銨硝營(yíng)養(yǎng)對(duì)高粱根系細(xì)胞膜質(zhì)子泵的影響

魏天嬌, 周金泉, 張明超, 魏志軍, 朱毅勇

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，江蘇南京 210095)

銨硝營(yíng)養(yǎng)對(duì)高粱根系細(xì)胞膜質(zhì)子泵的影響

魏天嬌, 周金泉, 張明超, 魏志軍, 朱毅勇*

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，江蘇南京 210095)

高粱； 銨硝營(yíng)養(yǎng)； 細(xì)胞膜質(zhì)子泵； pH

銨和硝是作物吸收的兩種主要氮素形態(tài)[1]。在旱地土壤中，硝化作用強(qiáng)烈，銨態(tài)氮肥易轉(zhuǎn)化為硝酸鹽，因此大多數(shù)旱地作物以硝態(tài)氮的吸收為主[2]。但是在酸性與淹水土壤中，硝化作用受到抑制，因此在這些土壤上生長(zhǎng)的作物以銨態(tài)氮的吸收為主[3]。從植物營(yíng)養(yǎng)的角度來(lái)看，吸收銨態(tài)氮的過(guò)程不需要耗能，但是除了水稻等一些作物能在單一銨態(tài)氮營(yíng)養(yǎng)正常生長(zhǎng)外，大多數(shù)植物會(huì)發(fā)生銨中毒[4]。

銨中毒的原因很多，其中最明顯的一個(gè)原因就是大量吸收銨態(tài)氮后導(dǎo)致的根際強(qiáng)烈酸化[5,6,7]。研究表明，水稻在這種情況下能夠提高根系細(xì)胞膜質(zhì)子泵活性[8]，來(lái)維持膜電位。但是到目前為止，還不清楚這是植物在銨態(tài)氮營(yíng)養(yǎng)下的普遍生理反應(yīng)，還是水稻所特有的生理適應(yīng)能力。雖然在大麥根系中也發(fā)現(xiàn)，銨態(tài)氮營(yíng)養(yǎng)下質(zhì)子泵活性增強(qiáng)[9]，但是在該試驗(yàn)中沒(méi)有考慮根際pH值，因此還無(wú)法肯定究竟是銨還是pH所造成的結(jié)果。此外，研究也發(fā)現(xiàn)，硝態(tài)氮營(yíng)養(yǎng)下的玉米根系的細(xì)胞膜質(zhì)子泵活性也會(huì)受誘導(dǎo)而升高[10]。但是，由于類似的試驗(yàn)并沒(méi)有將所有因素均考慮在內(nèi)，并且在同一作物上進(jìn)行試驗(yàn)，因此，究竟哪種因素對(duì)質(zhì)子泵的影響更大，其可能的原因是什么？則到目前為止還缺少充分的研究數(shù)據(jù)。

植物細(xì)胞膜質(zhì)子泵通過(guò)水解ATP產(chǎn)生能量，將氫離子泵出細(xì)胞，因此又叫H+-ATPase，其作為細(xì)胞膜上的一級(jí)運(yùn)輸?shù)鞍?，不僅維持細(xì)胞質(zhì)pH的穩(wěn)定，而且還建立了細(xì)胞膜電位，并為各種養(yǎng)分物質(zhì)的運(yùn)輸提供質(zhì)子驅(qū)動(dòng)力[11]，在植物營(yíng)養(yǎng)生理中具有重要的意義。因此，本文選用高粱這種旱地作物，通過(guò)在銨硝營(yíng)養(yǎng)下培養(yǎng)并調(diào)控根際pH，然后分離細(xì)胞膜、測(cè)定質(zhì)子泵活性，進(jìn)一步探索植物根系細(xì)胞膜質(zhì)子泵對(duì)銨硝及根際pH的反應(yīng)，為研究植物的銨硝營(yíng)養(yǎng)機(jī)制提供更多借鑒。

1 材料與方法

1.1 高粱培養(yǎng)

將高粱分別用N 1 mmol/L，即0.5 mmol/L(NH4)2SO4和Ca(NO3)2作為氮源培養(yǎng)，不調(diào)節(jié)營(yíng)養(yǎng)液的 pH。每次更換營(yíng)養(yǎng)液后，間隔12 h測(cè)定pH，記錄4 d內(nèi)營(yíng)養(yǎng)液的pH變化。由于銨態(tài)氮營(yíng)養(yǎng)下，根際酸化，營(yíng)養(yǎng)液pH下降為3，而硝態(tài)氮營(yíng)養(yǎng)下，根際堿化，營(yíng)養(yǎng)液pH上升為7。因此，為了區(qū)分是銨、硝營(yíng)養(yǎng)，還是由于銨硝營(yíng)養(yǎng)下不同根際pH對(duì)質(zhì)子泵的影響，將另一組同樣處理下的高粱用pH 自動(dòng)調(diào)節(jié)設(shè)置(NPH-660 NDE，Nissin，Japan)把硝態(tài)氮營(yíng)養(yǎng)液的pH 值控制在3，而將銨態(tài)氮營(yíng)養(yǎng)液的pH控制在7，分別用0.1 mmol/L NaOH 或0.05 mmol/L H2SO4實(shí)時(shí)滴定來(lái)調(diào)節(jié)。

1.2 測(cè)定和分離方法

1.2.1 高粱根系細(xì)胞膜分離 根系細(xì)胞膜分離方法參照Yan等[12]的方法，略加修改。高粱培養(yǎng)到三周時(shí)，采集根系20 g左右，加入4倍體積預(yù)冷的研磨液，在冰浴中研磨，勻漿用4層紗布過(guò)濾后，11500×g下離心10 min，棄沉淀。上清液于87000×g下離心35 min,棄上清液，沉淀用6 mL緩沖液充分懸浮后，加入由右旋糖苷(DextranT500, Sigma)和聚乙二醇(PEG23350, Sigma)的水溶液組成的兩相分離系統(tǒng)并混勻。4℃、720×g下離心，每次離心結(jié)束將分為兩層的上相轉(zhuǎn)移到新的兩相系統(tǒng)中混勻，再依次離心23、15、10、5 min，將最后一次離心后從上相中收集到的膜蛋白用BTP緩沖液稀釋6倍至6倍以上，151200×g下離心40 min。收集到的膜蛋白用1～2 mL BTP緩沖液溶解后分裝，置于-80℃下保存。以上所有操作所用離心機(jī)為BECKMAN COUL-TER OptimaTML-80 XP，轉(zhuǎn)頭為SW32 Ti。

1.2.2 蛋白質(zhì)含量測(cè)定 用Bradford(G250)比色法測(cè)定蛋白質(zhì)含量[13]。

1.2.3 細(xì)胞膜H+-ATPase水解活性的測(cè)定 測(cè)定H+-ATPase水解活性參照Yan等[12]的方法。在相同條件下，以測(cè)定失活的膜蛋白為空白，根據(jù)單位時(shí)間內(nèi)每1 mg膜蛋白水解產(chǎn)生的無(wú)機(jī)磷作為活性單位。

通過(guò)采用不同的抑制劑測(cè)定后，我們得到純度在94%以上細(xì)胞膜，為了避免其他可能存在的生物膜上質(zhì)子泵的影響，本試驗(yàn)測(cè)定中均加入NaN3、NaNO3、Na2MoO4三種抑制劑。

1.2.4 細(xì)胞膜蛋白凝膠電泳和免疫印跡試驗(yàn) 用SDS-PAGE分離細(xì)胞膜蛋白，具體方法參照狄廷均等[14]，然后將分離后的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，經(jīng)TBST 20℃室溫封閉l h后加入一抗(日本名古屋大學(xué)木下俊則教授贈(zèng)送的植物細(xì)胞膜H+-ATPase多克隆抗體)孵育，再用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的IgG二抗(Sigma)孵育，最后用ECL試劑盒(KPL公司)檢測(cè)。

1.3 數(shù)據(jù)分析方法

所有數(shù)據(jù)采用SAS軟件中LSD(P<0. 05)進(jìn)行處理間雙重比較分析。數(shù)據(jù)均用3次獨(dú)立試驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(Mean±SE)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 銨、硝態(tài)氮營(yíng)養(yǎng)下高粱根系細(xì)胞膜上的H+-ATPase活性的比較

2.2 銨硝營(yíng)養(yǎng)下高粱根系細(xì)胞膜H+-ATPase的Vmax與Km比較

2.3 銨、硝態(tài)氮營(yíng)養(yǎng)下高粱根系細(xì)胞膜H+-ATPase蛋白濃度分析

為了研究細(xì)胞膜H+-ATPase活性差異產(chǎn)生的原因，本試驗(yàn)分析了其單位膜蛋白中H+-ATPase蛋白數(shù)量變化。不同處理下的根系細(xì)胞膜蛋白(15 μg)經(jīng)SDS PAGE凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)到PVDF膜上后與H+-ATPase的多克隆抗體發(fā)生反應(yīng)后可以看出(圖3)，銨態(tài)氮營(yíng)養(yǎng)下根際pH 3時(shí)，免疫印跡最深，而硝態(tài)氮營(yíng)養(yǎng)下根際pH 7時(shí)，免疫印跡最淺，硝態(tài)氮營(yíng)養(yǎng)pH 3時(shí)，質(zhì)子泵蛋白的濃度有所增加，而銨態(tài)氮營(yíng)養(yǎng)pH 7時(shí)質(zhì)子泵蛋白的濃度比 pH 3時(shí)有所減少。結(jié)合圖1、圖2的結(jié)果，說(shuō)明單位膜蛋白中質(zhì)子泵蛋白的濃度是決定其活性差異的主要原因。

3 討論

銨態(tài)氮營(yíng)養(yǎng)下根際pH降低到3，而硝態(tài)氮營(yíng)養(yǎng)下根際pH上升至7，在此條件下，銨態(tài)氮營(yíng)養(yǎng)下的高粱根系細(xì)胞膜H+-ATPase活性要顯著高于硝態(tài)氮營(yíng)養(yǎng)，這與我們前期研究水稻的結(jié)果類似[14]。但是，在硝態(tài)氮營(yíng)養(yǎng)下人為的將根際pH調(diào)至3，則細(xì)胞膜H+-ATPase活性比pH 7環(huán)境下要高(圖1)。由于硝態(tài)氮被根系細(xì)胞吸收后主要是運(yùn)輸?shù)降厣喜糠?，或是貯存在液泡中，即使在根系中被還原，其還原過(guò)程中并不產(chǎn)生H+[15-16]。因此可以推斷，在硝態(tài)氮營(yíng)養(yǎng)下，高粱根系細(xì)胞膜H+-ATPase活性升高完全是由于外界pH 降低導(dǎo)致的。這說(shuō)明根系細(xì)胞膜質(zhì)子泵具有適應(yīng)根際酸化的機(jī)制。

但是，在銨態(tài)氮營(yíng)養(yǎng)下，當(dāng)根際pH上調(diào)到7以后，細(xì)胞膜H+-ATPase活性降低了，這同樣說(shuō)明了細(xì)胞膜H+-ATPase是適應(yīng)銨態(tài)氮吸收后根際酸化導(dǎo)致了活性的變化。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是在pH 7還是pH 3的情況下，銨態(tài)氮處理的根系細(xì)胞膜H+-ATPase活性均比硝態(tài)氮處理要高 。這個(gè)結(jié)果說(shuō)明，一方面細(xì)胞膜H+-ATPase活性確實(shí)受到外界pH的影響而變化;另一方面也說(shuō)明在銨態(tài)氮營(yíng)養(yǎng)下，還存在其他的原因，導(dǎo)致高粱細(xì)胞膜H+-ATPase活性仍然要保持在一個(gè)相對(duì)較高的水平上。由于銨態(tài)氮吸收以后可以直接在細(xì)胞中同化為氨基酸，并產(chǎn)生H+，而細(xì)胞膜H+-ATPase的一個(gè)重要生理功能是將細(xì)胞中多余的H+排出體外，以維持細(xì)胞質(zhì)中的pH穩(wěn)定[17]。因此推斷，在銨態(tài)氮營(yíng)養(yǎng)下，高粱根系細(xì)胞內(nèi)部無(wú)法消耗掉銨同化產(chǎn)生的氫離子，因此需要通過(guò)提高質(zhì)子泵活性將多余的氫離子泵出細(xì)胞。

從生理生化的水平來(lái)看，酶活性高低的原因取決于兩方面:一是單位面積細(xì)胞膜上酶蛋白的數(shù)量差異;二是其同工酶的組成發(fā)生變化，當(dāng)然也可能是上述兩種情況同時(shí)發(fā)生[18]。通過(guò)在測(cè)定時(shí)用不同的pH環(huán)境研究H+-ATPase活性后發(fā)現(xiàn)，在銨態(tài)氮營(yíng)養(yǎng)下，其最高活性范圍在pH 6.0～6.2，而在硝態(tài)氮營(yíng)養(yǎng)下則上升為pH 6.0～6.4。這說(shuō)明，在銨硝營(yíng)養(yǎng)下，其同工酶的組成可能發(fā)生了變化。此外，酶動(dòng)力學(xué)的測(cè)定結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，銨態(tài)氮營(yíng)養(yǎng)pH 3環(huán)境下高粱根系細(xì)胞膜上H+-ATPase的Km值最低，這說(shuō)明H+-ATPase在這種情況下親和能力最強(qiáng)，但是在銨態(tài)氮營(yíng)養(yǎng)pH 7時(shí)，其親和性卻比硝態(tài)氮營(yíng)養(yǎng)下要低，這也說(shuō)明其同工酶的組成發(fā)生了變化，導(dǎo)致其親和能力發(fā)生了改變。由于細(xì)胞膜H+-ATPase是由一個(gè)多基因家族編碼的[19]，因此要具體分析哪些同工酶發(fā)生了變化還需要從分子生物學(xué)的水平上研究其同源基因的表達(dá)才能確認(rèn)，這還有待進(jìn)一步研究。

通過(guò)Western blot 的結(jié)果(圖3)發(fā)現(xiàn)，銨態(tài)氮營(yíng)養(yǎng)pH 3時(shí)，免疫印跡最深，而硝態(tài)氮營(yíng)養(yǎng)下根際pH 7時(shí)最淺，其他兩種處理的結(jié)果與上述H+-ATPase活性的變化一致，這說(shuō)明單位膜蛋白數(shù)量上，質(zhì)子泵酶蛋白數(shù)量的高低是決定其活性的主要原因。

4 結(jié)論

除了外界pH因素外，銨硝營(yíng)養(yǎng)本身也是影響高粱根系細(xì)胞膜質(zhì)子泵活性的一個(gè)重要原因，尤其是銨態(tài)氮營(yíng)養(yǎng)下，細(xì)胞膜質(zhì)子泵不僅要響應(yīng)根際低pH對(duì)其的影響，同時(shí)還要響應(yīng)細(xì)胞內(nèi)銨態(tài)氮同化產(chǎn)生的氫離子對(duì)其的影響。而水稻等耐銨作物似乎并沒(méi)有受到細(xì)胞內(nèi)銨態(tài)氮同化產(chǎn)生的氫離子對(duì)其的影響，其細(xì)胞中存在著調(diào)節(jié)pH的其他機(jī)制，因此只要外界pH相同時(shí)，銨或硝營(yíng)養(yǎng)下水稻根系細(xì)胞膜質(zhì)子泵活性之間沒(méi)有差異[8]。因此，這可能是喜硝作物高粱與喜銨作物之間的一個(gè)重要的差別，是不同作物根系細(xì)胞膜質(zhì)子泵對(duì)銨態(tài)氮營(yíng)養(yǎng)的不同響應(yīng)機(jī)制，其中還涉及到質(zhì)子泵同工酶的變化，相關(guān)的研究有待進(jìn)一步從分子水平上進(jìn)行分析。

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WEI Tian-jiao, ZHOU Jin-quan, ZHANG Ming-chao, WEI Zhi-jun，ZHU Yi-yong*

(CollegeofResoursesandEnvironmentalSciences,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210095,China)

sorghum; ammonium and nitrate; plasma membrane H+-ATPase; pH

2014-06-20 接受日期: 2014-11-03 網(wǎng)絡(luò)出版日期: 2015-05-21

國(guó)家自然科學(xué)基金(31172035)；教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才項(xiàng)目(NCET-11-0672)；國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃(201410307023)資助。

魏天嬌(1992—)，女，吉林公主嶺人，碩士研究生，主要從事植物營(yíng)養(yǎng)生理與土壤微生物方面的研究。 E-mail: 2012103158@njau.edu.cn。 *通信作者E-mail: yiyong1973@njau.edu.cn

Q945.12

A

1008-505X(2015)05-1178-06