焦磷酸抑制聚T模板CuNPs合成的非標(biāo)記熒光探針用于堿性磷酸酯酶活性的測定

來倩倩

（浙江省碳材料溫州大學(xué)化學(xué)與材料工程學(xué)院碳材料技術(shù)研究重點實驗室，浙江 溫州 325027）

堿性磷酸酯酶（ALP）是一種廣泛分布在人體各個組織中的蛋白酶[1]。它作為一種常用的生物標(biāo)記物在酶免疫測定、基因分析、組織化學(xué)的染色等方面被應(yīng)用于檢測蛋白質(zhì)、藥物、核酸和其它分析物。由于ALP酶去磷酸化的底物分布比較廣泛，所以對于不同的去磷酸化底物，ALP酶表現(xiàn)出來的作用不同。臨床上，人體血清中ALP酶含量的多少與很多疾病有關(guān)，比如骨骼、肝膽系統(tǒng)的疾病等[2-5]。此外，ALP酶與其他一些酶是同源的，并表現(xiàn)出一部分同樣的催化性能[6]。因此，采用自然底物代替人工合成的顯色底物對ALP酶的活性進(jìn)行測定，也許能夠更加快速直接地研究出ALP酶的相關(guān)功能[7]。然而，大量的天然底物中只有少量的含磷酸基團(tuán)的底物被認(rèn)可并充當(dāng)ALP的底物，焦磷酸（PPi）就是這些被確認(rèn)的底物中的一種。有報道[8-9]指出PPi充當(dāng)ALP酶底物時，所需的最適pH值比較低，水解速度也比較慢。由于焦磷酸（PPi）能夠抑制骨骼的礦化，所以，在機(jī)體組織中ALP酶可以催化PPi水解，進(jìn)而使骨組織中的PPi的濃度維持在一個特定的范圍內(nèi)，確保骨骼正常的礦化[10]。PPi同樣也可以抑制血管的鈣化，可以通過ALP酶對PPi的催化水解來調(diào)節(jié)并預(yù)防血管的過度鈣化[11]。因此，PPi作為ALP酶的天然底物，對ALP酶的分析檢測具有重要的影響意義。

傳統(tǒng)的用來評估ALP酶催化PPi水解能力的方法主要是依據(jù)對水解所得磷酸根（Pi）的比色分析或者是對PPi中的磷（P）進(jìn)行放射性標(biāo)記以充當(dāng)檢測所需的信號標(biāo)記[12-13]。這些方法大多操作起來比較復(fù)雜，而且有的方法還需要標(biāo)記，獲得的信號的靈敏度還比較低。因此，目前急需發(fā)展一些簡單快速、靈敏度高、選擇性好的非標(biāo)記的光學(xué)檢測方法用來研究ALP酶對底物PPi的水解作用。但是這些已有的報道[14]主要是通過溶液中電解質(zhì)的共軛作用產(chǎn)生的，溶液中帶電荷的物質(zhì)對其的干擾比較大，得到的信號也比較弱。

近年來，納米技術(shù)發(fā)展飛速，采用納米材料作為分子探針對生物分子進(jìn)行定量和定性的分析越來越引起研究者們的關(guān)注。隨著聚T鏈可以作為合成熒光銅納米顆粒的模板這一文獻(xiàn)的報道[15]，這種新型的材料可以用來作為熒光指示探針，應(yīng)用于生物傳感器中。本文中基于焦磷酸（PPi）對以聚T鏈為模板的熒光銅納米顆粒的形成具有很強(qiáng)的抑制作用，發(fā)展了一種非標(biāo)記的熒光增強(qiáng)的方法，用于堿性磷酸酯酶活性的檢測。相比其他傳統(tǒng)的檢測ALP酶活性的方法，該方法不僅直接在均相溶液中就可進(jìn)行，而且該方法選擇性好，所需時間短，成本低廉，靈敏度高。其檢測下限達(dá)到0.5U·L-1。

1 實驗原理

本章中報道了一種利用聚T鏈模板合成的熒光CuNPs作為信號轉(zhuǎn)換的指標(biāo)協(xié)助焦磷酸（PPi）對CuNPs合成的抑制作用，發(fā)展了一種非標(biāo)記的光學(xué)檢測方法用于ALP酶活性的檢測。如圖1所示，該方法旨在利用焦磷酸與二價銅離子之間很強(qiáng)的絡(luò)合作用來抑制單鏈DNA與二價銅離子的相互作用，進(jìn)而不能夠合成銅納米顆粒，導(dǎo)致熒光信號降低。但當(dāng)ALP酶存在的條件下，ALP酶可以使PPi水解，進(jìn)而PPi就不能與二價銅離子發(fā)生絡(luò)合作用。在聚T模板鏈的存在下，二價銅離子被抗壞血酸還原，形成具有熒光的銅納米顆粒，進(jìn)而熒光恢復(fù)，并且熒光的恢復(fù)程度和ALP酶的濃度密切相關(guān)。

圖1 堿性磷酸酯酶活性熒光檢測方法的原理

2 實驗部分

2.1 聚T鏈和PPi對Cu2+競爭反應(yīng)

Cu2+不僅能夠與聚T鏈模板合成CuNPs，而且還可以與焦磷酸發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)形成絡(luò)合物，所以我們要首先研究哪種作用力比較強(qiáng)。在10mM Tris-HCl（pH 7.4，100mM NaCl）的緩沖溶液中加入40μL的Cu2+和不同濃度的焦磷酸（PPi）于37℃下水浴50min。然后，加入事先制備好的含有40μL抗壞血酸鈉和1μM的聚T模板鏈的混合溶液。避光反應(yīng)10min后，進(jìn)行熒光測定。

2.2 測定ALP酶的活性

在 10mM Tris-HCl（pH 7.4，100mM NaCl）的緩沖溶液中加入40μL的Cu2+、固定濃度的焦磷酸（PPi）和不同濃度的ALP酶，37℃下水浴50min。再加入事先制備好的含有40μL抗壞血酸鈉和1μM的聚T模板鏈的混合溶液。避光反應(yīng)10min后，進(jìn)行熒光測定。

2.3 熒光光譜檢測

本章實驗中的光譜測量均在Fluoro Max-4熒光光譜儀上測定，采用最大容量為400μL的比色皿盛放待測液，激發(fā)波長為350nm，發(fā)射峰的掃描范圍從540nm到680nm。通過熒光光譜儀測定得到的結(jié)果，均是從大于3次的重復(fù)實驗中獲得。

3 結(jié)果與討論

3.1 實驗的可行性分析

圖2是不同反應(yīng)條件下的熒光光譜圖。由圖2可知，當(dāng)體系中焦磷酸和磷酸根離子都不存在時，在350nm的激發(fā)波長下，可以觀測到在625nm處有一個很強(qiáng)的熒光吸收峰。當(dāng)加入500μM的磷酸一氫根離子或500μM的磷酸二氫根離子時，熒光強(qiáng)度幾乎不變。但當(dāng)有焦磷酸存在時，所觀測的熒光信號明顯減弱。這說明了只有焦磷酸可以抑制二價銅離子在聚T鏈上被抗壞血酸還原。同時可觀測到，當(dāng)200μM的焦磷酸和30U·L-1的堿性磷酸酯酶同時存在時，熒光信號得到了部分恢復(fù)。這些結(jié)果都說明了焦磷酸抑制聚T模板鏈合成的銅納米粒子作為熒光探針用于檢測堿性磷酸酯酶的活性這一方法是可行的。

圖2 在不同反應(yīng)條件下的熒光光譜圖

從上到下的反應(yīng)條件是：1）PPi和磷酸根離子都不存在時；2）500μM的HPO42-存在時；3）500μM 的 H2PO4-存 在 時；4）200μM 的 焦 磷 酸和30U·L-1的堿性磷酸酯酶同時存在時；5）只有200μM的焦磷酸存在。其他反應(yīng)條件都一樣。

3.2 實驗條件的優(yōu)化

圖3是有無焦磷酸存在的條件下，焦磷酸的抑制作用對二價銅離子濃度的影響。由圖3可知，隨著二價銅離子濃度的增加，熒光強(qiáng)度逐漸增加，并且在二價銅離子的濃度達(dá)到100μM時，有最大的熒光強(qiáng)度差。圖4是堿性磷酸酯酶的反應(yīng)時間的優(yōu)化。由圖4可知，隨著水浴時間的加長，測得的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)。在水浴時間為50min的時候，熒光強(qiáng)度達(dá)到最強(qiáng)，并且再增加水浴時間發(fā)現(xiàn)熒光強(qiáng)度不再發(fā)生變化。由圖5、圖6可知，隨著焦磷酸濃度逐漸增加，熒光強(qiáng)度逐漸減弱，當(dāng)焦磷酸的濃度達(dá)到200μM時，熒光強(qiáng)度趨于平穩(wěn)。所以，最佳銅離子濃度、焦磷酸的濃度、酶反應(yīng)時間分別為100μM、200μM、50min。

圖3 有無焦磷酸存在條件下，焦磷酸的抑制作用對二價銅離子濃度的影響

圖4 堿性磷酸酯酶的反應(yīng)時間的優(yōu)化

圖5 熒光強(qiáng)度與焦磷酸濃度之間的線性關(guān)系圖

圖6 不同濃度焦磷酸的條件下，所測得的熒光光譜圖

3.3 ALP酶活性的研究

如圖7所示，在最佳的實驗條件下觀察在不同的ALP濃度條件下測得的熒光光譜圖，發(fā)現(xiàn)，在625nm位置的熒光強(qiáng)度隨著ALP濃度的增加而增加。所得的校準(zhǔn)曲線如圖8、9所示，當(dāng)ALP的含量在0.5～20U·L-1之間時，熒光強(qiáng)度與ALP的濃度成正比。檢測到的最低下限為0.5U·L-1。與其他同樣的檢測ALP的方法相比[16-17]，該方法的檢測限要低些，重現(xiàn)性也比較好些。

圖7 在不同的ALP酶濃度的條件下測得的熒光光譜圖

圖8 ALP酶的校準(zhǔn)曲線

圖9 熒光強(qiáng)度與ALP酶濃度的對數(shù)之間的線性關(guān)系(每組實驗都至少重復(fù)3次)

4 結(jié)論

堿性磷酸酯酶（ALP）是人體多種組織中的一種重要的酶，對多種疾病的臨床診斷具有重要的意義。因此，本文中基于焦磷酸（PPi）對以聚T鏈為模板的熒光銅納米顆粒的形成具有很強(qiáng)的抑制作用，發(fā)展了一種非標(biāo)記的熒光增強(qiáng)的方法用于堿性磷酸酯酶活性的檢測。

該方法旨在利用焦磷酸與二價銅離子之間的強(qiáng)絡(luò)合作用來抑制單鏈DNA與二價銅離子之間的結(jié)合作用，進(jìn)而不能夠合成銅納米顆粒，導(dǎo)致熒光信號降低。但當(dāng)ALP存在的條件下，ALP可以使PPi水解，進(jìn)而PPi就不能與二價銅離子發(fā)生絡(luò)合作用。在聚T模板鏈的存在下，二價銅離子被抗壞血酸還原，形成具有熒光的銅納米顆粒，進(jìn)而熒光恢復(fù)。

該方法不僅直接在均相溶液中就可進(jìn)行，而且該方法選擇性好，所需時間短，成本低廉，靈敏度高。其檢測下限達(dá)到0.5U?L-1。

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