線粒體DNA分子技術(shù)在斑點(diǎn)叉尾鮰物種鑒定中的應(yīng)用

羅志萍，肖武漢，黃迎波，周慧平，袁曉芬，王華全

(1.湖南出入境檢驗(yàn)檢疫局，湖南長沙410004;2.中科院水生生物研究所，湖北武漢430022;3.湖北出入境檢驗(yàn)檢疫局，湖北武漢430050)

斑點(diǎn)叉尾鮰(Ictalurus punctatus)屬名貴淡水經(jīng)濟(jì)魚類，深受美國、加拿大及其他國家消費(fèi)者的喜愛。加工好的成品或半成品在美國、日本、歐洲和加拿大等地市場均暢銷，市場需求量極大。自1984年，我國湖北省水產(chǎn)研究所首次引進(jìn)斑點(diǎn)叉尾鮰，隨著繁育、養(yǎng)殖以及加工技術(shù)的日趨成熟，再加上高額的投資回報效益，使得斑點(diǎn)叉尾鮰的養(yǎng)殖業(yè)和加工業(yè)在我國迅速蓬勃發(fā)展，出口創(chuàng)匯效益也逐年攀升。目前斑點(diǎn)叉尾鮰的養(yǎng)殖已遍及我國大部分省市，其中在湖南、湖北、江西、安徽、江蘇、四川和廣東等地已大面積養(yǎng)殖。我國許多省區(qū)已將斑點(diǎn)叉尾鮰列為優(yōu)勢品種，是開發(fā)扶持以促進(jìn)其產(chǎn)業(yè)化和出口創(chuàng)匯的主要對象，已經(jīng)形成了產(chǎn)供銷一條龍的產(chǎn)業(yè)鏈。

然而近年來，曾被美國政府視為“反傾銷”而遭封殺的越南巴沙魚借道中國貼著“中國斑點(diǎn)叉尾鮰”的標(biāo)簽進(jìn)入美國市場，嚴(yán)重?fù)p害我國斑點(diǎn)叉尾鮰的品牌，影響了我國斑點(diǎn)叉尾鮰產(chǎn)品的正常出口，擾亂了國際斑點(diǎn)叉尾鮰市場。由此導(dǎo)致美國FDA對中國出口的斑點(diǎn)叉尾鮰產(chǎn)品采取隨機(jī)檢查行動，以中國出口的成品或半成品中斑點(diǎn)叉尾鮰物種不符為由的退貨和通報事件，而且還有愈演愈烈之勢。由于目前尚無半成品斑點(diǎn)叉尾鮰中物種鑒定方法，面對國外技術(shù)貿(mào)易壁壘，我國斑點(diǎn)叉尾鮰出口貿(mào)易只能陷入被動局面。

對于已加工好的斑點(diǎn)叉尾鮰成品和半成品，由于形態(tài)已發(fā)生完全改變，主要依據(jù)骨骼結(jié)構(gòu)和外部形態(tài)特征的傳統(tǒng)物種鑒定方法在斑點(diǎn)叉尾鮰的物種鑒定上已完全不適用。此外，在成品和半成品中，由于細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞和蛋白質(zhì)的變性，依據(jù)染色體特征的細(xì)胞分類學(xué)方法以及依據(jù)同功酶數(shù)據(jù)的酶學(xué)鑒定方法等也同樣不適合斑點(diǎn)叉尾鮰的物種鑒定。由于DNA的相對穩(wěn)定性和DNA序列數(shù)據(jù)的超敏感性，特別是線粒體DNA的高拷貝數(shù)，嘗試?yán)肈NA分子數(shù)據(jù)，特別是線粒體DNA的序列數(shù)據(jù)，建立一種能被國際上普遍接受的物種鑒定方法和標(biāo)準(zhǔn)，才是切實(shí)可行的。

有關(guān)科技查新結(jié)果表明，國外已有線粒體DNA的PCRRFLP的數(shù)據(jù)進(jìn)行鱈魚、比目魚等制品中物種鑒定的報道［1－14］，但均沒有線粒體DNA的D-loop區(qū)的分子數(shù)據(jù)來進(jìn)行斑點(diǎn)叉尾鮰物種鑒定方面的報道。而PCR-RFLP方法操作過程繁瑣，多用于對同一物種的不同群體進(jìn)行遺傳多態(tài)性分析，不適于快速、經(jīng)濟(jì)的鑒定斑點(diǎn)叉尾鮰物種。線粒體DNA控制區(qū)具有個體和種群特異性，已被國際上廣泛地用來作為物種鑒定的標(biāo)準(zhǔn)，尤其是D-loop控制區(qū)，不同物種差異較大，可以準(zhǔn)確鑒定物種。

1 材料與方法

1.1 樣本采集 考慮到在實(shí)際國際貿(mào)易中被冒用的可能性，選用斑點(diǎn)叉尾鮰Ictalurus punctatus、大口鲇Silurus meridionalis、革胡子鯰Clarias leather、鯉Cyprinus carpio和鯽 Carassius auratus，樣本取自長江水產(chǎn)研究所，取其肌肉組織用95%乙醇固定，保存于－20℃。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計。D-loop引物是根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫斑點(diǎn)叉尾鮰已知序列自行設(shè)計。引物序列為:D-loopF:GTCGCCTCCGTACTGTATTTCTCC;D-loopR:GGGTCCATCTTAACATCTTCAGTG。

COⅠ根據(jù)參考文獻(xiàn)采用通用引物，序列為:LCO-1490:GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG;HCO-2198:TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAT。

1.2.2 基因組DNA的提取和檢測?；蚪MDNA的提取采用常規(guī)的酚－氯仿抽提法，參考薩姆布魯克(2002)的方法和其他學(xué)者的研究方法［15－16］稍作改動。取用乙醇固定的尾鰭約0.1 g于2 ml離心管中，剪碎，置于37℃烘干。向離心管中加入500 μl抽提緩沖液，并加入RNaseA，至終濃度為20 μg/ml，37℃水浴1 h。然后向抽提緩沖液中加入蛋白酶K至終濃度為200 μg/ml，55℃水浴過夜。將消化好的樣品冷卻至室溫后，加入等體積的酚-氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，輕輕地上下顛倒10 min，使充分混勻，12 000 r/min離心10 min。用擴(kuò)口槍頭小心地吸取上層水相至另一新的離心管中。吸取上清液，加入等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)，操作同上，重復(fù)抽提1次。吸上清，加入1/10體積的NaAc，輕搖混勻，加2倍體積－20℃預(yù)冷的無水乙醇，待有絮狀沉淀析出后，置于－20℃沉淀1～2 h。12 000 r/min離心10 min。棄上清，用4℃ 70%乙醇洗滌2次，4℃、10 000 r/min離心5 min，棄上清，讓沉淀自然風(fēng)干，待白色沉淀變?yōu)闊o色透明時加入300 μl TE貯存液溶解DNA，保存于－20℃?zhèn)溆谩Ｓ玫鞍踪|(zhì)–核酸檢測儀測定DNA的濃度和A260/A280。用0.8%的瓊脂糖凝膠(含10 mg/ml EB)對DNA樣品進(jìn)行電泳，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察、拍照，從電泳圖判斷提取DNA的質(zhì)量。

1.2.3 基因擴(kuò)增與檢測。PCR擴(kuò)增的基本反應(yīng)體系25.0 μl，包括10 × Taq DNA 聚合酶 2.5 μl，MgCl2(25 mmmol/L)2.0 μl;dNTPs(2.5 mmol/L)2.0 μl;引物(10 pmol/μl)各0.5 μl，DNA 模板(100 ng/μl)0.5 μl，Taq DNA 聚合酶(1 U/μl)1.0 μl，超純水 18.0 μl。

采用以上PCR反應(yīng)體系對斑點(diǎn)叉尾鮰、革胡子鯰、大口鲇、鯉等進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)的基本熱循環(huán)參數(shù):95℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，54.8℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán);最后72℃延伸10 min，然后降溫至12℃。

為擴(kuò)增出特異性的目的條帶，在其他反應(yīng)參數(shù)不變的條件下，調(diào)節(jié)退火溫度，最終得到條帶清晰的目的產(chǎn)物。

1.2.4 序列測定。對得到的斑點(diǎn)叉尾鮰D-loop和COⅠ片段進(jìn)行膠回收，測序。

1.2.5 酶切鑒定。對測序得到的D-loop序列，用軟件DNA club查找酶切位點(diǎn)。經(jīng)查找，在D-loop序列的200 bp處有一特異的酶切位點(diǎn)EcoRⅠ。利用此限制性內(nèi)切酶分別對斑點(diǎn)叉尾鮰和革胡子鯰的D-loop序列進(jìn)行酶切鑒定，37℃酶切3 h，電泳檢測。

酶切體系:10 × buffer 1 μl，EcoRⅠ0.5 μl;D-loop 8.5 μl。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA提取結(jié)果 采用常規(guī)的酚－氯仿法提取用乙醇固定的斑點(diǎn)叉尾鮰組織DNA，分子量約10 kb。取2～4 μl DNA樣品，在0.8%瓊脂糖上檢測，條帶純度和亮度都較高，幾乎無拖尾現(xiàn)象。用核酸蛋白儀進(jìn)一步檢測顯示，DNA 濃度在400 ～1 500 ng/μl，A260/A280在1.65 ～1.82。因此該方法所提基因組DNA完全可以滿足線粒體D-loop擴(kuò)增的要求。

2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果 為擴(kuò)增出特異性的目的條帶，在其他反應(yīng)參數(shù)不變的條件下，調(diào)節(jié)退火溫度，最終得到條帶清晰的目的產(chǎn)物。其中，D-loop對應(yīng)的最佳退火溫度為54.8℃，PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖1、2。

由圖1可知，只有斑點(diǎn)叉尾鮰和革胡子鯰可以利用所設(shè)計的特異性引物擴(kuò)增出清晰的D-loop序列，說明兩者的親緣關(guān)系較近，可以作為斑點(diǎn)叉尾鮰區(qū)分于其他親緣關(guān)系較遠(yuǎn)物種的方法。

由圖2可知，采用通用引物，在以上幾個物種中均可以擴(kuò)增得到分子量大小相差不大的COⅠ片段，所以，僅用PCR擴(kuò)增COⅠ序列不能區(qū)分斑點(diǎn)叉尾鮰和其他物種，需進(jìn)一步測序鑒定。

2.3 測序及比對結(jié)果 測序得到斑點(diǎn)叉尾鮰的D-loop序列，經(jīng)過Blast，D-loop序列與NCBI數(shù)據(jù)庫已有的序列一致性達(dá)到98%(圖3)。

斑點(diǎn)叉尾鮰與革胡子鯰D-loop比對結(jié)果見圖4。經(jīng)過Blast，一致性為88%。

2.4 酶切鑒定結(jié)果 D-loop序列經(jīng)EcoRⅠ酶切和電泳檢測，結(jié)果見圖5。由圖5可知，斑點(diǎn)叉尾鮰的D-loop序列被酶切成2個片段，大的分子量為900 bp左右，小的分子量為200 bp左右，而革胡子鯰的D-loop序列沒有被切開。由此可知，不需測序能夠簡單地鑒定出斑點(diǎn)叉尾鮰物種。

3 討論

該研究采用自行設(shè)計的引物對斑點(diǎn)叉尾鮰及其他幾個物種的D-loop和COⅠ區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測序，經(jīng)比對發(fā)現(xiàn)不同物種之間的序列差異較大。建立的從斑點(diǎn)叉尾鮰肌肉組織中提取DNA的簡易方法能夠進(jìn)行PCR擴(kuò)增和序列分析，所測定的DNA序列正確無誤。這說明依據(jù)最小片斷的長度和序列設(shè)計的特異性PCR引物，在常規(guī)條件下很易擴(kuò)增所需的線粒體DNA片段，所設(shè)計的PCR引物具有物種特異性。因此在大批量的產(chǎn)品檢驗(yàn)中可以使用該引物進(jìn)行擴(kuò)增篩選，再根據(jù)D-loop和COⅠ序列的比對直接鑒定出斑點(diǎn)叉尾鮰。

為了進(jìn)一步區(qū)分其近似物種，該研究測定斑點(diǎn)叉尾鮰近似物種和不同種群線粒體DNA的D-loop的序列，確定斑點(diǎn)叉尾鮰物種特異性的最短DNA序列片斷，在此基礎(chǔ)上尋找其酶切位點(diǎn)，并進(jìn)行酶切鑒定。結(jié)果表明該方法建立的特異性酶切圖譜可以區(qū)分近似物種，在經(jīng)過相對少的酶切和電泳后，不需測序能夠?qū)唿c(diǎn)叉尾鮰與其他近似物種區(qū)分開來。

該研究采用線粒體DNA分子鑒定技術(shù)，在參閱國外斑點(diǎn)叉尾鮰線粒體DNA序列數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，通過進(jìn)一步探索和優(yōu)化，建立了斑點(diǎn)叉尾鮰物種的快速分子鑒定方法并研制出檢測試劑盒，目前該技術(shù)已應(yīng)用于水產(chǎn)品進(jìn)出口貿(mào)易過程中物種真?zhèn)螜z驗(yàn)鑒定的技術(shù)執(zhí)法工作。該研究成果為優(yōu)化和提高檢驗(yàn)檢疫執(zhí)法運(yùn)行效能提供了技術(shù)保障，為我國打破國外技術(shù)貿(mào)易壁壘、制定標(biāo)準(zhǔn)法規(guī)提供了技術(shù)支撐，同時也有助于我國水產(chǎn)品行業(yè)商業(yè)欺詐認(rèn)定裁決工作。

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