PCR技術(shù)在結(jié)核病診斷中的價值

卞永娟136000吉林省四平市結(jié)核病醫(yī)院檢驗科

PCR技術(shù)在結(jié)核病診斷中的價值

卞永娟
136000吉林省四平市結(jié)核病醫(yī)院檢驗科

目的：探討PCR技術(shù)在結(jié)核病診斷中的價值。方法：收治結(jié)核病患者282例，分析其臨床資料，同時與濃縮集菌涂片法進(jìn)行對比。結(jié)果：PCR法的陽性率明顯高于濃縮集菌涂片法（χ2=12.397，P＜0.05）。檢測中發(fā)現(xiàn)，濃縮集菌陽性的標(biāo)本，PCR法也均為陽性，敏感度100％。結(jié)論：PCR技術(shù)在結(jié)核病診斷中具有重要的價值。

結(jié)核??；PCR技術(shù)；診斷

結(jié)核病是世界范圍內(nèi)日益嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題之一，是由結(jié)核分枝桿菌所致的以呼吸系統(tǒng)感染為主的慢性傳染病，發(fā)病率與致死率均較高。該病可累及全身各個系統(tǒng)，臨床表現(xiàn)多種多樣，尤其是肺外結(jié)核往往十分隱匿，給臨床診斷帶來極大的困難。實驗室檢測是結(jié)核病診斷、治療及預(yù)防控制的重要依據(jù)，是消滅結(jié)核病傳染源、切斷傳播途徑、控制流行的重要環(huán)節(jié)［1-5］?，F(xiàn)對我院2014年1月-2015年3月住院確診的結(jié)核病患者282例的臨床資料進(jìn)行統(tǒng)計分析，同時與濃縮集菌涂片法進(jìn)行對比，探討PCR技術(shù)在結(jié)核病診斷中的臨床價值。

資料與方法

2014年1月-2015年3月收治結(jié)核病患者282例，男155例，女127例，年齡12～86歲，平均（35.4±6.5）歲。結(jié)核病診斷標(biāo)準(zhǔn)：肺結(jié)核的診斷符合中華醫(yī)學(xué)會結(jié)核病學(xué)分會制定的《結(jié)核病診斷指南》中肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)。肺外結(jié)核：①有肺結(jié)核慢性中毒癥狀，如發(fā)熱、盜汗、消瘦等；②PPD實驗強(qiáng)陽性或血抗結(jié)核抗體≥2項陽性；③痰結(jié)核桿菌培養(yǎng)陽性；④影像學(xué)檢查具有符合結(jié)核病的特征；⑤診斷性試驗抗結(jié)核治療有效。取患者的臨床標(biāo)本進(jìn)行檢測，其中痰液240例，胸腹水26例，腦脊液16例。

方法：濃縮集菌涂片法先集菌后檢查，可提高檢出率。腦脊液和胸、腹水無雜菌，可直接離心沉淀集菌。處理后的材料再離心沉淀。取沉淀物做涂片染色鏡檢。應(yīng)用PCR法檢測標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌的方法可分2個步驟：結(jié)核分枝桿菌DNA的提取、PCR擴(kuò)增和擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測。①標(biāo)本DNA的提?。簶?biāo)本加2～3倍體積的4％NaOH液化、離心、沉淀，加入50μL DNA提取液，煮沸10 min，離心5min，取上清液5μL待用。②PCR擴(kuò)增和擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測：Tap酶0.5μL加15.5μL反應(yīng)液充分混勻后加石蠟油20μL封頂，再加入4μL標(biāo)本DNA提取液，離心后在擴(kuò)增儀中擴(kuò)增，93℃45 s，55℃45 s，72℃1min，持續(xù)35個循環(huán)，然后72℃5min。之后將上清液5μL加入擴(kuò)增后的反應(yīng)管中，充分混勻后取下層藍(lán)色液體15μL。電泳25min后在紫外檢測儀上觀察。若在227 bp處顯現(xiàn)橙黃色色帶，提示結(jié)核桿菌陽性。

統(tǒng)計學(xué)處理：采用SPSS 16.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計量資料比較采用t檢驗，計數(shù)資料以％表示，比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

用PCR法對282例臨床標(biāo)本中的結(jié)核桿菌進(jìn)行快速檢測，同時與濃縮集菌涂片法結(jié)果進(jìn)行比較，PCR法的陽性率明顯高于濃縮集菌涂片法（χ2=12.397，P＜0.05）。檢測中發(fā)現(xiàn)，濃縮集菌陽性的標(biāo)本，PCR法也均為陽性，敏感度100％。見表1。

討論

結(jié)核病是嚴(yán)重危害人們健康的傳染病之一，涂片法和改良羅氏培養(yǎng)法一直以來是傳統(tǒng)檢測方法，但涂片法特異性差、陽性率低、敏感性低。培養(yǎng)法所需時間長，一般需要3～8周，且感染者早期不易檢出病菌，嚴(yán)重影響疾病的正確診斷［6］。PCR是一種體外酶促擴(kuò)增特異DNA片段技術(shù)，是以目的基因為模板，利用針對目的基因所設(shè)計的一對特異寡核苷酸引物進(jìn)行的DNA體外合成反應(yīng)。PCR技術(shù)在結(jié)核病細(xì)菌學(xué)診斷上的敏感、快速的特點在多數(shù)報道中得到了肯定［7-9］。本組試驗也充分表明，PCR法的陽性率明顯高于濃縮集菌涂片法。檢測中同時發(fā)現(xiàn)，濃縮集菌陽性的標(biāo)本，PCR法也均為陽性，敏感度100％。目前，在經(jīng)典PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上，各種新的適用于不同目的的PCR方法不斷出現(xiàn)，已經(jīng)發(fā)展了多種適用于各種場合和需求的PCR方法。依據(jù)MTB重復(fù)序列、蛋白質(zhì)編碼基因或rRNA基因設(shè)計的特異引物，通過PCR技術(shù)可從多種臨床標(biāo)本（如胸腔積液、腦脊液）中檢測出結(jié)核分枝桿菌DNA。且PCR擴(kuò)增的拷貝數(shù)越多，靈敏度就越高。因此，可檢測1～100 fg純化的結(jié)核分枝桿菌DNA，相當(dāng)于1～20個結(jié)核分枝桿菌，而且用時只需1～2 d。與傳統(tǒng)方法相比，如常規(guī)抗酸染色，每1mL痰液需含5 000個以上菌才能檢出，且非結(jié)核分枝桿菌或其他細(xì)菌、孢子等抗酸染色亦為陽性。培養(yǎng)法需3～8周，而且必須是活菌。由此可見，PCR檢測的陽性率明顯高于常規(guī)細(xì)菌學(xué)方法。即使在試管內(nèi)難以生長的少量菌，甚至死菌釋放的未降解的DNA也能檢測出來。這對于培養(yǎng)及涂片均為陰性的結(jié)核病患者的早期診斷與鑒別診斷，以及化療后排菌情況的觀察是很有益的。

Value of tuberculosis laboratory PCR in the diagnosis of tuberculosis

Bian Yongjuan
DepartmentofLaboratory ofTuberculosis Hospital in Siping City,Jilin Province 136000

Objective：To discuss the value of PCR in the diagnosis of tuberculosis.Methods：282 patientswith tuberculosiswere selected.We analyzed the clinical data and compared the concentration of smear technique.Results：The positive rate of PCR was significantly higher than that of condensingmethod（χ2=12.397，P＜0.05）.In the detection,condensing bacteria samples were positive,PCRwere positive,and the sensitivitywas100％.Conclusion：PCR playsan important role in the diagnosisof tuberculosis. Key words Tuberculosis；PCR technology；Diagnosis

10.3969/j.issn.1007-614x.2015.24.77