肝星狀細(xì)胞對(duì)VEGF介導(dǎo)的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞分化的影響

周春光，段文彪，趙延榮，李倉(cāng)，孫克龍，張誼，單云峰，張啟瑜

組織工程和再生醫(yī)學(xué)的興起使很多組織壞死性疾病有望得到治療和治愈[1]。干細(xì)胞作為組織工程中種子細(xì)胞的主要來源，對(duì)其在分化上的研究一直是組織工程領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[2-4]。大量研究[5-6]證明VEGF能促進(jìn)ADSCs及其他干細(xì)胞向ECs分化。探索如何尋求有效的途徑使去肝臟細(xì)胞化支架再細(xì)胞化，以獲得具有不完全肝功能的肝樣組織甚至具有完整血管網(wǎng)絡(luò)的再細(xì)胞化肝臟一直是肝臟再生醫(yī)學(xué)研究者們不懈努力的目標(biāo)。本研究通過大鼠肝間質(zhì)細(xì)胞—大鼠肝星狀細(xì)胞與大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，在內(nèi)皮細(xì)胞分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的間接共培養(yǎng)，觀察在VEGF誘導(dǎo)下，HSCs對(duì)rADSCs向ECs分化的影響，為之后兩種細(xì)胞在去細(xì)胞化支架內(nèi)直接有序的共培養(yǎng)獲取再細(xì)胞化肝臟提供研究策略。

1 材料和方法

1.1 材料

大鼠肝卵圓細(xì)胞WB-F344購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)；戊巴比妥鈉、IV型膠原酶、Triton X-100購(gòu)自Sigma公司；PBS購(gòu)自Hyclone公司；FBS、DMEM/F12、DMEM、0.25% EDTA胰酶購(gòu)自Gibco公司；vWF一抗、eNOs一抗和VE-Cadherin（CD144）一抗、Donkey Anti-Rabbit IgG H&L（Alexa Fluor?594）熒光二抗、Donkey Anti-Mouse IgG H&L（Alexa Fluor?488）熒光二抗購(gòu)自Abcam公司；APC-CD90、Mouse IgG1（κPurified）、Mouse IgG1（κAPC）、Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)自BD Biosciences公司；Goat anti-Mouse IgG H&L-HRP、Goat anti-Rabbit IgG H&L-HRP購(gòu)自Bioworld公司；Transwell共培養(yǎng)小室購(gòu)自Corning公司；CCK8試劑盒購(gòu)自Dojindo公司；ECM培養(yǎng)基購(gòu)自ScienCell公司；rVEGF購(gòu)自PeproTECH公司；BCA試劑盒購(gòu)自Beyotime公司；乙?；兔芏戎鞍祝―iI labeled acetylated low-density lipoprotein，DiI-Ac-LDL）購(gòu)自YiYuanBiotech公司。

1.2 方法

1.2.1 原代大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（rat adipose tissue-derived mesenchymal stem cells，rADSCs）的分離和培養(yǎng)：選取6周齡SPF級(jí)雄性SD大鼠兩只，2%戊巴比妥鈉0.3 mL/g腹腔注射麻醉，無(wú)菌條件于大鼠后腹膜及腎周處取出多塊體積約為1 mL左右的脂肪塊經(jīng)PBS沖洗后置于無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)，迅速轉(zhuǎn)移至超凈臺(tái)用無(wú)菌眼科剪將脂肪塊剪碎，分別放入15 mL離心管內(nèi)，加入4 mL含有0.075% IV型膠原酶的DMEM/F12培養(yǎng)基，于37 ℃下震蕩消化60 min，200目無(wú)菌篩網(wǎng)過濾消化物，濾液經(jīng)1500 r/min離心10 min收集細(xì)胞，用含有15% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸，以1×105的密度種于25 cm2培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，1 d后換液。以后每?jī)商鞊Q液一次，待細(xì)胞融合至培養(yǎng)瓶底80%時(shí)用含0.25%EDTA的胰酶消化傳代。

1.2.2 rADSCs表面標(biāo)記物的鑒定：取第三代rADSCs，胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，離心PBS重懸，以每管1×106分裝細(xì)胞，用APC直接標(biāo)記的CD90和IgG H&L Alexa Fluor?488間接標(biāo)記的CD144（VE-Cadherin）對(duì)rADSCs進(jìn)行表面標(biāo)記物的鑒定，以Mouse IgG1（κPurified）和Mouse IgG1（κAPC）作同型對(duì)照。1.2.3 共培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)rADSCs向內(nèi)皮細(xì)胞（endothelial cells，ECs）分化：利用膜孔徑0.4μm的Transwell共培養(yǎng)小室，下層以1×104/孔的rADSCs在含有15% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)，上層分別以1×103、1×104、1×105/孔的HSCs在含有5%FBS的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，共培養(yǎng)2 d后，CCK8法測(cè)定下層rADSCs活力，選擇rADSCs活力最好的組作為誘導(dǎo)培養(yǎng)的細(xì)胞比例。以之前確定的共培養(yǎng)細(xì)胞比例在Transwell共培養(yǎng)小室內(nèi)，用內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基替換DMEM/F12培養(yǎng)基后誘導(dǎo)rADSCs向ECs分化。內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基成分包括：ECM（Endothelial Cell Medium）、5% FBS、pen/strep、ECGS（endothelial cell growth supplement）、10 ng/mL rVEGF。每2 d換一次誘導(dǎo)培養(yǎng)基，重新消化接種特定數(shù)目的HSCs，觀察下層rADSCs誘導(dǎo)7 d和14 d后的形態(tài)學(xué)改變。誘導(dǎo)2周后收集各組誘導(dǎo)后的rADSCs，擴(kuò)增、凍存?zhèn)溆?。共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)設(shè)置四組，陽(yáng)性對(duì)照組為大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（rat Brain microvascular en-dothelial cells，rBMVECs）；實(shí)驗(yàn)組為HSCs與rADSCs在內(nèi)皮細(xì)胞分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基中共培養(yǎng)；陰性對(duì)照組為肝卵圓細(xì)胞（hepatic oval cells，HOCs）與rADSCs在內(nèi)皮細(xì)胞分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基中共培養(yǎng)；空白對(duì)照組為rADSCs在內(nèi)皮細(xì)胞分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基中單獨(dú)誘導(dǎo)培養(yǎng)。培養(yǎng)及誘導(dǎo)后所得內(nèi)皮細(xì)胞分別記為：陽(yáng)性對(duì)照組，rBMVECs；實(shí)驗(yàn)組，（rADSCs+HSCs）ECs；陰性對(duì)照組，（rADSCs+HOSs）ECs；空白對(duì)照組，（rADSCs）ECs。

1.2.4vWF、eNOs、VE-Cadherin免疫熒光染色：誘導(dǎo)2周后，用內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)記抗體—vWF、eNOs和VE-Cadherin鑒定誘導(dǎo)后rADSCs的表型。簡(jiǎn)要步驟為將已爬好rADSCs細(xì)胞的玻片用PBS浸洗3次，4%多聚甲醛固定爬片15 min，0.5% Triton X-100室溫通透20 min，驢血清室溫封閉30 min，加足夠量的稀釋好的一抗在濕盒中4 ℃孵育過夜；第二天用PBS浸洗爬片3次，加稀釋好的熒光二抗（Donkey Anti-Rabbit IgG H&L（Alexa Fluor?594）或Donkey Anti-Mouse IgG H&L（Alexa Fluor?488，Abcam）在濕盒中37 ℃孵育1 h，滴加DAPI避光孵育5 min進(jìn)行核染，PBS洗去多余的DAPI，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

1.2.5eNOs蛋白表達(dá)檢測(cè)：取誘導(dǎo)2周后的rADSCs細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白；BCA試劑盒測(cè)蛋白濃度，計(jì)算上樣量；制8%和10%的SDS-PAGE膠，以60 mv跑膠，至樣品進(jìn)入分離膠后改為110 mv恒壓電泳；以350 mA恒流轉(zhuǎn)膜80～120 min；用5%脫脂奶粉封閉1 h，加稀釋好的一抗（vWF、eNOs和VE-Cadherin）在濕盒中4 ℃孵育過夜，TBST洗三次后，加5%脫脂奶粉配制好的二抗（Goat anti-Mouse IgG H&L-HRP和Goat anti-Rabbit IgG H&L-HRP），常溫孵育1 h后，于暗室中加發(fā)光劑發(fā)光、曝光。

1.2.6 功能學(xué)檢測(cè)

（1）細(xì)胞遷移試驗(yàn)：取誘導(dǎo)2周后的rADSCs細(xì)胞，用無(wú)血清ECM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，在膜孔徑8μm的Transwell小室（Corning）上層加入200μL細(xì)胞懸液（細(xì)胞濃度1×105/mL），在小室下層加入600μL含5% FBS和20 ng/mL rVEGF的ECM養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后取出上層小室，用干凈的棉簽輕輕拭去小室底部膜上層的細(xì)胞，最后把小室底部的膜輕輕取下，并把膜的底面朝上，用4%多聚甲醛固定15 min后，DAPI染色5 min，在熒光顯微鏡下觀察穿過膜的細(xì)胞。

（2）DiI-Ac-LDL吞噬試驗(yàn)：誘導(dǎo)2周后在小室下層的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入25μg/mL乙?；兔芏戎鞍祝―iI labeled acetylated low-density lipoprotein，DiI-Ac-LDL），37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h后用PBS清洗細(xì)胞3次，用4%多聚甲醛固定15 min，DAPI染色5 min，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞DiI-Ac-LDL的吞噬情況。

（3）體外成血管試驗(yàn)：取誘導(dǎo)2周后的rADSCs細(xì)胞，用無(wú)血清ECM培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h后，用誘導(dǎo)培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，以1×105/孔加入到鋪有Matrigel基質(zhì)膠的24孔板中，置于37 ℃、5% C02的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后觀察細(xì)胞成血管情況。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：用統(tǒng)計(jì)軟件SPSSl9.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（±s），多組間差異比較采用單因素方差分析TuKey HSD方法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 原代rADSCs的表面標(biāo)記物鑒定

由大鼠脂肪組織提取的原代rADSCs經(jīng)過傳代培養(yǎng)后逐漸純化，流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)結(jié)果（圖1）顯示第3代rADSCs表面標(biāo)記物CD90陽(yáng)性率達(dá)96.0%，CD144陰性率達(dá)93.1%。

2.2 共培養(yǎng)誘導(dǎo)體系初始細(xì)胞比例的確定

圖1 rADSCs細(xì)胞表型分析

共培養(yǎng)體系中各種細(xì)胞比例對(duì)目的細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖有重大影響，因此確定最優(yōu)的共培養(yǎng)初始細(xì)胞比例是十分必要的。我們分別以1×103、1×104、1×105/孔的HSCs和1×104/孔的rADSCs進(jìn)行最優(yōu)共培養(yǎng)初始細(xì)胞比例的探索，誘導(dǎo)培養(yǎng)2d后測(cè)定下層rADSCs細(xì)胞數(shù)，結(jié)果（圖2）顯示在HSCs為1×104/孔時(shí)，下層rADSCs生長(zhǎng)相對(duì)最好（P＜0.05）。配合光鏡下對(duì)細(xì)胞形態(tài)的觀察，我們確定以1×104/孔HSCs和1×104/孔rADSCs作為共培養(yǎng)誘導(dǎo)體系初始細(xì)胞比例。注意到所用HSC-T6的增殖速率明顯高于原代提取的rADSCs，當(dāng)上層HSCs細(xì)胞量過高時(shí)（以1×105/孔培養(yǎng)2 d后），共培養(yǎng)體系中營(yíng)養(yǎng)消耗過快，影響下層rADSCs生長(zhǎng)，我們確定每?jī)商鞊Q一次誘導(dǎo)培養(yǎng)基，重新消化接種特定數(shù)目的HSCs。

2.3 rADSCs誘導(dǎo)后形態(tài)學(xué)的變化

原代提取的rADSCs呈梭形或多邊形，細(xì)胞融合至70%～90%后呈旋渦狀生長(zhǎng)。誘導(dǎo)后的rADSCs形態(tài)逐漸變短變圓，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，越來越多的細(xì)胞出現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞典型的鵝卵石樣改變。

圖2 共培養(yǎng)誘導(dǎo)培養(yǎng)2 d后3種共培養(yǎng)體系rADSCs生長(zhǎng)情況比較（*P＜0.05）

2.4 誘導(dǎo)后rADSCs免疫學(xué)指標(biāo)的變化

圖3HSCs共培養(yǎng)誘導(dǎo)第0、7和14天rADSCs光鏡下細(xì)胞形態(tài)（×100）

圖4 誘導(dǎo)2周后各組細(xì)胞vWF和VE-Cadherin免疫熒光雙染，DAPI染核（藍(lán)色），rBMVECs為陽(yáng)性對(duì)照（×200）

圖5 誘導(dǎo)2周后各組細(xì)胞eNOS和VE-Cadherin免疫熒光雙染，DAPI染核（藍(lán)色），rBMVECs為陽(yáng)性對(duì)照（×200）

免疫熒光檢測(cè)結(jié)果（圖4、5）顯示，四組細(xì)胞vWF和VE-Cadherin表達(dá)均陽(yáng)性；陽(yáng)性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組eNOS表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性，陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組eNOS表達(dá)弱陽(yáng)性。Western blotting檢測(cè)結(jié)果（圖6、7）與免疫熒光結(jié)果一致，實(shí)驗(yàn)組eNOS蛋白表達(dá)（0.71±0.06）明顯高于陰性對(duì)照組（0.39±0.07）和空白對(duì)照組（0.44±0.05）（P＜0.05），eNOS/GAPDH灰度比值如圖6所示。

圖6 誘導(dǎo)2周后各組細(xì)胞eNOS蛋白表達(dá)情況，rBMVECs為陽(yáng)性對(duì)照

2.5rADSCs誘導(dǎo)后功能學(xué)指標(biāo)的變化

圖7 誘導(dǎo)2周后各組細(xì)胞eNOS/GAPDH灰度比值，rBMVECs為陽(yáng)性對(duì)照（*P＜0.05）

2.5.1 細(xì)胞遷移試驗(yàn)：正常的內(nèi)皮細(xì)胞在趨化因子的作用下會(huì)顯示出其定向遷移的能力。我們以FBS和VEGF作為趨化因子，檢測(cè)誘導(dǎo)所得ECs的定向遷移能力。結(jié)果（圖8、9）顯示，四組細(xì)胞在FBS和VEGF作用下均可以在Transwell小室內(nèi)發(fā)生透膜遷移，實(shí)驗(yàn)組每視野下細(xì)胞遷移數(shù)目（28.50±3.10）明顯高于陰性對(duì)照組（16.25±2.06）和空白對(duì)照組（16.50±1.73）（P＜0.01）。

圖8 誘導(dǎo)2周后各組細(xì)胞透膜遷移情況，以DAPI染核（藍(lán)色）記數(shù)透膜細(xì)胞，rBMVECs為陽(yáng)性對(duì)照（×200）

圖9 誘導(dǎo)2周后各組細(xì)胞透膜遷移能力比較，rBMVECs為陽(yáng)性對(duì)照（**P＜0.01）

2.5.2 DiI-Ac-LDL吞噬試驗(yàn)：對(duì)DiI-Ac-LDL的吞噬能力是內(nèi)皮細(xì)胞具有的特性之一，通過檢測(cè)誘導(dǎo)所得ECs對(duì)DiI-Ac-LDL的吞噬能力，可以反映內(nèi)皮細(xì)胞的成熟程度和功能狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)IPP軟件處理測(cè)量后，以每視野下IOD（integrated optical density，積分光密度值）反映細(xì)胞對(duì)DiI-Ac-LDL的吞噬能力。結(jié)果顯示（圖10、11），四組細(xì)胞均能不同程度的吞噬DiI-Ac-LDL，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞（7383.00±1779.81）吞噬DiI-Ac-LDL的能力明顯高于空白對(duì)照組（3337.25±617.14）（P＜0.05）。

2.5.3 體外成血管試驗(yàn)：成熟的內(nèi)皮細(xì)胞具有在Matrigel膠上形成血管網(wǎng)絡(luò)的特性，我們將誘導(dǎo)所得的ECs加入到鋪有Matrigel基質(zhì)膠的24孔板中，觀察其成血管的能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)IPP軟件處理測(cè)量后，以每視野下小管總長(zhǎng)度（像素）反映細(xì)胞的成血管能力。結(jié)果顯示（圖12、13），四組細(xì)胞均能形成血管樣網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞（5476.25±826.03）體外成血管的能力明顯高于其他三組細(xì)胞—陽(yáng)性對(duì)照組（4153.5±547.16）（P＜0.05）、陰性對(duì)照組（3534.25±343.42）和空白對(duì)照組（4181.18±948.88）（P＜0.01）。

圖10 誘導(dǎo)2周后各組細(xì)胞DiI-Ac-LDL（紅色）吞噬情況，DAPI染核（藍(lán)色），rBMVECs為陽(yáng)性對(duì)照（×200）

圖11 誘導(dǎo)2周后各組細(xì)胞DiI-Ac-LDL吞噬能力比較，rBMVECs為陽(yáng)性對(duì)照（*P＜0.05）

3 討論

組織工程技術(shù)被認(rèn)為是最終能解決器官衰竭的途徑。然而，功能性組織器官及其生物模擬物的設(shè)計(jì)和創(chuàng)造，特別是像肝臟這種具有復(fù)雜生物學(xué)功能的巨大實(shí)質(zhì)性臟器，是一個(gè)十分復(fù)雜的過程。組織工程支架的內(nèi)皮化和血管化是構(gòu)建需要血液灌注的實(shí)質(zhì)性臟器的必要環(huán)節(jié)。Basak E等[7]利用內(nèi)皮細(xì)胞和肝細(xì)胞再細(xì)胞化大鼠去細(xì)胞化肝臟支架獲得了具有一定肝臟功能的大鼠再細(xì)胞化肝臟，并成功將得到的肝臟移植回大鼠體內(nèi)。然而內(nèi)皮細(xì)胞并不容易獲得，而ADSCs來源豐富，容易采集，不存在倫理爭(zhēng)議[8]，大量研究[9-10]顯示，ADSCs能在特定條件下向多種成熟細(xì)胞分化，包括內(nèi)皮細(xì)胞、肝細(xì)胞系等。ADSCs已經(jīng)被眾多學(xué)者作為種子細(xì)胞應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)的研究，Nuness等[11]成功利用脂肪來源的血管基質(zhì)細(xì)胞（adipose-de-rived SVF cells）和HepG2細(xì)胞系[hepatocyte cell line（HepG2）]設(shè)計(jì)出具有功能的血管化肝臟組織模擬物，雖然Nunes等認(rèn)為他們的SVFs在表型上與其他人報(bào)道[9，12]的ADSCs有所差異，但他們的研究結(jié)果均證明ADSCs在向內(nèi)皮分化和促進(jìn)組織血管化方面均有巨大的潛能，這為ADSCs在組織工程方面的應(yīng)用提供了巨大的可能。因此我們選擇rADSCs進(jìn)行肝臟組織器官內(nèi)皮化和血管化的研究，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果再次證明rADSCs在VEGF的誘導(dǎo)下能向內(nèi)皮細(xì)胞分化，并表現(xiàn)出成熟內(nèi)皮細(xì)胞的表型和功能。

圖12 誘導(dǎo)2周后各組細(xì)胞成血管情況，rBMVECs為陽(yáng)性對(duì)照（×100）

圖13 誘導(dǎo)2周后各組細(xì)胞成血管能力比較，rBMVECs為陽(yáng)性對(duì)照（*P＜0.05，**P＜0.01）

肝臟完整功能的行使關(guān)鍵在于肝臟的完整結(jié)構(gòu)和完整的細(xì)胞成分。因此在構(gòu)建功能性肝臟組織器官及其生物模擬物時(shí)，多細(xì)胞組織器官的多向分化誘導(dǎo)或者共培養(yǎng)便成為必須實(shí)現(xiàn)的一步。研究顯示HSCs與肝細(xì)胞共培養(yǎng)能促進(jìn)促進(jìn)肝細(xì)胞形成類肝組織球狀體，并且形成內(nèi)皮化管腔。Abu-Absi等[13]在3D培養(yǎng)基中利用HSC-T6和肝細(xì)胞直接共培養(yǎng)模擬肝臟組織再生過程，獲得的類肝組織球狀體具有白蛋白分泌功能，并且具有內(nèi)皮化管道。Kasuya等[14-15]在（D，L-lactide-co-glycolide）PLGA多聚微孔膜上利用小肝細(xì)胞（SHs）-肝星狀細(xì)胞（HSCs）-內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）進(jìn)行3D培養(yǎng)以獲得具有功能的血管化肝臟組織，他們發(fā)現(xiàn)HSCs能促進(jìn)ECs形成毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)，并增強(qiáng)SHs的肝細(xì)胞樣功能。細(xì)胞共培養(yǎng)對(duì)rADSCs細(xì)胞的分化成熟也有重要作用。Zhao等[9]認(rèn)為ADSCs與成熟細(xì)胞的共培養(yǎng)能促進(jìn)和增強(qiáng)ADSCs的定向分化。我們利用HSCs與rADSCs的間接共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，在VEGF誘導(dǎo)下的HSCs可以促進(jìn)rADSCs向ECs分化，并增強(qiáng)分化后ECs的細(xì)胞功能，特別是成血管能力的增強(qiáng)。另外，我們發(fā)現(xiàn)與實(shí)質(zhì)性細(xì)胞（HOC，肝卵圓細(xì)胞-肝臟實(shí)質(zhì)性細(xì)胞的一種）相比，非實(shí)質(zhì)性細(xì)胞（HSCs-肝臟非實(shí)質(zhì)性細(xì)胞的一種）更能促進(jìn)rADSCs向ECs分化和分化后ECs功能的成熟。

比起細(xì)胞直接接觸共培養(yǎng)獲得功能性、血管化肝臟組織類似物，利用Transwell小室進(jìn)行rADSCs和HSCs的間接共培養(yǎng)的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)便是能更加容易控制共培養(yǎng)體系中HSCs的細(xì)胞比例，從而能更加方便準(zhǔn)確的觀察測(cè)定在共培養(yǎng)過程中，rADSCs發(fā)生的生物學(xué)改變，闡明共培養(yǎng)條件下rADSCs發(fā)生相應(yīng)改變的可能機(jī)制。在生物形態(tài)發(fā)生上，Durdu S[16]等認(rèn)為很多細(xì)胞，如上皮細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞，都具有自發(fā)形成多細(xì)胞中央腔的特性，在這個(gè)中央腔形成的微環(huán)境中，細(xì)胞間的信號(hào)交流變得更加高效，中央腔周圍的細(xì)胞聯(lián)系得更加緊密，這在對(duì)多細(xì)胞生物組織器官的發(fā)生和形成過程中具有重要作用。生物形態(tài)發(fā)生機(jī)制的逐漸闡明為組織工程的發(fā)展提供了強(qiáng)大的動(dòng)力。在逐步認(rèn)識(shí)細(xì)胞間相互作用促進(jìn)組織器官形態(tài)發(fā)生的基礎(chǔ)上，以去細(xì)胞化肝臟支架為平臺(tái)，模擬器官發(fā)生形成過程，利用干細(xì)胞、非實(shí)質(zhì)性細(xì)胞、細(xì)胞因子等，以細(xì)胞因子包埋或非實(shí)質(zhì)性細(xì)胞填充構(gòu)建合適的局部微環(huán)境，對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行程序化灌注，多向誘導(dǎo)分化共培養(yǎng)，最終獲得功能性，血管內(nèi)皮化，可移植利用的組織工程肝臟將成為一種新的、值得嘗試的肝臟組織器官重建策略。

在血管化、可移植組織工程肝臟的構(gòu)建上，Basak團(tuán)隊(duì)取得了巨大的突破，Nunes等對(duì)簡(jiǎn)單獲取血管化肝臟類似物的研究同樣令人鼓舞，但是現(xiàn)在所能得到的實(shí)驗(yàn)性組織工程肝臟及其類似物遠(yuǎn)未能進(jìn)行臨床試用。去細(xì)胞化支架的內(nèi)皮化、多細(xì)胞共培養(yǎng)、干細(xì)胞的定向多向誘導(dǎo)分化以及之后對(duì)組織工程肝臟的神經(jīng)支配系統(tǒng)的研究仍然需經(jīng)歷長(zhǎng)期的探索。

綜上所述，通過細(xì)胞間接共培養(yǎng)，在VEGF的介導(dǎo)下，HSCs可以促進(jìn)rADSCs向ECs分化，增強(qiáng)分化后ECs的內(nèi)皮細(xì)胞功能。通過對(duì)多種細(xì)胞，特別是非實(shí)質(zhì)性細(xì)胞和干細(xì)胞，共培養(yǎng)體系深入的研究，可以為功能性血管化組織器官及其生物模擬物的設(shè)計(jì)和創(chuàng)造提供更加可靠的理論指導(dǎo)和更加廣闊的研究策略。

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