輔助離子液體DLLME結(jié)合高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器（high performance liquid chromatography with photodiode array，HPLC-PDA）技術(shù)，建立了快速檢測(cè)多種果汁（蘋果汁、梨汁、葡萄汁、桃汁和橙汁）中嘧菌酯、咯菌腈、三唑酮、氯苯嘧啶醇、嘧菌環(huán)胺、咪鮮胺和烯唑醇7種常用殺菌劑殘留的方法。重點(diǎn)考察了影響離子液體分散液液微萃取的多種因素，如萃取劑、分散劑、溶解溫度、萃取時(shí)間和離心時(shí)間，并將此方法應(yīng)用于實(shí)際樣品測(cè)定，涵蓋了市場(chǎng)上主要果汁類型。本方法簡(jiǎn)便、快速、價(jià)格低廉、重復(fù)性良好，能夠滿足不同果汁中多種殺菌劑殘留同時(shí)快速檢測(cè)和確證的要求。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘋果汁、梨汁、葡萄汁、桃汁和橙汁購(gòu)買于重慶市超市。

1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽（[C4MIM][PF6]）（＞9 8%，CAS號(hào)：174501-64-5）、1-甲基-3-辛基咪唑六氟磷酸鹽（[C8MIM][PF6]）（＞98%，CAS號(hào)：304680-36-2）、1-己基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽（[C6MIM][PF6]）（≥98%，CAS號(hào)：304680-35-1） 上海安譜公司；甲醇、乙腈、丙酮（均為色譜純） 德國(guó)CNW Technologies有限公司；嘧菌酯（99.0%，CAS號(hào)：131860-33-8）、咯菌腈（98.5%，CAS號(hào)：131341-86-1）、氯苯嘧啶醇（99.0%，CAS號(hào)：60168-88-9）、嘧菌環(huán)胺（99.0%，CAS號(hào)：121552-61-2）、咪鮮胺（98.0%，CAS號(hào)：67747-09-5）、烯唑醇（99.0%，CAS號(hào)：76714-88-0）標(biāo)準(zhǔn)品 德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司；三唑酮（99.7%，CAS號(hào)：43121-43-3）標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)Sigma Alorich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

e2695高效液相色譜儀（配有PDA檢測(cè)器及Empower色譜工作站） 美國(guó)Waters公司；Milli-Q A10超純水器美國(guó)Millipore公司；CL31/CL31R多用途離心機(jī) 美國(guó)Termo Fisher公司；HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋 金南儀器制造有限公司；MDF-382E（N）超低溫冰箱 日本Sanyo公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取5.00 mg（精確至0.01 mg）嘧菌酯、咯菌腈、三唑酮、氯苯嘧啶醇、嘧菌環(huán)胺、咪鮮胺、烯唑醇標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并定容至50.00 mL，配成100 mg/L標(biāo)準(zhǔn)品母液，于－50℃避光低溫保存。臨用前，將100 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液放置室溫，用甲醇分別稀釋配成10 mg/L和1 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，保存于4℃冰箱。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

(3)檢測(cè)平道制動(dòng)距離。以不超載為基本前提，讓無軌膠輪車沿道路正常行駛，將車速控制為20 km/h，采取制動(dòng)之后用卷尺對(duì)制動(dòng)距離進(jìn)行測(cè)量，所得數(shù)值即平道制動(dòng)距離。

準(zhǔn)確移取適量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別用甲醇稀釋成一系列質(zhì)量濃度為0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)品工作溶液，在優(yōu)化后的方法條件下測(cè)定，以測(cè)得的各個(gè)殺菌劑積分峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（mg/L）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 前處理方法

果汁樣品（橙汁稀釋5倍，其他果汁不稀釋）于10 000 r/min離心5 min后，取5.00 mL加入到15 mL尖底具塞離心管中，加入50 μL質(zhì)量濃度為0.1 mg/L 7種殺菌劑標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后將含有60 μL[C6MIM][PF6]（萃取劑）的0.8 mL甲醇（分散劑）快速注入離心管中，快速振蕩、渦旋1 min形成乳濁體系，然后將離心管移至恒溫水浴鍋中以80℃加熱10 min，待離子液體完全溶解在水相中，迅速轉(zhuǎn)移至冰浴中萃取15 min，以4 000 r/min離心5 min，離子液體相沉淀于試管底部，去除上層清液，取離子液體相用甲醇按照1∶1稀釋，渦旋，用于液相色譜分析。

1.3.4 色譜條件

色譜柱 Waters XBridgeTM-C18Column（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相組成：A（水）+B（甲醇），采用梯度洗脫；梯度洗脫程序：A的初始比例為60%，在0～15 min線性降低至20%，15～25 min保持20%，25 min提高至60%，并保持至40 min。流速：1.0 mL/min；柱溫：25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：213 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液圖譜

在優(yōu)化后的方法條件下，7種殺菌劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖見圖1，根據(jù)相對(duì)保留時(shí)間并結(jié)合待測(cè)化合物的特征吸收波譜進(jìn)行定性。由圖1可以看出，7個(gè)殺菌劑物質(zhì)的峰形良好，分離度高。

圖1 殺菌劑標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖（質(zhì)量濃度為5 mg/L）Fig.1 Chromatogram of fungicide standard solution at 5 mg/L

2.2 儀器參數(shù)評(píng)估

在優(yōu)化的色譜條件下對(duì)系列質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測(cè)，其線性范圍和精密度結(jié)果見表1。其中，嘧菌酯和咯菌腈在20～10 000 μg/L范圍內(nèi)其積分峰面積與質(zhì)量濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，氯苯嘧啶醇、嘧菌環(huán)胺、咪鮮胺和烯唑醇4種殺菌劑在50～10 000 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，7種殺菌劑的相關(guān)系數(shù)均達(dá)0.999以上；該方法日內(nèi)保留時(shí)間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD，n=6）為0.03%～0.06%，峰面積RSD（n=6）為1.04%～5.20%；日間保留時(shí)間RSD（n=6×6）為0.10%～0.19%，峰面積RSD為0.54%～7.96%。結(jié)果表明該方法線性范圍寬、上機(jī)測(cè)定重復(fù)性好。

表1 7種殺菌劑的線性范圍、相關(guān)系數(shù)及精密度Table1 Linearity ranges, correlation coefficients and accuracy for seven fungicides

2.3 IL-DLLME萃取條件優(yōu)化

為提高萃取效率，需對(duì)DLLME操作條件進(jìn)行優(yōu)化。在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件過程中樣品加標(biāo)水平均為0.1 mg/L，采用萃取回收率即萃取到沉淀相中目標(biāo)物占總目標(biāo)物的百分比和富集倍數(shù)即濃縮倍數(shù)，為沉淀相中目標(biāo)物質(zhì)量濃度與最初水相中目標(biāo)物質(zhì)量濃度之比作為萃取性能評(píng)價(jià)參數(shù)。

2.3.1 萃取劑類型選擇

合適的萃取劑應(yīng)該滿足水溶性低、不易揮發(fā)、密度比水大、與目標(biāo)物性質(zhì)匹配等特性，這樣才能保證獲得較高萃取效率。本研究比較了3種離子液體，包括[C4MIM][PF6]（密度1.37 g/mL）、[C6MIM][PF6]（密度1.30 g/mL）和[C8MIM][PF6]（密度1.23 g/mL）對(duì)7種殺菌劑的萃取效果。所有樣品溶液均加入含有60 μL離子液體的甲醇1 mL。結(jié)果發(fā)現(xiàn)[C4MIM][PF6]作為萃取劑時(shí)離心管底部沒有產(chǎn)生沉淀，因此不再做深入研究；當(dāng)以[C6MIM][PF6]和[C8MIM][PF6]兩種離子液體為萃取劑時(shí)離心管底部均能產(chǎn)生沉淀，其萃取回收率如圖2所示，可見[C6MIM][PF6]對(duì)目標(biāo)物的萃取效率整體上要優(yōu)于[C8MIM][PF6]，故本實(shí)驗(yàn)選擇[C6MIM][PF6]為萃取劑。

圖2 萃取劑類型對(duì)回收率的影響Fig.2 Effect of extraction solvent type on fungicide recovery

2.3.2 萃取劑體積選擇

圖3 萃取劑體積對(duì)回收率的影響Fig.3 Effect of extraction solvent volume on fungicide recovery

萃取劑體積直接影響IL-DLLME方法的富集效率[21]。本實(shí)驗(yàn)比較了包含不同體積離子液體[C6MIM][PF6]（40、50、60、70、80 μL）的1 mL甲醇對(duì)萃取效率的影響。從圖3可以看出，萃取回收率隨著萃取劑體積的增大而呈增加趨勢(shì)，在60 μL和70 μL時(shí)獲得最大萃取回收率，之后萃取回收率隨萃取劑體積增大而降低可能是因?yàn)檫^量的萃取劑會(huì)吸附于離心管壁，造成這部分萃取劑中目標(biāo)物不能被沉淀到離心管底部。當(dāng)離子液體用量增大，沉淀相體積也隨之增大，則沉淀相中目標(biāo)物的質(zhì)量濃度會(huì)下降，影響方法靈敏度。因此在滿足殘留檢測(cè)要求的回收率范圍內(nèi)，權(quán)衡既能保證較高的富集倍數(shù)同時(shí)又能少用離子液體量后，確定[C6MIM][PF6]用量為60 μL。

2.3.3 分散劑類型選擇

分散劑類型也是影響萃取效率的關(guān)鍵因素之一。合適的分散劑必須同時(shí)滿足和離子液體、水相互溶，在整個(gè)萃取過程中使離子液體均勻分散于水相中并形成良好的乳濁體系[22]?；谏鲜鰲l件，本實(shí)驗(yàn)選擇甲醇、乙腈、丙酮作為分散劑，系列實(shí)驗(yàn)均加入含有60 μL離子液體的1 mL各種分散劑。從圖4可以看出，甲醇作為分散劑其回收率和富集倍數(shù)整體效果最佳，可能因?yàn)檩腿┰诩状贾械姆峙湎禂?shù)要大于其他分散劑，萃取劑被分散成細(xì)小液滴，從而增大萃取效率[23]。所以選用甲醇作為本實(shí)驗(yàn)的分散劑。

圖4 分散劑類型對(duì)回收率影響Fig.4 Effect of dispersive solvent type on fungicide recovery

2.3.4 分散劑體積選擇

分散劑體積直接影響離子液體在水相中溶解程度、決定沉淀相體積、影響萃取回收率。本實(shí)驗(yàn)考察了含有60 μL離子液體的甲醇（0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL）對(duì)萃取率的影響，結(jié)果見圖5。由圖5可知，當(dāng)分散劑用量為0.8 mL時(shí)萃取回收率最佳，當(dāng)分散劑體積從1.0～1.2 mL時(shí)萃取回收率降低。因?yàn)?，甲醇用量少時(shí)，不能形成良好的乳濁體系，因此回收率較低；而甲醇用量較大時(shí)，分析物在水相中的溶解度增大，同樣會(huì)導(dǎo)致回收率較低。所以，甲醇用量選0.8 mL。

圖5 分散劑體積對(duì)回收率的影響Fig.5 Effect of dispersive solvent volume on fungicide recovery rate

2.3.5 溶解溫度選擇

溫度是TCA-IL-DLLME過程中關(guān)鍵步驟，可直接影響萃取回收率。低溫限制離子液體及目標(biāo)物在水相中的擴(kuò)散速率，減小目標(biāo)物與離子液體和水相的接觸面積，造成萃取回收率偏低；高溫增大離子液體對(duì)目標(biāo)物的萃取速率同時(shí)也增大目標(biāo)物從離子液體的遷出速率，若萃取速率小于遷出速率也會(huì)導(dǎo)致萃取回收率降低。實(shí)驗(yàn)選擇50、60、70、80、90℃驗(yàn)證溫度對(duì)目標(biāo)物萃取回收率的影響（圖6）。從圖6可以看出，當(dāng)溫度為80℃時(shí)萃取回收率最高，當(dāng)溫度高于80℃可能造成萃取速率小于遷出速率回收率隨之降低。因此，溶解溫度選擇80℃。

圖6 溶解溫度對(duì)回收率的影響Fig.6 Effect of extraction temperature on fungicide recovery

2.3.6 萃取時(shí)間選擇

萃取時(shí)間指離心管放入冰水浴到離心的時(shí)間間隔。冰浴可使溶解在水相中的離子液體形成分散相，并將目標(biāo)物收集到分散相中。本實(shí)驗(yàn)所選萃取時(shí)間為5、10、15、20、25 min。從圖7可以看出，在15 min時(shí)達(dá)到萃取平衡，當(dāng)超過15 min時(shí)萃取回收率逐漸降低，可能是長(zhǎng)時(shí)間萃取導(dǎo)致部分離子液體溶于水相中。因此，萃取時(shí)間選擇15 min。

圖7 萃取時(shí)間對(duì)回收率的影響Fig.7 Effect of extraction time on fungicide recovery

2.3.7 其他因素選擇

在IL-DLLME實(shí)驗(yàn)中，離心時(shí)間對(duì)萃取效率也有一定影響。離心可導(dǎo)致相分離，將含有目標(biāo)物的離子液體沉積到試管底部，方便提取。本實(shí)驗(yàn)做了相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)當(dāng)離心時(shí)間為5 min時(shí)，萃取回收率最高，當(dāng)超過5 min時(shí)，回收率有所降低，可能由于離心時(shí)間過長(zhǎng)離子液體相溶解于水相中，使目標(biāo)物質(zhì)量濃度降低，故選擇5 min為最佳離心時(shí)間。

2.4 方法評(píng)估

在優(yōu)化的最佳條件下，分別對(duì)不含目標(biāo)物的5種果汁（橙汁稀釋5倍，方法同1.3.3節(jié)）加標(biāo)，加標(biāo)水平分別為0.02、0.05 mg/L和0.10 mg/L，平行測(cè)定6次，計(jì)算其平均加標(biāo)回收率，結(jié)果見表2。7種殺菌劑農(nóng)藥的平均加標(biāo)回收率達(dá)到70.0%～116.2%，RSD為1.3%～9.8%，在信噪比為3時(shí)得到方法檢出限在4.3～13.0 μg/L之間。與近年報(bào)道的IL-DLLME方法檢測(cè)果汁和水樣中殺菌劑殘留的方法進(jìn)行對(duì)比（表3），本方法使用溫控輔助離子液體萃取方式檢測(cè)果汁中殺菌劑殘留，在增加樣品對(duì)象保證較高富集倍數(shù)（64～101）的同時(shí)，氯苯嘧啶醇、嘧菌環(huán)胺、咪鮮胺和烯唑醇的回收率均有所提高，表明該方法具有良好的重復(fù)性和準(zhǔn)確性。

表2 不同果汁3個(gè)水平加標(biāo)下平均回收率和RSD（n=6）Table2 Mean recoveries and relative standard deviations for spiked fruit juice samples at three concentration levels (n= 6)

表3 現(xiàn)有IL-DLLME方法檢測(cè)果汁、紅酒和水樣中殺菌劑方法的對(duì)比Table3 Comparison of existing methods for the analysis of fungicides in fruit juice, red wine and water by IL-DLLME

2.5 實(shí)際樣品分析

在各大型超市隨機(jī)抽取蘋果汁、梨汁、葡萄汁、桃汁和橙汁樣品共計(jì)20個(gè)，采用本方法進(jìn)行檢測(cè)，樣品中均未檢出殺菌劑農(nóng)藥殘留，部分色譜圖見圖8。

圖8 蘋果汁樣品DLLME萃取后空白（A）和加標(biāo)0.1 mg/L（B）色譜圖Fig.8 Chromatograms of blank apple juice sample (A) and spiked apple juice sample at 0.1 mg/L (B) after DLLME extraction

3 結(jié) 論

目前，離子液體DLLME已廣泛應(yīng)用于食品、環(huán)境等領(lǐng)域污染物檢測(cè)，但研究大多集中于水樣中污染物檢測(cè)。本研究建立了溫控輔助離子液體DLLME結(jié)合HPLC法檢測(cè)多種果汁中7種殺菌劑殘留的方法，方法操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、富集倍數(shù)高、成本低、環(huán)保，能滿足復(fù)雜基質(zhì)如果汁樣品中殘留的檢測(cè)要求，同時(shí)對(duì)拓寬離子液體DLLME方法應(yīng)用領(lǐng)域也具有一定的指導(dǎo)、借鑒意義。

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